基于番茄黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3的InDel分子標(biāo)記的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程領(lǐng)域，特別涉及一種基于番茄黃化曲葉病毒病抗性 基因 Ty-3的InDel分子標(biāo)記及擴(kuò)增該分子標(biāo)記的引物、利用分子標(biāo)記的檢測(cè)方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 番前(Solanum lycopersicum L.)屬于前科(Solanaceae)，為一年生草本前科植 物。番茄起源于南美西部地區(qū)，是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的重要蔬菜作物之一，深受廣大消費(fèi) 者的喜愛(ài)。隨著番茄栽培面積的逐年擴(kuò)大，栽培方式的多樣化，番茄病蟲(chóng)害問(wèn)題日趨嚴(yán)重， 近年來(lái)，番茄黃化曲葉病毒病在世界各地保護(hù)地番茄種植上普遍發(fā)生，給番茄生產(chǎn)帶來(lái)巨 大經(jīng)濟(jì)損失。因此培育抗黃化曲葉病毒新品種對(duì)番茄的生產(chǎn)意義重大。
[0003] 番前抗TYLCV植株材料先后在Solanum pimpinellifolium、Solanum peruvianum、 Solanum chilense、Solanum habrochaite、Solanum cheesmaniae等野生材料中發(fā)現(xiàn)?？乖?材料不同，其抗性遺傳規(guī)律也不同。目前已發(fā)現(xiàn)的抗性基因主要有Ty-l、Ty-2、Ty-3、Ty-3a、 Ty-4、Ty_5,其中Ty-l、Ty-2、Ty_3作為番茄抗TYLCV的主效抗性基因在生產(chǎn)中得以應(yīng)用 (Liedl，et al.，2013)。國(guó)內(nèi)番茄抗黃化曲葉病毒病育種起步較晚，與國(guó)外先進(jìn)國(guó)家有較大 的差距。由于番茄黃化曲葉病毒變異較大，這使番茄抗番茄黃化曲葉病常規(guī)育種進(jìn)展很慢。
[0004] 與傳統(tǒng)的遺傳育種相比，分子標(biāo)記有很多優(yōu)點(diǎn)，尤其是以PCR為基礎(chǔ)的DNA分子標(biāo) 記技術(shù)大大加快了育種的進(jìn)程和效率。目前，已有諸如REX_l(de Castro et al.，2007)、 TG0302(Garcia et al.,2007)、P6-25(Ji ve ark.,2008)和UF_TY3-P23(Verlaan,et al·， 2013)等多個(gè)與番茄黃化曲葉病毒病抗病基因緊密的連鎖標(biāo)記被陸續(xù)開(kāi)發(fā)出來(lái)，并逐步在 育種實(shí)踐中加以應(yīng)用。但這些標(biāo)記均與抗病基因間存在一定的遺傳距離，故篩選時(shí)會(huì)出現(xiàn) 一定比例的假陽(yáng)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于番茄黃化曲葉病毒病抗病基因 Ty-3的InDel標(biāo) 記。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供該分子標(biāo)記在番茄黃化曲葉病毒病抗性基因 Ty-3檢 測(cè)以及標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種基于番茄黃化曲葉病毒病抗病基因 Ty-3 的InDel標(biāo)記，該分子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種擴(kuò)增基于番茄黃化曲葉病毒病抗性基因 Ty-3的InDel標(biāo)記的 弓丨物對(duì)，該引物對(duì)序列如下：
[0009] 正向引物序列：5' -TGCAGGAACAGAATGATAGAAAA-3' ；
[0010] 反向引物序列:5'-GCTCAGCATCACCTGAGACA-3'。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種基于番茄黃化曲葉病毒病抗性基因 Ty-3的InDel標(biāo)記的檢測(cè) 方法，該方法以抗感番茄黃化卷葉病毒的番茄基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到能同時(shí)鑒 定父本、母本及其雜合體基因型的特異譜帶，該特異譜帶為攜帶抗性基因的植株譜帶和不 攜帶抗性基因的植株譜帶，所述攜帶抗性基因 Ty-3的植株譜帶為核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示的分子標(biāo)記。
