一種超穩(wěn)定單分散的熒光磁性納米探針及其制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米探針材料領(lǐng)域，尤其是涉及一種超穩(wěn)定單分散超順磁性的熒光磁性納米探針及制備和在動(dòng)物體內(nèi)靶向雙模態(tài)成像應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，胃癌死亡率占全球第二，在我國(guó)惡性瘤中排名第三。由于胃癌沒(méi)有指定的位置，它可以發(fā)生在胃的任何一部分，胃癌及癌前病變的癥狀具有隱匿性和無(wú)特異性，且潛伏期較長(zhǎng)，一旦發(fā)現(xiàn)已到晚期或者轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者無(wú)法治愈而死亡。因此，早期預(yù)警及體內(nèi)胃癌細(xì)胞示蹤對(duì)潛伏期病人至關(guān)重要。
[0003]隨著近現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，納米材料在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用已進(jìn)入一個(gè)新的發(fā)展時(shí)期。尤其是在腫瘤學(xué)科的研究不斷加深，在靶向給藥、成像檢測(cè)、腫瘤熱療等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0004]分子顯像是在人體或其他生物體內(nèi)，在細(xì)胞或分子水平上對(duì)細(xì)胞或分子生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行無(wú)創(chuàng)和重復(fù)的顯像。磁共振顯像相對(duì)于其它的無(wú)創(chuàng)傷顯像技術(shù)，如:核醫(yī)學(xué)顯像、光學(xué)顯像、超聲顯像等，具有高空間分辨力、軟組織對(duì)比度好等優(yōu)點(diǎn)，非常適合應(yīng)用于分子顯像學(xué)的研究。但MR成像在腫瘤切除過(guò)程中隨著非切除部分的減少，其檢測(cè)的精確度也逐漸降低。
[0005]電子激發(fā)態(tài)光敏劑不僅能產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，還能在轉(zhuǎn)變?yōu)榛鶓B(tài)過(guò)程時(shí)發(fā)出熒光，形成光學(xué)圖像。因此光敏劑既能作為光動(dòng)力療法用藥，又能作為成像造影劑。光敏劑熒光檢測(cè)是一種較為靈敏的技術(shù)，能夠識(shí)別組織的微細(xì)結(jié)構(gòu)，且精確度不會(huì)隨著非切除部分的減少而降低。但不具有高空間分辨力、軟組織對(duì)比度等特點(diǎn)。
[0006]目前，有研究者將磁共振顯像與光敏劑熒光顯像的優(yōu)勢(shì)結(jié)合設(shè)計(jì)出熒光磁性納米探針，但其在正常組織(如:肝，脾等)損害、腫瘤部位的滯留時(shí)間等方面仍然很難做到盡如人意。為了減小熒光磁性納米探針對(duì)正常組織(如:肝，脾等)的損害，增長(zhǎng)在腫瘤部位的滯留時(shí)間，需要在不影響分散性的前提下，減小納米探針的粒徑大小及分布，充分發(fā)揮其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。
[0007]中國(guó)專(zhuān)利201210233952.9公開(kāi)了一種靶向順磁性稀土離子光敏探針的制備方法，包括以下步驟:(I)稱(chēng)取氧化釓、氧化銪和氟化鈉，置于燒杯中，加入油酸、乙醇和水，反應(yīng)得NaGdF4:Eu納米顆粒；(2)稱(chēng)取NaGdF4:Eu納米顆粒溶于異丙醇中，加入H2O和濃氨水及光敏劑TMPyP，經(jīng)反應(yīng)制備得到表面氨基修飾的稀土光敏納米顆粒；(3)取氨基修飾后的稀土光敏納米顆粒分散于PBS緩沖溶液中，依次加入NHS、EDC和轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液，制得靶向順磁性稀土離子光敏探針。該專(zhuān)利制備的光敏探針的粒徑較大，對(duì)正常組織的損害較大，并影響了其在腫瘤部位的滯留時(shí)間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種超穩(wěn)定單分散超順磁性的熒光磁性納米探針及制備和在動(dòng)物體內(nèi)靶向雙模態(tài)成像應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
