一種具有氧化-還原響應的透明質(zhì)酸鈉衍生物的制備方法
【專利說明】一種具有氧化-還原響應的透明質(zhì)酸鈉衍生物的制備方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及智能醫(yī)用生物材料技術(shù)領(lǐng)域，是一種涉及一種透明質(zhì)酸鈉衍生物的制備方法，該透明質(zhì)酸衍生物用于抗衰老、藥物緩釋、關(guān)節(jié)腔注射、注射美容等方面。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]自由基學說(Free radical theory)是具有代表性的致衰學說之一。這一學說在20世紀50年代中期由著名學者HaMan首先提出，其后得到許多學者的共識。自由基是指獨立存在的，含有I個或I個以上的不配對電子的任何原子或原子團，是機體正常代謝的中間產(chǎn)物，在機體內(nèi)具有很強的氧化反應能力，且易產(chǎn)生連鎖反應，對蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等產(chǎn)生傷害，從而導致機體的損傷。大量的科學實驗證實，氧自由基與機體損傷有著非常密切的關(guān)系。氧自由基是需氧生物細胞進行正常代謝的副產(chǎn)品。據(jù)統(tǒng)計機體每天吸入的氧氣中有1%產(chǎn)生氧自由基。實驗證明機體細胞存在少量氧自由基是維持生命所必需的，如甲狀腺素的合成，必須有少量氧自由基的參與；嗜中性白細胞釋放出的超氧陰離子及巨噬細胞產(chǎn)生的NO對殺滅外源細菌及體內(nèi)壞死組織具有重要的意義。但氧自由基產(chǎn)生過多，或機體內(nèi)的抗氧化自由基系統(tǒng)被大量消耗，氧自由基與抗氧自由基平衡失調(diào)時，自由基才便會引起疾病。大量的文獻報道現(xiàn)有的諸多系統(tǒng)性疾病如風濕性骨關(guān)節(jié)炎、糖尿病、骨質(zhì)疏松、白內(nèi)障等均與氧自由基過多有密切的關(guān)系。
[0005]巰基化合物是一種具有較強還原性的活性化合物，在較低的氧化環(huán)境下即可發(fā)生反應，巰基自身氧化成二硫鍵化合物；而形成的二硫鍵在還原環(huán)境下，又可逆形成巰基。現(xiàn)在較常見的巰基化合物有半胱氨酸、谷胱甘肽(還原型)等。但是這類化合物均為小分子化合物，在體內(nèi)易代謝，殘存時間短。如何延長體內(nèi)殘存時間，更好地發(fā)揮巰基的抗氧化能力，是這類化合物用于抗氧化應用的關(guān)鍵。
[0006]透明質(zhì)酸鈉巰基化衍生物主要通過高分子與巰基乙酸、巰基乙醇、谷胱甘肽等含巰基基團的化合物之間發(fā)生接枝或交聯(lián)反應制備而成。最常用的方法為碳二亞胺(EDC)活化羧基，進而接入巰基基團，但該方法接枝率低，對反應體系的PH依賴性高不利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，同時由于巰基化合物花絮性質(zhì)非常活潑，反應過程中極易引起巰基化合物的氧化，進而導致接枝率低；為改善上述弊端，大量的文獻報道采用含二硫鍵的化合物進行接枝反應，然后通過二硫蘇糖醇(DTT)將二硫鍵打斷形成含有游離巰基的透明質(zhì)酸衍生物，該方法解決了在接枝反應體系中巰基化合物易于氧化的弊端，但該方法首先需要在二硫鍵化合物的基礎(chǔ)進行酰肼改性引入氨基，然后通過氨基與透明質(zhì)酸中羧基之間的酰胺化反應形成目的產(chǎn)物，由此可見該種方法工藝繁瑣，同時引入諸多的有機溶劑不利于后續(xù)的規(guī)模化放大及其生物相容性。
[0007]鑒于上述方法的不足，本發(fā)明采用嗎啉衍生物作為偶聯(lián)試劑進行制備透明質(zhì)酸衍生物凝膠(以下簡稱DMTMM法)。DMTMM是目前較為理想的生成酰胺鍵的方法之一，其具有如下幾個優(yōu)勢:1.反應活性高，單一氨基酸的接枝率可達到70%以上；2.反應溫和，低溫和室溫下即可反應；3.對PH的依賴性弱，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；4.副反應少，未參加反應的嗎啉衍生物不與透明質(zhì)酸鈉反應，且易于去除，有利于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。
[0008]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明涉及了一種巰基化透明質(zhì)酸衍生物的制備，得到的透明質(zhì)酸巰基衍生物，可以對體內(nèi)的氧化劑或自由基起到響應，起到抗衰老、抗氧化作用。
[0010]發(fā)明的具體內(nèi)容如下:
