一種頭孢噻呋半抗原及其膠體金檢測(cè)裝置及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種頭孢噻呋半抗原及其膠體金檢測(cè)裝 置及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 頭孢噻呋是一種親脂弱堿性乙胺嘧啶類抑菌劑，其抗菌譜和磺胺類藥物相似，但 抗菌作用較磺胺類藥物強(qiáng)，對(duì)大腸桿菌、奇異變形桿菌、肺炎桿菌、腐生葡萄球菌、多種革蘭 陽性和陰性細(xì)菌有效，但對(duì)綠膿桿菌感染無效，最低抑菌濃度常低于lOmg/1，單用易引起細(xì) 菌耐藥性，故一般不單獨(dú)使用，主要與磺胺藥組成復(fù)方制劑。因此它又被稱為磺胺增效劑， 用于擴(kuò)大抗菌譜，增強(qiáng)抗菌活性。臨床上用于治療尿路感染、腸道感染、呼吸道感染、菌痢、 腸炎、傷寒、腦膜炎、中耳炎、流腦、敗血癥及軟組織感染等?？膳c長(zhǎng)效磺胺藥合用于耐藥惡 性瘧的防治。隨著磺胺類藥物在獸醫(yī)臨床上不合理的使用，甚至濫用，以至于抗菌增效劑類 藥物在動(dòng)物源性食品中的殘留會(huì)不可避免地發(fā)生。人類長(zhǎng)期食用含有頭孢噻呋殘留的動(dòng)物 性食品及其制品，將有可能對(duì)人類健康產(chǎn)生危害。因此為了加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物性食品中這類藥物 的監(jiān)控，建立一種準(zhǔn)確、快速、方便的頭孢噻呋殘留量檢測(cè)方法很有必要。
[0003] 目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)頭孢噻呋的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)，液相-質(zhì)譜聯(lián)用 (LC-MASS)法和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法。在食品安全檢測(cè)中，往往先用ELISA初篩后再對(duì)陽 性樣本用HPLC或LC-MASS進(jìn)行確證。上述方法中所用儀器設(shè)備安規(guī)復(fù)雜、成本高、對(duì)操作人 員技術(shù)要求高且不能立即顯示結(jié)果，因此不適用于商檢、防疫、畜牧生產(chǎn)者對(duì)懷疑對(duì)象進(jìn)行 快速的在線檢測(cè)和監(jiān)控。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)以上技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種頭孢噻呋半抗原及其膠體金檢測(cè)裝置及其 制備方法，針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)頭孢噻呋技術(shù)的不足，建立一種檢測(cè)頭孢噻呋殘留的快速方法，使 其能更加快速、靈敏、簡(jiǎn)便地檢測(cè)頭孢噻呋殘留，滿足了快速檢測(cè)的需要。
[0005] 對(duì)此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為： 一種頭孢噻呋半抗原，其具有式(1)所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)式：
[0006] 上述分子式的化學(xué)名為(6R，7R)-7-[2-(2-氨基丙酸噻唑-4-基)-(Z)-2-(甲基亞 胺基）乙酰胺基]-3- [ (2-呋喃基羰基)硫甲基]-3-頭孢烯-4-羧酸，其分子式為C22H21N5〇 9S3， MASS[M+H]峰值為596.4，熔點(diǎn)為249度。
[0007] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的頭孢噻呋半抗原采用以下步驟制備得到： 步驟S1:將頭孢噻呋鈉溶解于甲醇中，加入冰乙酸，于20~30°C下攪拌10~120分鐘，其 中，所述冰乙酸的摩爾量是頭孢噻呋鈉摩爾量的1~3倍;再加入水，二氯甲烷萃取，旋干有機(jī) 相，得到淡粉紅色固體； 步驟S2:取步驟S1中得到的淡粉紅色固體溶于DMF(二甲基甲酰胺）中，加入碳酸鉀及溴 丙酸，35~45 °C下反應(yīng)2~8小時(shí)，采用二氯甲烷萃取過柱提純得所述頭孢噻呋半抗原。
[0008] 本發(fā)明還公開了一種頭孢噻呋免疫抗原，采用如上所述的頭孢噻呋半抗原制備得 至1J，將所述頭孢噻咲半抗原與DCC(Dicyclohexylcarbodiimide，二環(huán)己基碳二亞胺）、NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)混合，于4°C下攪拌，離心后取上清液;將人血清蛋白溶于pH值為8.0 的PBS溶液中，加入DMF后攪拌，然后將所述上清液逐漸加入其中，4°C下反應(yīng)12h，離心后， 取上清液，透析純化，得到所述頭孢噻呋免疫抗原。
[0009] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述透析純化時(shí)，在4°C下用生理鹽水透析3天，每天更 換3次透析液。
