規(guī)整球形，尺寸均一，表面光滑無孔。通過動態(tài)光散射(DLS)對納米粒粒徑大小以及分散性進(jìn)行測量。制備的As2O3-PLGA/PLC NPs粒徑較小，在?200 nm，分布均勻，分散系數(shù)(PDI)為0.197 ± 0.008。
[0041]將圖4放大后，從圖5可以明顯看出，納米粒表面被一層PLC薄膜包裹，結(jié)果與紅外譜圖相一致。經(jīng)檢測As203-PLGA/PLC NPs表面帶正電荷(+28.9 土 0.3) mV，進(jìn)一步印證了PLC表面包裹。
[0042]3、包封率和載藥量
As2O3的標(biāo)準(zhǔn)曲線使用原子熒光光譜儀(AFS)進(jìn)行測定，繪制As2O3的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖6所示。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為:Y=8.87821Χ+35.3255，R2=0.997461。其中Y表示熒光強(qiáng)度，X表示As2O3的質(zhì)量濃度(ng/mL)。經(jīng)計(jì)算，As203-PLGA/PLC NPs包封率為91.68%土1.42%，載藥量為72.0 ± 1.24%ο
[0043](1)As203-PLGA/PLC NPs體外控制釋放圖7為As2O3在As203-PLGA/PLC NPs中的體外緩釋曲線，可以看出，As203-PLGA/PLC NPs可在體外持續(xù)釋放藥物15天，藥物累計(jì)釋放率達(dá)72.83%，可實(shí)現(xiàn)藥物的控制釋放。
[0044]三、As203-PLGA/PLCNPs的抗肝腫瘤性能:
為了評估As203-PLGA/PLC NPs的抗肝腫瘤性能，分別考察了納米粒體內(nèi)、體外抗腫瘤作用。
[0045]1、體外抗腫瘤性能
采用As2O3、As203-PLGA/PLC NPs和As203-PLGA/PLC NPs 空球分別對SMMC-7721肝癌細(xì)胞的抑制作用，結(jié)果如圖8、9、10所示。
[0046]從圖8可見:As2O3可以抑制SMMC-7721細(xì)胞的生長，隨時(shí)間的延長及藥物濃度的增大，抑制效果增強(qiáng)，作用72h后藥物的半抑制濃度(IC5q)為0.96 土 0.033此As203/ml。
[0047]從圖9中可以看出，As203-PLGA/PLCNPs對SMMC-7721細(xì)胞具有明顯的抑制作用，隨時(shí)間的延長及藥物濃度的增大，抑制效果增強(qiáng)，作用72h后藥物的半抑制濃度(IC5q)為0.47土 0.017yg AS2O3/111L，低于AS2O3溶液的IC5Q，說明納米粒對肝癌細(xì)胞的生長有著更強(qiáng)的抑制作用。
[0048]從圖10可見:當(dāng)PLGA/PLC NPs空球與細(xì)胞共同培養(yǎng)72 h后，細(xì)胞存活率高于85%，說明載體本身無細(xì)胞毒性作用。
[0049]2、體內(nèi)抗腫瘤性能
以HEPG-2細(xì)胞注射雄性Bale/c裸鼠腋區(qū)皮下建立動物腫瘤模型，考察As203-PLGA/PLCNPs體內(nèi)抗腫瘤性能。圖11為接受不同藥物治療后小鼠腫瘤體積變化曲線，在一個(gè)試驗(yàn)周期結(jié)束后，As203-PLGA/PLC NPs組小鼠腫瘤體積為1.602±0.524 mm3，遠(yuǎn)低于生理鹽水(NS)模型組(2.262 ± 0.546 mm3)，對腫瘤抑制率達(dá)34.19%。
[0050]除此之外，我們在整個(gè)治療周期結(jié)束后通過組織病理學(xué)對處死后獲得的瘤組織進(jìn)行檢測進(jìn)一步評價(jià)藥物傳輸系統(tǒng)對腫瘤抑制作用的影響。
[0051]圖12、13、14分別為接受不同藥物治療后(A:NS; BiAs2O3; C: As203_PLGA/PLCNPs)腫瘤病理學(xué)檢測(HE染色)照片。
[0052]空白對照組腫瘤細(xì)胞異型性明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞大，胞漿較豐富，多邊形，細(xì)胞核大、深染、核分裂像易見。腫瘤細(xì)胞彌散分布，腫瘤細(xì)胞壞死略占腫瘤組織2/4左右，多數(shù)壞死為凝固性壞死，即腫瘤細(xì)胞壞死，細(xì)胞核消失，但細(xì)胞輪廓存留，間質(zhì)有少量血管，無明顯出血。腫瘤組織與壞死部分交界處可見少量炎細(xì)胞浸潤。As2O3及As203-PLGA/PLC NPs治療組腫瘤細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本同空白對照組，但邊緣部腫瘤細(xì)胞排列呈條索狀，但是As2O3-PLGA/PLC NPs治療組腫瘤壞死程度輕于空白對照組及As2O3對照組，說明經(jīng)As203-PLGA/PLC NPs治療后腫瘤增長速度變慢，惡性程度降低。這些表現(xiàn)表明治療組對腫瘤細(xì)胞起到了較好的抑制作用。