[0010]一種超穩(wěn)定單分散超順磁性的熒光磁性納米探針，包括由羧基化四氧化三鐵磁性納米粒子、PEG(聚乙二醇)和靶分子組成的載體，以及負(fù)載在載體上的光敏劑藥物，所述的PEG用于將羧基化四氧化三鐵磁性納米粒子與靶分子連結(jié)。
[0011 ]所述的載體中，羧基化四氧化三鐵納米粒子、PEG與革El分子的質(zhì)量比為:(4?10):(6?20): (2?6);所述的光敏劑藥物與載體的質(zhì)量比為(I?5): (4?12)。
[0012]所述的PEG的分子量為1000?40000，其兩端為氨基；
[0013]所述的光敏劑藥物選自Ce6(二氫卟吩e6)、ICG(吲哚菁綠)、D0X(阿霉素)或Cy5.5(青色素5.5)中的一種。
[0014]所述的熒光磁性納米探針的平均尺寸為8?10nm。
[0015]超穩(wěn)定單分散超順磁性的熒光磁性納米探針的制備方法，包括以下步驟:
[0016](I)將抗壞血酸置于鐵鹽溶液中，再調(diào)節(jié)溶液pH至為9?12，攪拌混合后，水熱反應(yīng)，反應(yīng)完成后透析得到MNPs-COOH分散液；
[0017](2)取MNPs-COOH分散液離心后，去除上清液，加硼酸酸鹽緩沖液定容至原體積，活化MNPs-⑶OH分散液中的羧基，再加入PEG，混合反應(yīng)，得到MNPs-PEG分散液(羧基化磁性粒子分散液);
[0018](3)取活化后的靶分子加入到MNPs-PEG分散液中，混合反應(yīng)，得到帶靶分子的MNPs-PEG分散液；
[0019](4)將帶靶分子的MNPs-PEG分散液與光敏劑藥物溶液攪拌混合反應(yīng)，離心去除未負(fù)載藥物，即得到熒光磁性納米粒子。
[0020]優(yōu)選的，步驟(I)中所述的鐵鹽溶液由摩爾比(I?2):(I?4)的有機(jī)鐵鹽和無(wú)機(jī)鐵鹽加水?dāng)嚢枞芙舛?，鐵鹽溶液中，F(xiàn)e2+和Fe3+的摩爾比1:1?4;
[0021]優(yōu)選的，有機(jī)鐵鹽選自檸檬酸鐵、乙酰丙酮鐵、右旋糖酐鐵或葡萄糖酸亞鐵中的一種或幾種；
[0022]無(wú)機(jī)鐵鹽選自硫酸亞鐵、硫酸鐵、氯化亞鐵或氯化鐵中的一種或幾種；
[0023]抗壞血酸與鐵鹽溶液的添加量滿足抗壞血酸與鐵鹽溶液中的Fe3+的摩爾比為I: (3?9)；
[0024]水熱反應(yīng)的工藝條件為在150?230°C的溫度下保溫4?15h;
[0025]溶液pH的調(diào)節(jié)是采用濃度為0.4?5M的氫氧化鈉溶液進(jìn)行的。
[0026]優(yōu)選的，步驟(2)中離心通常在冷凍離心機(jī)上進(jìn)行，其工藝條件為:在4°C下，以10000?14000印111的轉(zhuǎn)速離心3?30111；[11;
[0027]活化的工藝步驟為:在MNPs-COOH分散液中加入EDC/NHS，使其滿足與MNPs-⑶OH上的羧基的摩爾比為1: (I?1.5)，在旋轉(zhuǎn)振蕩器(可采用XH-1T型多管可調(diào)式旋轉(zhuǎn)混合器)上旋轉(zhuǎn)20?50min，轉(zhuǎn)速為2.5?30轉(zhuǎn)/分；
[0028]PEG的添加量滿足其與MNPs-COOH上的羧基的摩爾比為1: (I?1.5);
[0029]混合反應(yīng)的工藝條件為:在37°C下振蕩30?50min或室溫下在旋轉(zhuǎn)振蕩器上旋轉(zhuǎn)12?24h;
[0030]硼酸鹽緩沖液優(yōu)選pH為7.2的硼酸鹽緩沖液。
[0031]優(yōu)選的，步驟(3)中所述的靶分子為葉酸(FA);
[0032 ]葉酸活化的工藝步驟為:往葉酸的分散液中加入EDC/NHS，使其與葉酸中的羧基的摩爾比為1: (I?1.5)，在旋轉(zhuǎn)振蕩器上旋轉(zhuǎn)20?50min，轉(zhuǎn)速為2.5?30轉(zhuǎn)/分，即得；
[0033]活化后的靶分子與MNPs-PEG分散液的添加量滿足靶分子與MNPs-PEG的摩爾比為1:(1?1.5);
