一種調(diào)節(jié)啟動(dòng)子強(qiáng)度和表達(dá)模式的特異dna分子的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)節(jié)啟動(dòng)子強(qiáng)度和/或表達(dá)模式的特異 DNA分子。
【背景技術(shù)】
[0002] 通過基因操作優(yōu)化或重構(gòu)細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的代謝工程(Metabolic Engineering)和 合成生物學(xué)（Synthetic Biology)研究是現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域非常重要的前沿方向。在代謝 途徑改造中，在不影響宿主細(xì)胞生理功能的前提下實(shí)現(xiàn)目標(biāo)代謝產(chǎn)物合成的最大化，常常 需要對(duì)多個(gè)基因的表達(dá)水平進(jìn)行協(xié)同調(diào)控，因此利用合成生物學(xué)手段設(shè)計(jì)和構(gòu)建不同強(qiáng)度 的表達(dá)調(diào)控元件，適時(shí)適量調(diào)控基因的表達(dá)水平，可以提高代謝途徑改造的可預(yù)測(cè)性，從而 簡(jiǎn)化改造過程，提高代謝工程改造的效率，同時(shí)也為構(gòu)建復(fù)雜的生物學(xué)系統(tǒng)提供元件基礎(chǔ) 和技術(shù)支持。啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵元件，對(duì)其進(jìn)行改造是調(diào)控基因表達(dá)水平和表 達(dá)模式最為直接和有效的手段。
[0003] 相對(duì)于原核生物，真核生物的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制更為復(fù)雜，實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)水平和 表達(dá)時(shí)序的人工精確調(diào)控更為困難。酵母菌，尤其是釀酒酵母，是研究真核生物生物學(xué)特性 及其變化規(guī)律的理想模式系統(tǒng)，對(duì)其基因表達(dá)調(diào)控元件的研究將為其他真核生物基因表達(dá) 的精確調(diào)控提供理論參考，同時(shí)，酵母菌也是生物技術(shù)領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛的微生物，是生產(chǎn) 大宗化學(xué)品、能源產(chǎn)品、精細(xì)化學(xué)品和生物活性物質(zhì)的重要底盤細(xì)胞。但在對(duì)酵母菌進(jìn)行代 謝工程改造中，基因的組成型高表達(dá)或代謝產(chǎn)物的過早積累會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生生理負(fù)擔(dān)，影響 最終的產(chǎn)能水平和產(chǎn)能效率，因此對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行分時(shí)相調(diào)控具有十分重要的意義。
[0004] 在酵母菌中常用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GALlp實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的分時(shí)相調(diào)控，但誘導(dǎo)型啟動(dòng) 子GALlp的誘導(dǎo)表達(dá)強(qiáng)度和敏感性比較低，不能快速啟動(dòng)目標(biāo)基因的表達(dá)；同時(shí)受葡萄糖的 嚴(yán)格阻遏。在實(shí)際的發(fā)酵工業(yè)中葡萄糖是最為常用的發(fā)酵原料，發(fā)酵體系中葡萄糖的存在 將嚴(yán)格阻遏誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GALlp調(diào)控下的基因表達(dá)，給發(fā)酵工藝的控制帶來(lái)困難，從而限制 了該誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)際應(yīng)用?？梢?，對(duì)啟動(dòng)子主要功能區(qū)進(jìn)行理性設(shè)計(jì)和改造，實(shí)現(xiàn)啟動(dòng) 子強(qiáng)度和表達(dá)模式的多樣化，對(duì)滿足酵母菌代謝工程改造具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何調(diào)節(jié)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GALlp強(qiáng)度和/或表達(dá)模式。