[0012]所述不攜帶抗性基因 Ty-3的植株譜帶的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0013] 上述方法中，PCR反應(yīng)體系（20yL)為：包括正、反向引物各0.8μΜ，1.2πιΜ dNTPs， 2 · 5mMMgCl2，2yL 10 X buffer，0 · 5units Taq聚合酶，DNA模板30-50ng，ddH20補(bǔ)至20yL。
[0014] 上述方法中，PCR擴(kuò)增的程序均為:94°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，60°C退火45s， 72°(：延伸458,35個(gè)循環(huán);72°(：延伸1〇1^11 ;保存溫度4°(：。
[0015] 本發(fā)明還提供了上述分子標(biāo)記和檢測(cè)方法在番茄黃化曲葉病毒病抗性基因 Ty-3 檢測(cè)或標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
[0016] 有益效果：
[0017] 1)本發(fā)明的分子標(biāo)記完全基于番茄黃化曲葉病毒病抗性基因 Ty-3。該標(biāo)記引物的 特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高，并且標(biāo)記的篩選方法操作簡(jiǎn)便快捷，對(duì)檢測(cè)設(shè)備和引物模板質(zhì)量要求 不高，具有試驗(yàn)試劑用量少，速度快，成本低，適合大批次、高通量、自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)。非常適合 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)分子育種的實(shí)現(xiàn)。
[0018] 2)本發(fā)明的番茄黃化曲葉病毒病抗性基因 Ty-3特異分子標(biāo)記引物應(yīng)用于育種工 作中，將大大降低番茄黃化曲葉病毒病流行對(duì)番茄生產(chǎn)造成的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)減少農(nóng)藥使 用量，有益于降低生產(chǎn)成本，具有很大的應(yīng)用潛力和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0019] 3)本發(fā)明開(kāi)發(fā)出基于黃化曲葉病毒病抗性基因 Ty-3的InDel標(biāo)記，該標(biāo)記完全基 于抗性基因 Ty-3,與Ty-3基因完全連鎖，為共顯性分子標(biāo)記。將該標(biāo)記用于黃化曲葉病毒病 抗性基因 Ty-3的分子標(biāo)記輔助選擇，可大幅提高選擇的準(zhǔn)確性，縮短育種年限，從而加速育 種進(jìn)程。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 本發(fā)明有如下附圖：
[0021] 圖1為InDel標(biāo)記(Ty-3-InDel)在感病材料和抗病材料中的部分DNA序列
[0022] (P2與P1間存在250bp的缺失）；
[0023] 圖2為InDel標(biāo)記Ty-3-InDel在親本間及F!中的PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果（1: 100bp ladder;2_3:感病親本P2;4_5:抗病親本PI ;6_7:Fi單株）；
[0024] 圖3為InDel標(biāo)記Ty-3-InDel在F2群體中的檢測(cè)
[0025] (M:D2000; 1-48 :F2 代單株）；
[0026] 圖4為InDe 1標(biāo)記Ty-3-InDe 1在回交群體中的應(yīng)用
[0027] (M:D2000; 1-48 :BCi 代單株）。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍。
[0029]若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0030] 實(shí)施例1基于Ty-3基因的InDel標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及驗(yàn)證
[0031] 1.供試材料
[0032]本試驗(yàn)所用的抗病自交系P1和感病自交系P2經(jīng)已知分子標(biāo)記P6-25檢測(cè)證實(shí)，P1 為抗病純合體(Ty-3/Ty-3)，而P2為感病純合體(ty-S/tylhPl為母本，P2為父本配制雜交 組合，得到F1后，再自交得到F2分離群體。
[0033] 2.接種鑒定
[0034]抗性鑒定采用煙粉虱接種鑒定法，具體參照楊曉慧(2012)的方法。于幼苗2-3片真 葉期，將其放置于放有帶毒煙粉虱的生長(zhǎng)室內(nèi)，兩周后殺死帶毒的煙粉虱，之后將苗子移栽 到日光溫室或大田中，觀察病情結(jié)果。
[0035] 3. InDel分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及驗(yàn)證