[0053]為了進(jìn)一步驗(yàn)證As203-PLGA/PLC NPs的肝腫瘤靶向性能，對實(shí)驗(yàn)小鼠處死后腎臟器官的病理組織進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖15、16、17所示?？瞻讓φ战M中:腎臟由皮質(zhì)，髓質(zhì)和腎乳頭組成，各部位結(jié)構(gòu)清晰，腎小球無萎縮或增大，球囊腔清晰，腎小管上皮細(xì)胞中度水腫變性，主要表現(xiàn)為細(xì)胞增大、胞漿疏松淡染，細(xì)胞輪廓欠清，腔緣不整齊。管腔內(nèi)未見管型，有脫離的顆粒樣物。對于As2O3和As203-PLGA/PLC NPs治療組，腎組織結(jié)構(gòu)及變性細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變?nèi)缈瞻讓φ战M，但是As2O3組中腎小管上皮細(xì)胞重度水腫變性，而As2O3-PLGA/PLC NPs組中腎小管上皮細(xì)胞輕度水腫變性。由此可說明，As203-PLGA/PLC NPs對肝腫瘤細(xì)胞有一定的靶向性，減少在腎臟組織的積累，降低藥物對腎臟的毒副作用。
[0054]綜上所述，As203-PLGA/PLC NPs對肝腫瘤部位具有一定的靶向作用，可有效提高治療效果，并降低對其它組織的毒副作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.帶正電荷具有肝靶向作用的三氧化二砷制劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)將As2O3溶于氫氧化鈉水溶液中，制成As2O3的氫氧化鈉溶液； 2)將乳酸-羥基乙酸共聚物溶于三氯甲烷中，制成乳酸-羥基乙酸的氯仿溶液； 3)在磁力攪拌下，將As2O3的氫氧化鈉溶液加入到乳酸-羥基乙酸的氯仿溶液中，然后冰浴超聲乳化，形成W/0初乳； 4)將聚乙二醇/乳糖酸-殼聚糖溶解于乳化劑水溶液中，制成含聚乙二醇/乳糖酸-殼聚糖的乳化劑水溶液； 5)將W/0初乳與含聚乙二醇/乳糖酸-殼聚糖的乳化劑水溶液混合，冰浴超聲乳化形成W/0/W復(fù)乳； 6)將W/0/W復(fù)乳與低濃度的乳化劑水溶液均勻混合后，蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，離心收集沉淀、去離子水洗滌，冷凍干燥得As203-PLGA/PLC NPs。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于:步驟I)中，所述As2O3的氫氧化鈉溶液中AS2O3含量為60 mg/mL。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于:步驟2)中，所述乳酸-羥基乙酸共聚物含量為30 mg/mL ο4.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于步驟3)中，所述As2O3的氫氧化鈉溶液和乳酸-羥基乙酸的氯仿溶液的混合體積比為1:20。5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述制備方法，其特征在于步驟3)中，所述超聲乳化時(shí)，超聲功率為300 W，超聲時(shí)間為90 S06.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于步驟4)中，所用乳化劑為泊洛沙姆;所述乳化劑水溶液中聚乙二醇/乳糖酸-殼聚糖的濃度為I mg/mL。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于步驟5)中，超聲乳化時(shí)，超聲功率為.500W，超聲時(shí)間為180 S08.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于步驟6)中，所述低濃度的乳化劑水溶液為濃度為0.9% (w/v)的泊洛沙姆水溶液。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于步驟4)中，所述聚乙二醇/乳糖酸-殼聚糖是按以下方法合成的:將Ig殼聚糖溶解于質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2%的6 mL醋酸中，再加入pH為4.7的20 mL TEMED.HCL緩沖溶液，然后分別加入3.83mgEDC和2.30mg NHS, 30min后加入.0.16mg聚乙二醇和1.43mg乳糖酸，在反應(yīng)體系的pH值為4_6的條件下，于35°C條件下攪拌反應(yīng)，取得粗產(chǎn)物，將粗產(chǎn)物置于透析袋中透析后，經(jīng)冷凍干燥，得聚乙二醇/乳糖酸-殼聚糖。
【專利摘要】帶正電荷具有肝靶向作用的新型三氧化二砷制劑的制備方法，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明以As2O3的氫氧化鈉溶液為內(nèi)水相，以乳酸-羥基乙酸的氯仿溶液為油相，先以油相包封內(nèi)水相，形成W/O初乳。再以含聚乙二醇/乳糖酸-殼聚糖的乳化劑水溶液為外水相。采用可生物降解、生物相容性良好的乳酸-羥基乙酸共聚物作為包封材料，采用雙乳化-溶劑揮發(fā)法制得As2O3-PLGA/PLC？NPs，納米粒尺寸均一，分散性好，包封率、載藥量高，在體外可穩(wěn)定釋放，在體內(nèi)體外都表現(xiàn)出良好的抗腫瘤性能，體現(xiàn)了一定的肝靶向功能，使As2O3能夠直接靶向肝癌腫瘤部位并在腫瘤部位實(shí)現(xiàn)藥物的可控釋放，提高治療效果。
【IPC分類】A61K33/36, A61K9/52, C08B37/08, A61K47/36, A61P35/02, A61K47/34
【公開號】CN105640922
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】宋曉麗, 王娟, 閆彩鳳, 朱愛萍, 郭榮
【申請人】揚(yáng)州大學(xué)
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年1月25日