一種家畜精液冷凍稀釋液的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動(dòng)物生殖生理與繁殖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種家畜精液冷凍稀釋液。
【背景技術(shù)】
[0002] 盡管家畜精液冷凍保存研究已經(jīng)開展了 5 0多年，但是解凍后的精液活力僅在 30%_50%左右，人工授精后不返情率和產(chǎn)仔率均顯著低于新鮮精液。家畜精液冷凍過程 中，細(xì)胞內(nèi)外形成的冰晶對(duì)動(dòng)物精子造成的機(jī)械損傷直接導(dǎo)致冷凍后精子活力的下降，如 何降低冰晶的產(chǎn)生對(duì)家畜精子的損傷一直是家畜繁殖技術(shù)和低溫生物學(xué)研究領(lǐng)域的研究 熱點(diǎn)，通過改變精液稀釋液的組成成分可以降低冷凍對(duì)精子的損傷，目前，滲透性有機(jī)溶劑 和糖類已經(jīng)應(yīng)用于哺乳動(dòng)物精液的冷凍保存研究中，但是有機(jī)溶劑和糖類并不能完全解決 細(xì)胞內(nèi)外冰晶對(duì)精子造成機(jī)械損傷的問題。
[0003] 1969年,DeVries和Wohlschlag發(fā)現(xiàn)了一種新型的冰晶抑制劑--抗凍蛋白。抗凍 蛋白通過修飾冰晶性狀和抑制重結(jié)晶等作用方式來減少冰晶對(duì)組織細(xì)胞的機(jī)械損傷。一些 研究表明，抗凍蛋白能提高人類和一些哺乳動(dòng)物精液冷凍保存后的存活率。然而，抗凍蛋白 的應(yīng)用也存在一定的局限性。首先，作為一種異源蛋白，抗凍蛋白可能導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)生一定的 免疫反應(yīng);其次，目前抗凍蛋白的主要來源是從極地海洋魚類的血液中提取，而且這些技術(shù) 和專利主要掌握在歐美國(guó)家手中，價(jià)格高昂；最后，抗凍蛋白是通過改變冰晶形狀來抑制冰 晶形成，這導(dǎo)致一些尖銳針狀冰晶的形成，從而加重冷凍對(duì)精子的機(jī)械損傷。目前對(duì)于抗凍 蛋白是否能提高冷凍精子質(zhì)量仍然存在一定的爭(zhēng)議。
[0004] 開發(fā)更多來源廣泛、安全可靠的冰晶抑制劑，是提高精液冷凍技術(shù)在畜牧行業(yè)推 廣的關(guān)鍵，可以讓優(yōu)秀公畜的基因快速擴(kuò)群，改良品種，提高飼養(yǎng)效率。
[0005]聚乙烯醇是一種高分子有機(jī)化合物，醫(yī)藥級(jí)的聚乙烯醇對(duì)人體無毒無副作用，被 作為乳化劑和成膜劑廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域。中國(guó)專利《一種豬精液稀釋劑》專利 號(hào):201310478237.6中公布了將聚乙烯醇應(yīng)用于豬精液的常溫稀釋保存，中國(guó)專利《豬精液 的低溫保護(hù)劑》專利號(hào)：201210196733.8中公布了將聚乙烯醇應(yīng)用于豬精液的0-4 °C低溫稀 釋保存。精液在常溫或〇_4°C低溫保存時(shí)，主要是通過抑制精子活動(dòng)而減少其能量損耗，使 精子在靜止?fàn)顟B(tài)下還能保持授精能力，在1-7天內(nèi)使用，擴(kuò)大了優(yōu)秀公畜精液的使用范圍， 在這些技術(shù)中使用聚乙烯醇，主要是作為成膜劑保護(hù)精子細(xì)胞膜活性，同時(shí)可以降低精子 的沉降速度，在常溫稀釋保存和〇_4°C低溫稀釋保存時(shí)發(fā)揮了保護(hù)精子細(xì)胞的作用，但是還 未見有研究報(bào)道將聚乙烯醇作為冰晶抑制劑用于精子的冷凍稀釋保存。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)非滲透性高分子聚合物聚乙烯醇具有與抗凍蛋 白類似的抑制冰晶再形成的功效，可以代替抗凍蛋白應(yīng)用于家畜精液的冷凍保存，從而避 免了與抗凍蛋白應(yīng)用有關(guān)的缺陷，相關(guān)的研究未見文獻(xiàn)報(bào)道。
[0007] 本發(fā)明的家畜精液冷凍稀釋液，每100mL包括如下組分： 三羥甲基氨基甲烷 2:,ng 檸檬酸 1.? 單糖 1.0 g 新鮮蛋黃 5-2:0ml
[0008] 滲透性保護(hù)劑 0-IQml 青霉素 1.0:萬.IU 鏈霉素 10:萬Π :] 聚乙烯醇 0.05-? 余量為超纟屯水。.
