一種免疫細(xì)胞凍存液及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞凍存領(lǐng)域，特別是免疫細(xì)胞凍存領(lǐng)域，尤其涉及一種免疫細(xì)胞凍 存液及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞冷凍技術(shù)作為一種保存細(xì)胞的有效方法在生物學(xué)領(lǐng)域已有深入廣泛的應(yīng)用。 對供體的免疫細(xì)胞深低溫保存可保持其活力和功能，無論對臨床還是基礎(chǔ)研究均具有重要 意義，尤其是免疫細(xì)胞用于回顧性研究時更為重要。冷凍保存免疫細(xì)胞不僅可以解決現(xiàn)有 免疫細(xì)胞誘導(dǎo)時間較長，需要多次誘導(dǎo)和患者多次采血的問題，還可以把人健康狀態(tài)最好 或戰(zhàn)斗力最強時期的免疫細(xì)胞保存下來，用于腫瘤治療以及抗衰老保健治療。
[0003] 正常情況下，液體凍結(jié)時會造成細(xì)胞損傷，其中，一種情況是由于不適當(dāng)?shù)慕禍睾?復(fù)溫導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)形成冰晶和重結(jié)晶；另一種情況是由于冷凍使得電解質(zhì)和溶質(zhì)濃度升高所 導(dǎo)致的溶質(zhì)損傷。通常，免疫細(xì)胞在_70°C~_80°C凍存，細(xì)胞活性會隨著冷凍時間的延長迅 速下降，在-196Γ時細(xì)胞生物學(xué)過程幾乎停止，因此要長期保存免疫細(xì)胞，液氮溫度是最佳 的儲存溫度。選擇合適的冷凍保護(hù)劑可以避免細(xì)胞在冷凍時細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，保護(hù)細(xì)胞 膜和細(xì)胞器免受損傷。
[0004] 細(xì)胞凍存經(jīng)常采用滲透性保護(hù)劑，例如甘油和二甲基亞砜(DMSO)兩種，而甘油作 為冷凍保護(hù)劑凍存的免疫細(xì)胞存活率較低，但DMSO卻可以迅速透入細(xì)胞，提高細(xì)胞膜對水 的通透性，使水分在細(xì)胞凍結(jié)前透出細(xì)胞外形成冰晶，成為免疫細(xì)胞凍存最理想的冷凍保 護(hù)劑。
[0005] 目前國內(nèi)凍存方法多采用的是DMS0、動物血清和細(xì)胞培養(yǎng)液按不同比例搭配成的 凍存液，例如CN102301992A公開的用于凍存單個核細(xì)胞的凍存液，其包含血漿和二甲基亞 砜，但不僅限于此，還可以包含動物血清和培養(yǎng)基等成分。采用該凍存液的優(yōu)點是細(xì)胞保存 時間長，然而該凍存液中含有的動物血清引入了外源蛋白，同時增加了動物病原污染的可 能性，會對人體過繼免疫治療產(chǎn)生一定影響。目前也有一些采用凍存液中不含動物血清的 文獻(xiàn)，例如，CN104026118A公開的免疫細(xì)胞凍存液，其包含二甲基亞砜、人供體血漿和免疫 細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基。采用該冷凍液的優(yōu)點在于不會引入外源蛋白，降低了動物病原污染的可 能性，然而該冷凍液凍存細(xì)胞的存活率以及細(xì)胞活性仍較低。
[0006] 因此，尋找一種如何保持細(xì)胞高活性并可實現(xiàn)長期存儲、即時復(fù)蘇的免疫細(xì)胞凍 存液及凍存方法是目前亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種免疫細(xì)胞凍存液及其應(yīng)用，特別提供了一種用于免疫 細(xì)胞長期保存，并能夠在復(fù)蘇后保持其細(xì)胞特性的凍存液及其應(yīng)用。
[0008] 為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0009] 在第一方面，本發(fā)明提供了一種免疫細(xì)胞凍存液，其包括以下組分：重組人白介 素-2、聚乙二醇、I，2-丙二醇，以及基礎(chǔ)培養(yǎng)基或注射用氯化鈉。
[0010] 通常，外周血的T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞膜表面均存在白介素-2 (IL-2)受體，IL-2與 其受體結(jié)合后可以調(diào)節(jié)該細(xì)胞的增生，調(diào)節(jié)免疫球蛋白的生成;促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞 的增殖、分化并能提高NK細(xì)胞的殺傷活性。然而，目前主要是將IL-2作為體外刺激培養(yǎng)物用 于免疫細(xì)胞的擴增培養(yǎng)，而本發(fā)明采用將重組人白介素-2(IL-2)添加到免疫細(xì)胞凍存液 中，可大幅度提高所述免疫細(xì)胞的活性穩(wěn)定性，使其保持原有細(xì)胞高活性，從而使免疫細(xì)胞 很好地保持了細(xì)胞復(fù)蘇后的生理功能和生物學(xué)特性，可有效解決細(xì)胞復(fù)蘇后直接應(yīng)用和進(jìn) 一步擴展的關(guān)鍵問題。