[0036] A、InDel標(biāo)記的開(kāi)發(fā)
[0037] Verlaan等（2013)報(bào)道Ty-3基因即為Solyc06g051190。登陸SGN(Sol Genomics Network)網(wǎng)站( http://solgenomics.net/)，獲得Solyc06g051190序列，利用在線引物設(shè)計(jì) 軟件Pr imer 3plus，分段設(shè)計(jì)引物(表1)。本試驗(yàn)中所用到的番茄材料P1和P2的基因組DNA 從2-3周幼苗的葉片中用CTAB法提取(Fulton et al. ,1995)。根據(jù)設(shè)計(jì)的引物，對(duì)樣品P2和 P1的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系:擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為50yL，5. OyL模板DNA，5. OyL 10 X PCR Buffer(含Mg2+)，4.0yL High Pure dNTPs(2.5mM)，10yM的上下游引物各 1.0yL，0.3yL EasyTaq DNA Polymerase (5U · μL-1)，無(wú)菌純水33 · iyLePCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min; 94°C變性lmin， 55°C退火45s，72°c延伸lmin，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin;保存溫度4°C。取 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約10yL，在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，Bio-RAD自動(dòng)凝膠成像系 統(tǒng)觀察照相，記錄電泳結(jié)果。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)成功后，PCR產(chǎn)物使用膠回收試劑盒 (ZymocleanTM Gel DNA Recovery Kit)回收并進(jìn)行TA克隆測(cè)序。
[0038] 對(duì)P1和P2兩份材料PCR產(chǎn)物測(cè)序并進(jìn)行核酸序列分析，發(fā)現(xiàn)感病材料P2中出現(xiàn)長(zhǎng) 度為250bp核酸片段的缺失，針對(duì)該段序列缺失，利用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer 3plus設(shè)計(jì) 該InDel標(biāo)記的引物(Ty-3-InDel)序列（圖1，表2) Jy-3-InDel在理論上感病材料中可擴(kuò)增 出260bp特異性片段，而抗病材料可擴(kuò)增出510bp特異性片段。
[0039]表1以基因 Solyc06g051190為模板設(shè)計(jì)的引物
[0040]
[0041 ] 表2基于Ty-3的InDel標(biāo)記的引物
[0042]
[0043] B、InDel標(biāo)記的擴(kuò)增及檢測(cè)
[0044]本試驗(yàn)中所用到的番茄材料P1、P2及其Fi的基因組DNA從2-3周幼苗的葉片中用 CTAB 法提取(Fulton et al. ,1995) <JnDel 標(biāo)記的 PCR 反應(yīng)體系（20yL):DNA 模板 HOng.yL-1) 5.0yL，10XPCR Buffer(含Mg2+)2.0yL，High Pure dNTPs(2.5mM)2.0yL，上下游引物（ΙΟμΜ) 各 1.0yL，EasyTaq DNA Polymerase(5U · yrqO.SyUdd^OSJyl^PCR 反應(yīng)程序：94°C 預(yù)變 5min;94°C 變性 45s，58°C 退火 45s，72°C 延伸 458,35個(gè)循環(huán)；72°(：延伸1〇1^11;保存溫度4°(：。 PCR產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離鑒定，然后在凝膠成像儀上觀察照相，并記錄電 泳結(jié)果。
[0045] InDel標(biāo)記引物(Ty-3-InDel)在抗病親本P1、感病親本P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，證實(shí)其在 雙親間能夠擴(kuò)增出多態(tài)性(在P1中擴(kuò)增出510bp的特異條帶，在P2中擴(kuò)增出260bp的特異條 帶，在Fi中同時(shí)擴(kuò)增出510bp和260bp兩條特異條帶），該標(biāo)記可靠性高、穩(wěn)定性最好、且不需 要酶切。該引物的擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，具體引物序列如下：
[0046] Se