[0009] 優(yōu)選地，所述聚乙烯醇分子量為9KD。
[0010] 優(yōu)選地，所述單糖為葡萄糖、果糖、甘露醇、山梨醇、半乳糖或木糖醇。
[0011] 優(yōu)選地，所述滲透性保護(hù)劑為甘油。
[0012] 本發(fā)明的家畜精液冷凍稀釋液的制備方法，其步驟是，分別稱取三羥甲基氨基甲 烷2.71g、檸檬酸1.4g、單糖l.Og、滲透性保護(hù)劑O-IOmU青霉素10萬IU，鏈霉素10萬IU，聚乙 烯醇0.05-5g，溶于超純水中，攪拌均勻，調(diào)整pH值至6.8-7.2，使用前加入56°C30min滅活處 理的新鮮蛋黃5-20ml，混合均勻后定容至100ml，于4°C下15000轉(zhuǎn)/分的速率離心1小時(shí)，取 上清液用〇. 45μηι-次性濾器過濾備用。
[0013] 本發(fā)明的家畜精液冷凍稀釋液可以對(duì)家畜精液進(jìn)行一步法冷凍保存，其步驟是， 將家畜精液和本發(fā)明的家畜精液冷凍稀釋液按照1:4-1:10的比例混合均勻，而后分裝于 0.25ml塑料細(xì)管內(nèi)，先緩慢降溫至5°C，而后迅速移入液氮?dú)庀嘀醒?min，最后將細(xì)管投 入液氮冷凍保存。
[0014] 本發(fā)明的家畜精液冷凍稀釋液還可以對(duì)家畜精液進(jìn)行兩步法冷凍保存，其步驟 是，將家畜精液和不含滲透性保護(hù)劑的冷凍稀釋液按照1:4的比例混合均勻，而后分裝于 2ml凍存管內(nèi)，先緩慢降溫至5°C，而后將上述懸浮液和本發(fā)明所述家畜精液冷凍稀釋液按 照1:1的比例混合均勻，于5°C下進(jìn)一步平衡l-3h，用移液器吸取0.2ml滴于干冰預(yù)凍，最后 將冷凍顆粒投入液氮冷凍保存。
[0015] 本發(fā)明的兩步法冷凍保存方法中所述不含滲透性保護(hù)劑的冷凍稀釋液，其制備方 法為，分別稱取三羥甲基氨基甲烷2.71g、檸檬酸1.4g、單糖l.Og、青霉素10萬IU、鏈霉素10 萬IU、聚乙烯醇0.05-5g，溶于超純水，攪拌均勻，使用前加入56°C30min滅活處理的新鮮蛋 黃5-20ml，混合均勻后定容至100ml，于4°C下15000轉(zhuǎn)/分的速率離心1小時(shí)，取上清液用 0.45μπι-次性濾器過濾備用。
[0016] 對(duì)于山羊精液的冷凍保存而言，為了清除精漿中磷酸酯酶A與蛋黃相互作用對(duì)精 子存活的不利影響，將精液和清洗液按照1:10的比例混合，600g離心15min，取上清，重復(fù)洗 滌精子沉淀一次，其余操作步驟同綿羊。
[0017] 本發(fā)明的冷凍保存方法中所述山羊精液冷凍所需清洗液，其制備方法為，分別稱 取三羥甲基氨基甲烷2.71g、檸檬酸1.4g、單糖l.Og、青霉素10萬IU、鏈霉素10萬IU、聚乙烯 醇0.05_5g，用超純水定容至100mL，用0.22μL?-次性濾器過濾。
[0018] 本發(fā)明中用來進(jìn)行冷凍保存的家畜精液品質(zhì)為:活力大于75%，畸形率小于10%， 精子密度高于IX IO9Ail。
[0019] 本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述三羥甲基氨基甲烷為緩沖物質(zhì)，檸檬酸為溶質(zhì)，可能也 參與糖酵解作用，所述單糖為精子代謝底物，所述蛋黃為低溫休克質(zhì)膜保護(hù)劑，所述甘油為 滲透性保護(hù)劑，所述青霉素和鏈霉素為抗生素，所述聚乙烯醇為冰晶抑制劑。我們的研究表 明，盡管分子結(jié)構(gòu)不同于抗凍蛋白，但是聚乙烯醇具有明顯的抑制解凍后冰晶再形成的作 用，從而降低了冰晶對(duì)精子細(xì)胞的二次損傷，此外，聚乙烯醇抑制冰晶形成的能力要高于其 他高分子聚合物，如葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮等。
[0020] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0021] 1.首次將聚乙烯醇作為冰晶抑制劑成功應(yīng)用于家畜精液冷凍保存:本發(fā)明針對(duì)目 前家畜精液冷凍保存研究中存在的主要問題，首次將常見的高分子聚合物--聚乙烯醇作 為冰晶抑制劑代替天然的抗凍蛋白應(yīng)用于家畜精液的冷凍保存研究中。聚乙烯醇能有效抑 制冷凍精液解凍過程中冰晶的形成，減少冰晶對(duì)精子的機(jī)械性損傷，改善家畜冷凍精液的 質(zhì)量，提高人工授精不返情率。大量實(shí)驗(yàn)表明，通過應(yīng)用本發(fā)明的家畜精液冷凍稀釋液冷凍 保存的家畜精液，解凍后精子的活率在75%左右，活力在50%以上，頂體完整性在65%以 上，質(zhì)膜完整性在50 %左右，人工授精后不返情率達(dá)到70 %以上。
[0022] 2.安全可靠、成本低廉:本發(fā)明中使用的聚乙烯醇是一類常見的化學(xué)原料，來源廣 泛、成本低廉、純度有保證、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定