一種以竹筍殼降解產(chǎn)物為誘導劑培養(yǎng)霉菌生產(chǎn)纖維素酶的方法
【專利說明】一種以竹筍殼降解產(chǎn)物為誘導劑培養(yǎng)霉菌生產(chǎn)纖維素酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體地涉及纖維素酶的生產(chǎn)方法。以黑曲霉為菌種，葡萄糖為碳源，添加纖維素酶誘導劑，液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶。
【背景技術(shù)】
[0002]纖維素酶是一類能將纖維素水解成葡萄糖的生物酶，纖維素酶屬于誘導酶，產(chǎn)纖維素酶的微生物必須在環(huán)境中存在纖維素類底物的條件下才會合成纖維素酶。目前工業(yè)化生產(chǎn)纖維素酶的方法是通過在纖維素類介質(zhì)上培養(yǎng)能合成纖維素酶的微生物，主要是黑曲霉、木霉和青霉等霉菌，這些霉菌在生長過程中由細胞內(nèi)合成纖維素酶并分泌至細胞外。天然纖維素類介質(zhì)不溶于水，工業(yè)化生產(chǎn)纖維素酶往往采用固態(tài)發(fā)酵工藝，但是固態(tài)發(fā)酵很多發(fā)酵參數(shù)不易自動化控制。
[0003]很多科學研究結(jié)果表明，天然纖維素是大分子物質(zhì)，不能直接進入微生物細胞內(nèi)部誘導細胞組件合成纖維素酶，真正發(fā)揮“誘導”作用的物質(zhì)是纖維素或半纖維素在細胞外經(jīng)水解產(chǎn)生的小分子物質(zhì)，如二糖和寡糖等，這些小分子物質(zhì)進入細胞后經(jīng)過進一步的轉(zhuǎn)化形成了纖維素酶的合成因子。
[0004]竹筍殼中含有大量的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，以竹筍殼作為主要成分制作栽培料栽培平菇，平菇菌絲產(chǎn)生豐富的胞外水解酶分解纖維素和半纖維素，平菇成熟采摘后剩余的栽培料稱為“菇渣”，菇渣中仍然含有很多纖維素酶的合成因子，這些合成因子經(jīng)抽提分離后可以用來作為纖維素酶的誘導劑。
[0005]葡萄糖是發(fā)酵工程中的速效碳源，產(chǎn)纖維素酶的微生物可以利用葡萄糖作基質(zhì)快速生長繁殖，但是葡萄糖也是一種纖維素酶合成的抑制劑，葡萄糖分子抑制了微生物細胞內(nèi)纖維素酶合成因子的生成，所以當培養(yǎng)基中存在葡萄糖時，微生物的個體生長很快但不能合成纖維素酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了使產(chǎn)纖維素酶的微生物能在液態(tài)發(fā)酵系統(tǒng)中既快速生長繁殖又高效合成纖維素酶，本發(fā)明提供一種以竹筍殼降解產(chǎn)物為誘導劑培養(yǎng)霉菌生產(chǎn)纖維素酶的方法。
[0007]本發(fā)明通過改進葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基的配方，在葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中添加纖維素酶合成因子作誘導劑，在發(fā)酵過程中微生物個體既可以快速生長繁殖又可以高效的合成纖維素酶，同時提升農(nóng)副殘余的綜合利用價值。
[0008]具體的技術(shù)解決方案如下:
一種以竹筍殼降解產(chǎn)物為誘導劑培養(yǎng)霉菌生產(chǎn)纖維素酶的操作步驟如下:
(I)用竹筍殼制作誘導劑
(1.1)按重量比4:1將竹筍殼干粉和麩皮混和，加水拌勻、滅菌，制成發(fā)酵底料；
(1.2)在發(fā)酵底料中接入平菇菌種，好氧固態(tài)發(fā)酵，當菌絲長密長實，發(fā)酵完成;發(fā)酵底料中的竹筍殼干粉被部分降解，成為平菇發(fā)酵料；
(1.3)將平菇發(fā)酵料烘干至恒重，粉碎，得到纖維素酶誘導粉劑；
(1.4)將纖維素酶誘導粉劑和自來水混和，加熱，沸水浸提，靜置冷卻，取上層清液蒸發(fā)濃縮制成纖維素酶誘導水劑；
(2)配制霉菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方如下:
葡萄糖2.0 g、氯化鈉(NaCl)0.05 g、磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.1 g、七水硫酸鎂(MgSO4.7_0.05 g、硫酸銨((NH4)2S04) 0.2 g、纖維素酶誘導水劑10 mL和水90 mL；
(3)霉菌好氧發(fā)酵