[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明首先提供了一種特異DNA分子甲。
[0007] 本發(fā)明所提供的特異DNA分子甲，為DNA分子I、DNA分子Π、DNA分子m、DNA分子IV 或DNA分子V。
[0008] 所述DNA分子I自上游至下游依次可包括:RREP區(qū)段、PCA區(qū)段、UASGal4pBS區(qū)段和 GALlpAm2 區(qū)段。
[0009] 所述DNA分子Π 自上游至下游依次可包括:所述RREP區(qū)段、所述UASGal4pBS區(qū)段和 所述GALlpAm2區(qū)段。
[0010] 所述DNA分子m自上游至下游依次可包括:所述PCA區(qū)段、所述UASGal4pBS區(qū)段和 所述GALlpAm2區(qū)段。
[0011] 所述DNA分子IV自上游至下游依次可包括:所述UASGal4pBS區(qū)段和所述GALlpAm2 區(qū)段。
[0012] 所述DNA分子V自上游至下游依次可包括:所述UASGal4pBS區(qū)段和GALlp區(qū)段。 [0013] 所述RREP區(qū)段可為順式調(diào)控元件RRPE。所述PCA區(qū)段可為順式調(diào)控元件PAC。所述 UASGal4pBS區(qū)段可為酵母轉(zhuǎn)錄因子Gal4結(jié)合位點(diǎn)的序列。所述GALlpAm2區(qū)段可為敲除 GALlp啟動(dòng)子中的兩個(gè)阻遏蛋白結(jié)合序列的序列。所述GALlp區(qū)段可為編碼GALlp啟動(dòng)子的 序列。
[0014] 所述RREP區(qū)段可為序列表中序列6自5'末端起第4至12位所示的DNA序列。
[0015] 所述PCA區(qū)段可為序列表中序列6自5'末端起第19至27位所示的DNA序列。
[0016] 所述UASGal4pBS區(qū)段可為序列表中序列6自5'末端起第31至208位所示的DNA序 列。
[0017] 所述GALlpAm2區(qū)段可為序列表中序列6自5'末端起第215至660位所示的DNA序 列。
[0018] 所述GALlp區(qū)段可為序列表中序列4自5'末端起第185至648位所示的DNA序列。 [0019] 所述DNA分子I可為如下al)或a2)或a3)所示的DNA分子：
[0020] al)核苷酸序列是序列表中序列6所示的DNA分子；
[0021] a2)與al)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性的DNA分子；
[0022] a3)在嚴(yán)格條件下與al)或a2)限定的核苷酸序列雜交的DNA分子。
[0023] 所述DNA分子IV可為如下dl)或d2)或d3)所示的DNA分子：
[0024] dl)核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；
[0025] d2)與dl)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性的DNA分子；
[0026] d3)在嚴(yán)格條件下與dl)或d2)限定的核苷酸序列雜交的DNA分子。
[0027] 所述DNA分子V可為如下el)或e2)或e3)所示的DNA分子：
[0028] el)核苷酸序列是序列表中序列4所示的DNA分子；
[0029] e2)與el)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性的DNA分子；
[0030] e3)在嚴(yán)格條件下與el)或e2)限定的核苷酸序列雜交的DNA分子。
[0031]為解決上述問題，本發(fā)明還提供了一種特異DNA分子乙。
[0032]本發(fā)明所提供的特異DNA分子乙，自上游至下游依次可包括:所述特異DNA分子甲 和ADHlt區(qū)段。
[0033] 所述ADHlt區(qū)段可為序列表中序列1所示的DNA分子。
