止。在手術(shù)剪刀幫助下，撕掉后彈力層和內(nèi)皮層，得到包含前彈力層和部分基質(zhì)層的牛角膜基質(zhì)。將牛角膜基質(zhì)片放置在裝有PBS的50ml凍存管中，在-80°C冰箱中凍2小時(shí)后，于37°C融化45分鐘，反復(fù)凍融4次進(jìn)行細(xì)胞破壁，以使牛角膜基質(zhì)片的細(xì)胞破碎。
[0046]S3、采用10mmTris-HCl緩沖液(pH7.5)漂洗3次，且每次漂洗20分鐘；
[0047]將牛角膜基質(zhì)放在5g/L的碳酸氫鈉溶液中浸泡30分鐘，然后用超純水沖洗3次。
[0048]S4、將牛角膜基質(zhì)放在0.7%。次氯酸鈉溶液中浸泡15分鐘，然后用超純水沖洗2次。
[0049]S5、將所得到的牛角膜基質(zhì)放在70 %的甘油脫水劑中浸泡6小時(shí)；
[0050]將牛角膜基質(zhì)用劑量為1KGy的鈷-60輻照3小時(shí)；
[0051]將所制備的牛角膜基質(zhì)放于質(zhì)量指標(biāo)符合HG/T2765-2005標(biāo)準(zhǔn)的硅膠干燥劑中干燥保存。
[0052]實(shí)施例3
[0053]本發(fā)明提供一種利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法，包括以下步驟:
[0054]S1、取不超過12小時(shí)內(nèi)采取的新鮮牛眼球，用生理鹽水沖洗干凈后，用顯微角膜環(huán)鉆切取400微米的角膜片，放入濃度為0.8%的NaCl低滲溶液中60分鐘。
[0055]S20、用手術(shù)刀刮掉角膜上皮層，保留前彈力層，操作時(shí)手法輕柔，刮到前彈力膜層為止。在手術(shù)剪刀幫助下，撕掉后彈力層和內(nèi)皮層，得到包含前彈力層和部分基質(zhì)層的牛角膜基質(zhì)，將牛角膜基質(zhì)片放置在裝有PBS的50ml凍存管中，在-80°C冰箱中凍3小時(shí)后，于37°C融化60分鐘，反復(fù)凍融3次進(jìn)行細(xì)胞破壁，以使牛角膜基質(zhì)片的細(xì)胞破碎。
[0056]S3、采用10mmTris-HCl緩沖液(pH7.5)漂洗3次，且每次漂洗30分鐘；
[0057]將牛角膜基質(zhì)放在6g/L的碳酸氫鈉溶液中浸泡30分鐘，然后用超純水沖洗2次。
[0058]S4、將牛角膜基質(zhì)放在0.8%。次氯酸鈉溶液中浸泡30分鐘，然后用超純水沖洗2次。
[0059]S5、將所得到的牛角膜基質(zhì)放在80 %的甘油脫水劑中浸泡6小時(shí)；
[0060]將牛角膜基質(zhì)用劑量為15KGy的鈷-60輻照5小時(shí)；
[0061 ]將所制備的牛角膜基質(zhì)放于質(zhì)量指標(biāo)符合HG/T2765-2005標(biāo)準(zhǔn)的硅膠干燥劑中干燥保存。
[0062]實(shí)施例4
[0063]本發(fā)明提供一種利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法，包括以下步驟:
[0064]S1、取不超過12小時(shí)內(nèi)采取的新鮮牛眼球，用生理鹽水沖洗干凈后，用顯微角膜環(huán)鉆切取500微米的角膜片，放入濃度為0.7%的NaCl低滲溶液中60分鐘。
[0065]S20、用手術(shù)刀刮掉角膜上皮層，保留前彈力層，操作時(shí)手法輕柔，刮到前彈力膜層為止。在手術(shù)剪刀幫助下，撕掉后彈力層和內(nèi)皮層，得到包含前彈力層和部分基質(zhì)層的牛角膜基質(zhì)。將牛角膜基質(zhì)片放置在裝有PBS的50ml凍存管中，在-80°C冰箱中凍I小時(shí)后，于37°C融化30分鐘，反復(fù)凍融3次進(jìn)行細(xì)胞破壁，以使牛角膜基質(zhì)片的細(xì)胞破碎。
[0066]S3、采用10mmTris-HCl緩沖液(pH7.5)漂洗2次，且每次漂洗15分鐘；
[0067]將牛角膜基質(zhì)放在6g/L的碳酸氫鈉溶液中浸泡30分鐘，然后用超純水沖洗2次。
[0068]S4、將牛角膜基質(zhì)放在1.8%。次氯酸鈉溶液中浸泡2小時(shí)，然后用超純水沖洗2次。
[0069]S5、將所得到的牛角膜基質(zhì)放在80 %的甘油脫水劑中浸泡5小時(shí)；
[0070]將牛角膜基質(zhì)用劑量為12KGy的鈷-60輻照8小時(shí)；
[0071]將所制備的牛角膜基質(zhì)放于質(zhì)量指標(biāo)符合HG/T2765-2005標(biāo)準(zhǔn)的硅膠干燥劑中干燥保存。
[0072]本發(fā)明還提供一種利用新鮮牛角膜以制備的牛角膜基質(zhì)的應(yīng)用方法，該牛角膜基質(zhì)采用實(shí)施例1至實(shí)施例4中記載的制備方法制備而成，在對(duì)其應(yīng)用前采用I3BS浸泡10分鐘復(fù)水后，即可在手術(shù)中使用。