[0034]混合反應(yīng)的工藝條件為:37°C下在旋轉(zhuǎn)振蕩器上旋轉(zhuǎn)30?50min，轉(zhuǎn)速為2.5?30
轉(zhuǎn)/分。
[0035]優(yōu)選的，步驟(4)中攪拌混合反應(yīng)的工藝條件為:以200?500rpm的轉(zhuǎn)速攪拌20?24h；
[0036]離心通常在冷凍離心機(jī)上進(jìn)行，其工藝條件為:在4°C下，以10000?HOOOrpm的轉(zhuǎn)速離心3?30min;
[0037]帶靶分子的MNPs-PEG分散液與光敏劑藥物溶液的添加量滿足光敏劑藥物與帶靶分子的MNPs-PEG的質(zhì)量比為(2?6): (4?12)。
[0038]超穩(wěn)定單分散超順磁性的熒光磁性納米探針用于在動(dòng)物體內(nèi)靶向雙模態(tài)成像。
[0039]本發(fā)明通過(guò)水熱法制備尺寸小、水溶性好、磁性能優(yōu)異的羧基化四氧化三鐵磁性納米粒子，以其為探針核，再通過(guò)兩端為氨基的PEG將羧基化四氧化三鐵磁性納米粒子與靶分子連結(jié)，并負(fù)載光敏劑藥物，即構(gòu)成靶向效率高、正常組織(如肝、脾等)不易富集、腫瘤部位滯留時(shí)間長(zhǎng)的熒光磁性納米探針。
[0040]相比于傳統(tǒng)方法僅使用無(wú)機(jī)鐵鹽作為前驅(qū)體，有機(jī)鐵鹽不僅提供反應(yīng)所必需的鐵離子，其有機(jī)鐵鹽的陰離子在水熱反應(yīng)條件下還可通過(guò)化學(xué)絡(luò)合的方式連接到磁性粒子表面，提高磁性粒子的水溶性和功能性。而抗壞血酸又稱(chēng)維生素C，是人體等其他許多動(dòng)物必不可少的營(yíng)養(yǎng)素，在生物體內(nèi)主要起到一種抗氧化的作用。將抗壞血酸引入反應(yīng)體系，在高溫水熱條件下，抗壞血酸起到還原劑的作用，使得Fe2+離子不被密封反應(yīng)釜中的空氣氧化，與體系中Fe3+離子充分反應(yīng)，形成四氧化三鐵磁性納米粒子;同時(shí)還通過(guò)化學(xué)絡(luò)合使得磁性納米粒子表面連接上羧基，進(jìn)一步增強(qiáng)了磁性納米粒子的水溶性和功能性。
[0041]通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)，將兩端為氨基的PEG—端與一步法羧基化的四氧化三鐵磁性納米粒子連結(jié)，PEG另一端的氨基與靶分子連結(jié)，得到藥物載體，即:MNPs-PEG-FA，其中，PEG外殼阻止磁性納米顆粒的團(tuán)聚和蛋白質(zhì)吸附，增加磁性納米顆粒血液循環(huán)時(shí)間和體內(nèi)靶細(xì)胞的內(nèi)在化效率。癌細(xì)胞表面富含葉酸受體，將靶分子葉酸偶聯(lián)在納米探針上，可高效地結(jié)合癌細(xì)胞表面的革E點(diǎn)，定向地進(jìn)入細(xì)胞，準(zhǔn)確地示蹤癌細(xì)胞或腫瘤的位置，為后續(xù)診斷和治療奠定良好的基礎(chǔ)。
[0042]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0043](I)制備簡(jiǎn)單、快捷、合成尺度大，只需使用少量幾種試劑即可制得；
[0044](2)通過(guò)磁性納米粒子與PEG—端的氨基、PEG另一端氨基與羧基活化的葉酸共價(jià)偶聯(lián)可以直接制得超穩(wěn)定單分散生物相容性優(yōu)良的熒光納米探針；
[0045](3)制得的熒光納米探針平均尺寸為S-1Onm，且粒徑分布均勻；
[0046](4)制得的熒光納米探針靶向效率高、正常組織(如肝、脾等)不易富集、腫瘤部位滯留時(shí)間長(zhǎng)達(dá)8天。
【附圖說(shuō)明】
[0047]圖1為本發(fā)明制得的熒光磁性納米探針的光學(xué)照片；
[0048]圖2為本發(fā)明的熒光磁性納米探針的透射電鏡圖片；
[0049]圖3為本發(fā)明的熒光磁性納米探針的高分辨透射電鏡圖片；
[0050]圖4為本發(fā)明的熒光磁性納米探針的磁滯曲線；
[0051 ]圖5為本發(fā)明的熒光磁性納米探針的熒光光譜圖；
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