本發(fā)明采用現(xiàn)在較為常用的偶聯(lián)試劑4-(4，6- 二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(DMTMM)，該偶聯(lián)試劑具有反應活性高、低毒、易于去除等優(yōu)點，主要用于活化羧基，進行酰胺鍵的合成制備。胱胺為有機二硫化合物，其分子的兩端為氨基，均可以與羧酸形成酰胺鍵。
[0011]在偶聯(lián)試劑DMTMM的作用下，胱胺與透明質(zhì)酸鈉的羧基端進行偶聯(lián)反應，得到透明質(zhì)酸鈉衍生物，再通過二硫蘇糖醇(DTT)還原，得到透明質(zhì)酸的巰基衍生物。該衍生物在氧化劑存在下，有效地消除氧化劑，自身形成較好強度的水凝膠。
[0012]說明書附圖
圖1滅菌前后透明質(zhì)酸鈉衍生物巰基含量。
[0013]圖2透明質(zhì)酸鈉衍生物對于自由基的消除作用。
[0014]圖3透明質(zhì)酸鈉衍生物對于谷胱甘肽的感應曲線。
【具體實施方式】
[0015]現(xiàn)結(jié)合實施例，對本發(fā)明作詳細描述，但本發(fā)明的實施不僅限于此。
[0016]實施例一
將胱胺二鹽酸鹽0.2817g溶解于15mL水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為4，稱取Ig透明質(zhì)酸鈉干粉，攪拌均勻后，放4°C過夜。第二天稱取DMTMM 0.6918g用5mL水完全溶解并用鹽酸將PH值調(diào)為4，然后加入凝膠中，待完全攪拌均勻后，4°C下反應2天。
[0017]將反應好的凝膠切成塊后，用PBS緩沖液透析，每Ih更換透析液I次并稱重，直到凝膠質(zhì)量不在增加時，終止透析，將該凝膠粉碎制粒后，用IM的NaOH水溶液調(diào)節(jié)凝膠pH值為8~10，混合均勻后，加入二硫蘇糖醇1.928g，室溫下過夜反應，得到的反應液用鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH到3左右后，將溶液轉(zhuǎn)移到透析袋中(截留分子量40000)，用ImM的鹽酸和0.3M的氯化鈉溶液透析2天，最后用ImM的鹽酸透析I天。收集透析好的溶液并冷凍干燥，待用。
[0018]實施例二
將胱胺二鹽酸鹽0.2817g溶解于15mL水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為6，稱取Ig透明質(zhì)酸鈉干粉，攪拌均勻后，放4°C過夜。第二天稱取DMTMM 0.6918g用5mL水完全溶解并用鹽酸將PH值調(diào)為6，然后加入凝膠中，待完全攪拌均勻后，4°C下反應2天。
[0019]將反應好的凝膠切成塊后，用PBS緩沖液透析，每Ih更換透析液I次并稱重，直到凝膠質(zhì)量不在增加時，終止透析，將該凝膠粉碎制粒后，用IM的NaOH水溶液調(diào)節(jié)凝膠pH值為8~10，混合均勻后，加入二硫蘇糖醇1.928g，室溫下過夜反應，得到的反應液用鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH到3左右后，將溶液轉(zhuǎn)移到透析袋中(截留分子量40000)，用ImM的鹽酸和0.3M的氯化鈉溶液透析2天，然后用ImM的鹽酸透析I天。收集透析好的溶液并冷凍干燥，待用。
[0020]實施例三
將胱胺二鹽酸鹽0.2817g溶解于15mL水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為6.5，稱取Ig透明質(zhì)酸鈉干粉，攪拌均勻后，放4°C過夜。第二天稱取DMTMM 0.6918g用5mL水完全溶解并用鹽酸將PH值調(diào)為6.5，然后加入凝膠中，待完全攪拌均勻后，4°C下反應2天。
[0021]將反應好的凝膠切成塊后，用PBS緩沖液透析，每Ih更換透析液I次并稱重，直到凝膠質(zhì)量不在增加時，終止透析，將該凝膠粉碎制粒后，用IM的NaOH水溶液調(diào)節(jié)凝膠pH值為8~10，混合均勻后，加入二硫蘇糖醇1.928g，室溫下過夜反應，得到的反應液用鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH到3左右后，將溶液轉(zhuǎn)移到透析袋中(截留分子量40000)，用ImM的鹽酸和0.3M的氯化鈉溶液透析2天，然后用ImM的鹽酸透析I天。收集透析好的溶液并冷凍干燥，待用。
[0022]實施例四
將胱胺二鹽酸鹽0.2817g溶解于15mL水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為7，稱取Ig透明質(zhì)酸鈉干粉，攪拌均勻后，放4°C過夜。第二天稱取DMTMM 0.6918g用5mL水完全溶解并