[0073]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，對(duì)發(fā)明而言僅僅是說明性的，而非限制性的。本專業(yè)技術(shù)人員理解，在發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對(duì)其進(jìn)行許多改變，修改，甚至等效，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法，包括以下步驟: 從新鮮牛眼球上切取角膜片后，并將角膜片浸泡在低滲溶液中； 由角膜片上得到包含前彈力層和部分基質(zhì)層的牛角膜基質(zhì)，將其反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破碎； 依次采用緩沖液對(duì)牛角膜基質(zhì)進(jìn)行漂洗、以及將其放入脫細(xì)胞試劑中進(jìn)行浸泡后，采用超純水對(duì)其進(jìn)行沖洗； 將牛角膜基質(zhì)放入另一種脫細(xì)胞試劑中進(jìn)行浸泡后，再次采用超純水對(duì)牛角膜基質(zhì)進(jìn)行沖洗； 將牛角膜基質(zhì)放入脫水劑中進(jìn)行浸泡后，采用鈷-60對(duì)牛角膜基質(zhì)進(jìn)行輻照后，將所制備的牛角膜基質(zhì)放干燥保存。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法，其特征在于，上述方法的具體步驟如下: 51、取12小時(shí)內(nèi)的新鮮牛眼球，用生理鹽水沖洗干凈后，用顯微角膜環(huán)鉆切取200?500微米的角膜片，將其放于低滲溶液中浸泡30?60分鐘； 52、用手術(shù)刀刮掉角膜片的上皮層，保留前彈力層，撕掉后彈力層和內(nèi)皮層，得到包含前彈力層和部分基質(zhì)層的牛角膜基質(zhì)，將其反復(fù)凍融使細(xì)胞破碎； 53、依次采用緩沖液對(duì)牛角膜基質(zhì)漂洗2?3次、以將其放入脫細(xì)胞試劑浸泡15?90分鐘，再采用超純水對(duì)其進(jìn)行沖洗2?3次； 54、將牛角膜基質(zhì)放入另一種脫細(xì)胞試劑浸泡15?30分鐘后，再采用超純水對(duì)其進(jìn)行沖洗2次； 55、將牛角膜基質(zhì)放入脫水劑中進(jìn)行浸泡3?6小時(shí)后，采用劑量為5?15KGy的鈷-60對(duì)牛角膜基質(zhì)輻照I?5小時(shí)后，將所制備的牛角膜基質(zhì)放置于無水氯化鈣中干燥保存。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法，其特征在于，在步驟SI中，低滲溶液為濃度為0.3%?0.5%的NaCl溶液。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法，其特征在于，在步驟S2中，將牛角膜基質(zhì)冷凍I或3小時(shí)，并解凍15?60分鐘，以使牛角膜基質(zhì)的細(xì)胞破碎。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法，其特征在于，在步驟S3中，緩沖液為100_ Tris-HCl緩沖液，其pH值為7.5; 脫細(xì)胞試劑采用濃度為3_5g/L的碳酸氫鈉溶液。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法，其特征在于，在步驟S4中，另一種脫細(xì)胞試劑采用濃度為0.6%。?1.8%。的次氯酸鈉溶液。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法，其特征在于，在步驟S5中，脫水劑采用體積比為70%或80%的甘油脫水劑。8.根據(jù)權(quán)利要求2或7所述的利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法，其特征在于，在步驟S5中，將牛角膜基質(zhì)放于質(zhì)量指標(biāo)符合HG/T2765-2005標(biāo)準(zhǔn)的硅膠干燥劑中干燥保存。9.一種利用新鮮牛角膜以制備的牛角膜基質(zhì)的應(yīng)用方法，其特征在于，該牛角膜基質(zhì)采用權(quán)利要求1或2所述的制備方法制備而成，在對(duì)其應(yīng)用前采用PBS浸泡10分鐘復(fù)水后，SP可在手術(shù)中使用。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法，包括：從新鮮牛眼球上切取角膜片后，并角膜片浸泡在低滲溶液中；由角膜片上得到包含前彈力層和部分基質(zhì)層的牛角膜基質(zhì)，將其反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破碎；依次采用緩沖液對(duì)牛角膜基質(zhì)進(jìn)行漂洗、以及將其放入脫細(xì)胞試劑中進(jìn)行浸泡后，采用超純水對(duì)其進(jìn)行沖洗；將牛角膜基質(zhì)放入另一種脫細(xì)胞試劑中進(jìn)行浸泡后，再次采用超純水對(duì)牛角膜基質(zhì)進(jìn)行沖洗；將牛角膜基質(zhì)放入脫水劑中進(jìn)行浸泡后，采用鈷-60對(duì)牛角膜基質(zhì)進(jìn)行輻照后，將所制備的牛角膜基質(zhì)放干燥保存。本發(fā)明采用物理方法與低毒性試劑，且時(shí)間極短，所得到的牛角膜基質(zhì)保存完整，具有透明性好、結(jié)構(gòu)致密的特點(diǎn)，接近于人體角膜的自然特性。
【IPC分類】A61L27/36, A61L27/50
【公開號(hào)】CN105641749
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】韓斌, 張 誠, 張旭
【申請(qǐng)人】北京賽爾泰和生物醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請(qǐng)日】2016年2月5日