[0010] 本發(fā)明還公開了一種頭孢噻呋單克隆抗體，采用如上所述的頭孢噻呋免疫抗原與 免疫Balb/c小鼠經(jīng)細(xì)胞融合，篩選得到分泌頭孢噻呋單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，用獲得的 雜交瘤細(xì)胞采用體內(nèi)誘生腹水法制備得到頭孢噻呋單克隆抗體。
[0011]優(yōu)選的，所述頭孢噻呋單克隆抗體采用以下方法制備得到:使用所述頭孢噻呋免 疫抗原并鑒定后免疫4只6周齡昆明小鼠，加強(qiáng)免疫三次后，采血測(cè)效價(jià)，待血清效價(jià)不再上 升，用兩倍劑量的抗原不加佐劑免疫小鼠，三天后脫頸致死小鼠，在無菌條件下取脾臟制備 脾細(xì)胞，與生長(zhǎng)旺盛的小鼠骨髓瘤細(xì)胞按8:1的比例混合于50mL離心管，加入30mL無血清 IPMI1640培養(yǎng)基，1100r/min離心5分鐘棄上清，將細(xì)胞團(tuán)輕輕振松，置于37攝氏度水浴中。 把lmL50%(體積百分比）PEG-4000緩緩加入細(xì)胞中，在1分鐘內(nèi)滴完，同時(shí)輕輕攪動(dòng)底部沉 淀，靜置1分鐘后，前30秒沿管壁緩慢勻速加入無血清培養(yǎng)基lmL，后30秒加入2mL，然后快 速加入27mL終止融合過程，1100r/min離心5分鐘，棄上清，用HAT選擇性培養(yǎng)基重懸后加到 已鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37攝氏度、體積百分比5%的C0 2條件下培養(yǎng)。7天后 換成HT培養(yǎng)液，待孔內(nèi)的雜交細(xì)胞數(shù)量達(dá)到300個(gè)以上時(shí)，用間接ELISA(enzyme linked immunosorbent assay，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)法篩選，選擇強(qiáng)陽性、抑制效果好、細(xì)胞生長(zhǎng)旺 盛的孔進(jìn)行有限稀釋克隆化，經(jīng)3次以上的克隆培養(yǎng)和檢測(cè)，均呈陽性的孔內(nèi)細(xì)胞即為分泌 單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，將雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)以備單克隆抗體的制備;然后，采用體內(nèi) 誘生腹水法生產(chǎn)頭孢噻呋單克隆抗體。
[0012] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述體內(nèi)誘生腹水法的步驟為:對(duì)小鼠腹腔注射液體 石蠟油0.5mL/只，7天后腹腔注射所述雜交瘤細(xì)胞3~5X10 6/只，10天后，待小鼠腹部明顯 膨大時(shí)收集腹水，用正辛酸-硫酸銨沉淀法來純化腹水得到所述頭孢噻呋單克隆抗體。
[0013] 本發(fā)明還公開了一種頭孢噻呋膠體金檢測(cè)裝置，其包括反應(yīng)杯和檢測(cè)試紙，所述 檢測(cè)試紙包括底板，以及底板上依次鋪設(shè)的樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水紙;所述反應(yīng)杯里 含有膠體金標(biāo)記的如上所述頭孢噻呋單克隆抗體，所述硝酸纖維素膜上設(shè)有檢測(cè)線和控制 線，所述檢測(cè)線為采用如上所述的頭孢噻呋免疫抗原在硝酸纖維素膜上進(jìn)行噴涂制得。
[0014] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述控制線為采用兔抗鼠 IgG進(jìn)行噴涂制得，所述檢測(cè) 線和控制線相互平行。優(yōu)選的，所述檢測(cè)線和控制線距離至少〇.5cm。
[0015] 優(yōu)選的，所述兔抗鼠 IgG是通過以下方法獲得： 用載體蛋白結(jié)合抗原免疫新西蘭白兔，免疫劑量為50yg~100yg/次，背部皮下分多點(diǎn) 注射，其中所述載體蛋白為常規(guī)的載體蛋白，優(yōu)選人血清白蛋白、卵清蛋白或牛血清白蛋 白；首免，用合成的人工抗原與等量弗氏完全佐劑乳化;加強(qiáng)免疫，用合成的人工抗原與等 量弗氏不完全佐劑乳化，連續(xù)免疫4~5次，每次間隔4~8周，最后一次免疫后10~15天，以 ELISA法測(cè)其定效價(jià)達(dá)到105以上時(shí)，采血并分離收集高免血清，以飽和硫酸銨鹽析法提取 兔抗鼠 I gG抗體，-20 °C凍存?zhèn)溆谩?br>[0016] 本發(fā)明還公開了如上所述的頭孢噻呋膠體金檢測(cè)裝置的制備方法，其包括以下步 驟： 步驟A:將頭孢噻呋鈉溶解于甲醇中，加入冰乙酸，于20~30°C下攪拌10-120分鐘，其中， 所述冰乙酸的摩爾量是頭孢噻呋鈉摩爾量的1~3倍;再加入水，用二氯甲烷萃取，旋干有機(jī) 相，得到淡粉紅色固體;將淡粉紅色固體溶于DMF中，加入碳酸鉀及溴丙酸，35~45°C下反應(yīng)2 ~8小時(shí)，采用二氯甲烷萃取過柱提純得所述頭孢噻呋半抗原;利用碳二亞胺法將所述頭孢 噻呋半抗原與載體蛋白牛血清偶聯(lián)，制備得到頭孢噻呋免疫抗原； 優(yōu)選的，所述頭孢噻呋免疫抗原的制備步驟為將所述頭孢噻呋半抗原與DCC、NHS混合， 于4°C下攪拌，離心后取上清液;將人血清蛋白溶于pH值為8.0的PB