在霉菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中接入黑曲霉孢子懸液，好氧恒溫發(fā)酵，得到發(fā)酵液；
(4)發(fā)酵液后處理
將發(fā)酵液經(jīng)過濾或離心處理，分離出其中的菌絲球，所得清液中纖維素酶活不低于4U/mL，將清液濃縮制成纖維素酶濃縮液或凍干制成纖維素酶粉劑。
[0009]進一步限定的技術(shù)方案如下:
步驟(1.1)中竹筍殼干粉過40目篩，按重量比4:1將竹筍殼干粉和麩皮混和，再加入干物質(zhì)重量2倍的自來水拌勻。
[0010]步驟(1.2)中接種量為發(fā)酵底料重量的5%，溫度28±2°C條件下，培養(yǎng)15d。
[0011 ]步驟(1.3)中將平菇發(fā)酵料在80°C溫度下烘干。
[0012]步驟(1.4)中纖維素酶誘導粉劑和自來水混和的比例是重量比1:10，沸水浸提20min，蒸發(fā)濃縮制成纖維素酶誘導水劑的體積是原液體積的1/10。
[0013]步驟(3)中霉菌好氧發(fā)酵的工藝條件:搖瓶發(fā)酵時，100mL霉菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中接入濃度(1.10?1.20) X 16個/mL的I mL黑曲霉孢子懸液，恒溫搖床培養(yǎng);轉(zhuǎn)速180 r/min、溫度32 °C、發(fā)酵時間72 h。
[0014]步驟(3)中霉菌好氧發(fā)酵的工藝條件:5L發(fā)酵罐發(fā)酵時，2 L霉菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中接入濃度(1.10?1.20) X 1fMVmL的20 mL黑曲霉孢子懸液，攪拌轉(zhuǎn)速800 r/min、通氣量0.5 L/min、溫度32°C、發(fā)酵時間72 h。
[0015]步驟(4)中處理清液的具體制劑方法是:-40°C真空冷凍干燥48h，制成纖維素酶粉劑;或室溫下真空杯過濾濃縮，濾膜透過分子量小于500 Da，制成纖維素酶濃縮液。
[0016]本發(fā)明的有益技術(shù)效果體現(xiàn)在以下方面:
1.在培養(yǎng)基中不含纖維素類物質(zhì)的情況下，實現(xiàn)了纖維素酶的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)。
[0017]2.本發(fā)明提高了竹筍的綜合利用價值，竹筍可以制作成多種類型的食品，竹筍加工的殘余一一竹筍殼，可以用來栽培平菇，平菇采摘后的菇渣，可以繼續(xù)用于生產(chǎn)纖維素酶，這種對竹筍的綜合利用為農(nóng)產(chǎn)品深加工提供了一種新模式。
【具體實施方式】
[0018]下面通過實施例，對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0019]本發(fā)明所用黑曲霉菌種購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，拉丁學名分別為Aspergillus nigerD
[0020]實施例1
以竹筍殼降解產(chǎn)物為誘導劑培養(yǎng)霉菌生產(chǎn)纖維素酶的具體操作步驟如下: 1.制作纖維素酶誘導粉劑
1.1將竹筍殼沖洗干凈，600C烘箱中烘干，粉碎，過40目篩得竹筍殼干粉，取1g竹筍殼干粉和2.5 g麩皮混和，再加入25 mL自來水，拌勻，裝入250 mL錐形瓶中121°C高壓蒸汽滅菌60 min，冷卻，得到發(fā)酵底料；
1.2.平菇發(fā)酵降解竹筍殼
在發(fā)酵底料中接入2g平菇菌種，溫度30°C、濕度70%條件下，培養(yǎng)15 d，當菌絲長密長實，發(fā)酵完成;發(fā)酵底料中的竹筍殼被部分降解，成為平菇發(fā)酵料；
1.3.平菇發(fā)酵料后處理
將平菇發(fā)酵料打散，80 °C烘干，粉碎，制得纖維素酶誘導粉劑；
2.制作竹筍殼降解產(chǎn)物的水浸提液
稱取1g纖維素酶誘導粉劑于大燒杯中，加入1000 mL的自來水，電爐加熱至沸騰，保持微沸30 min，期間每隔5 min攪拌一次，然后靜置、冷卻，取上清液300 mL，分裝入3只250 mL的錐形瓶，每瓶100 mL上清液。
[0021 ] 3.配制霉菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基
在100 mL的上清液中加入如下物質(zhì):2.0g葡萄糖，0.05g氯化鈉(NaCl)，0.1g磷酸二氫鉀(KH2P04)