[0034] 所述特異DNA分子乙可為如下Π )至f9)任一所示的DNA分子：
[0035] Π )核苷酸序列是序列表中序列7所示的DNA分子；
[0036] f2)與Π )限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性的DNA分子；
[0037] f3)在嚴(yán)格條件下與Π )或f2)限定的核苷酸序列雜交的DNA分子；
[0038] f4)核苷酸序列是序列表中序列8所示的DNA分子；
[0039] f 5)與f 4)限定的核苷酸序列具有75 %或75 %以上同一性的DNA分子；
[0040] f6)在嚴(yán)格條件下與f4)或f5)限定的核苷酸序列雜交的DNA分子；
[0041] f7)核苷酸序列是序列表中序列9所示的DNA分子；
[0042] f 8)與f 7)限定的核苷酸序列具有75 %或75 %以上同一性的DNA分子；
[0043] f9)在嚴(yán)格條件下與f7)或f8)限定的核苷酸序列雜交的DNA分子。
[0044]含有所述特異DNA分子甲的重組質(zhì)粒甲也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0045]含有所述特異DNA分子乙的重組質(zhì)粒乙也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0046] 所述重組質(zhì)粒甲或所述重組質(zhì)粒乙可為重組質(zhì)粒YCp-UGGA、重組質(zhì)粒YCp-UGGA Δ m2 或重組質(zhì)粒 YCp-UrpGGA Δ m2。
[0047] 所述重組質(zhì)粒YCp-UGGA具體可為向穿梭載體YCp50的限制性內(nèi)切酶SacI和Sail的 酶切位點(diǎn)之間插入核苷酸序列是序列表中的序列1所示的DNA分子，限制性內(nèi)切酶BamHI和 Sa c I的酶切位點(diǎn)之間插入核苷酸序列是序列表中的序列2所示的DNA分子，限制性內(nèi)切酶 EcoRI和BamHI的酶切位點(diǎn)之間插入核苷酸序列是序列表中的序列4所示的DNA分子得到的 重組質(zhì)粒。
[0048] 所述重組質(zhì)粒YCp-UGGA Δ m2具體可為向穿梭載體YCp50的限制性內(nèi)切酶SacI和 Sa 11的酶切位點(diǎn)之間插入核苷酸序列是序列表中的序列1所示的DNA分子，限制性內(nèi)切酶 BamHI和SacI的酶切位點(diǎn)之間插入核苷酸序列是序列表中的序列2所示的DNA分子，限制性 內(nèi)切酶EcoRI和BamHI的酶切位點(diǎn)之間插入核苷酸序列是序列表中的序列5所示的DNA分子 得到的重組質(zhì)粒。
[0049] 所述重組質(zhì)粒YCp-URpGGA Δ m2具體可為向重組質(zhì)粒YCp-UGGA Δ m2的限制性內(nèi)切酶 EcoRI和BamHI的酶切位點(diǎn)之間插入核苷酸序列是序列表中的序列6所示的DNA分子得到的 重組質(zhì)粒。
[0050] 所述特異DNA分子甲、所述特異DNA分子乙、所述重組質(zhì)粒甲或所述重組質(zhì)粒乙在 啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0051 ]所述目的基因具體可為綠色熒光蛋白的編碼基因。
[0052]所述綠色熒光蛋白的編碼基因可如序列表中的序列2所示。
[0053]為解決上述問題，本發(fā)明還提供了表達(dá)目的基因的方法。
[0054]本發(fā)明所提供的表達(dá)目的基因的方法，具體可為方法一，包括如下步驟:采用所述 特異DNA分子甲啟動(dòng)目的基因的表達(dá)。
[0055] 本發(fā)明所提供的表達(dá)目的基因的方法，具體可為方法二，包括如下步驟:將目的基 因插入所述重組質(zhì)粒甲中的所述特異DNA分子甲的下游，由所述特異DNA分子甲啟動(dòng)所述目 的基因的表達(dá)。
[0056] 如下A1)或A2)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0057] A1)-種表達(dá)目的基因的方法，包括如下步驟:將目的基因插入所述特異DNA分子 乙中的所述特異DNA分子甲和所述ADHlt區(qū)段之間，由所述特異DNA分子甲啟動(dòng)所述目的基 因的表達(dá)；
[0058] A2)-種表達(dá)目的基因的方法，包括如下步驟:將目的基因插入所述重組質(zhì)粒乙中 的所述特異DNA分子甲和所述ADHlt區(qū)段之間，由所述特異DN