[0011] 本發(fā)明在免疫細(xì)胞凍存液中添加聚乙二醇和1，2_丙二醇，可以替代現(xiàn)用的二甲基 亞砜(DMSO)為基礎(chǔ)的凍存液，有效降低其對細(xì)胞毒性，維持細(xì)胞穩(wěn)定性，提高復(fù)蘇后直接應(yīng) 用的安全性，適合用于細(xì)胞凍存復(fù)蘇后直接應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液并不排除其它成分的存在，比如生理鹽水等，然而，本發(fā) 明的免疫細(xì)胞凍存液不含有DMSO等應(yīng)用過程存在安全風(fēng)險的物質(zhì)。
[0013] 本發(fā)明中，所述免疫細(xì)胞凍存液包括:重組人白介素-250-200U/mL;聚乙二醇0. Ιο . 4g/mL; 1 ， 2-丙二醇 0 . 2-0 . 4g/mL; 基礎(chǔ)培養(yǎng)基或注射用氯化鈉 90-99 體積 ％ ，總量為 100%〇
[0014]本發(fā)明所述免疫細(xì)胞凍存液中的重組人白介素-2的含量為50-200U/mL，例如可以 是50U/mL、60U/mL、80U/mL、IOOU/mL、120U/mL、150U/mL、1600U/mL、180U/mL、200U/mL。
[0015]本發(fā)明所述免疫細(xì)胞凍存液中的聚乙二醇含量為〇. 1-0.4g/mL，例如可以是0. lg/ mL、0·12g/mL、0·15g/mL、0·2g/mL、0·22g/mL、0·25g/mL、0·3g/mL、0·32g/mL、0·35g/mL、 0·38g/mL、0·4g/mL。
[0016] 本發(fā)明所述免疫細(xì)胞凍存液中的I，2-丙二醇含量為0.2-0.4g/mL，例如可以是 0·2g/mL、0·22g/mL、0·25g/mL、0·3g/mL、0·32g/mL、0·35g/mL、0·38g/mL、0·4g/mL。
[0017] 本發(fā)明所述免疫細(xì)胞凍存液中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基或注射用氯化鈉的體積百分含量為 90%、90·5%、91%、91·5%、92%、92·5%、93%、93·5%、94%、94·5%、95%、95·5%、96%、 96.5 %、97 %、97.5 %、98 %、98.5 %、99 %。如果在免疫細(xì)胞凍存液中還含有除重組人白介 素-2、聚乙二醇、1，2_丙二醇組分以外的其它組分時，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基或注射用氯化鈉的含 量會進(jìn)行適當(dāng)?shù)南抡{(diào)，比如降低為80%-95%，例如所述基礎(chǔ)培養(yǎng)的含量還可以是80%、 80.5%、81%、81.5%、82%、82.5%、83%、83.5%、84%、84.5%、85%、85.5%、86%、 86.5%、87%、87.5%、88%、88.5%、89%、89.5%，以滿足所述免疫細(xì)胞凍存液中各組分含 量之和為100%。
[0018]本發(fā)明所述免疫細(xì)胞凍存液中的重組人白介素_2、聚乙二醇、1，2_丙二醇，以及基 礎(chǔ)培養(yǎng)基或注射用氯化鈉可以采用上述各組分所選擇的含量進(jìn)行任意配合，各組分的體積 百分含量之和為100%。
[0019] 優(yōu)選地，所述免疫細(xì)胞凍存液包括：重組人白介素-280-180U/mL;聚乙二醇0.2_ 0 · 4g/mL; 1，2-丙二醇0 · 25-0 · 4g/mL;基礎(chǔ)培養(yǎng)基或注射用氯化鈉95-99體積％。
[0020] 本發(fā)明所述免疫細(xì)胞凍存液中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI-1640培養(yǎng)基（THERM0-HyClone)或淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基[GT551/GT561 (TAKARA)、TBD-DCNK1640(天津灝陽）、X-VIV0?15 (LONZA)]〇
[0021] 優(yōu)選地，所述淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基為X-VIVOtmI5(L0NZA)，其均可購自日本LONZA公司。 [0022]本發(fā)明所述免疫細(xì)胞凍存液中不含有DMS0,因此不會引入外源蛋白，降低了動物 病原污染的可能性，也不會對人體過繼免疫治療產(chǎn)生影響。
[0023]本發(fā)明中所述免疫細(xì)胞凍存液還含有血清替代物，其適用于采用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的情況。例如，所述免疫細(xì)胞凍存液還含有Ultroser G(購自PALL)、自體血 漿或胎牛血清中的任意一種。
[0024] 優(yōu)選地，所述Ultroser G的含量為0 · 2-1 · 8g/mL，例如可以是0 · 2g/mL、0 · 5g/mL、 0·6g/mL、0·8g/mL、Ig/mL、I·2g/mL、I·3g/mL、I·5g/mL、I·6g/mL、I·8g/mL 〇
[0025] 優(yōu)選地，所述自體血漿的含量為10-90體積％。
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