與巖沙?？舅靥禺愋越Y(jié)合的高親和力適配體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一條基于改良的磁珠 SELEX技術(shù)篩選獲得的 與巖沙?？舅靥禺愋越Y(jié)合的高親和力適配體，為海產(chǎn)品中巖沙海葵毒素的快速檢測、水 體中毒素的去除、樣品中痕量毒素的分離富集，以及中和或拮抗巖沙海葵毒素毒性藥物的 制備奠定了基礎(chǔ)。
【背景技術(shù)】
[0002] 巖沙海葵毒素(palyt〇xin，PTX)是一種從海葵屬軟珊瑚中分離獲得的海洋生物毒 素，是迄今為止已知的毒性最強烈的海洋生物毒素之一。PTX常存在于熱帶和亞熱帶的水域 中，并可通過水生食物鏈在魚類或蟹類體內(nèi)蓄積，人類誤食這些染毒的水產(chǎn)品后會引起食 物中毒。中毒癥狀主要表現(xiàn)為呼吸困難、呼吸衰竭、運動失調(diào)、四肢無力、消化道廣泛出血、 休克或死亡等。PTX毒性強烈，作用速度極快，對家兔的半數(shù)致死量LD50為25ng/kg，從中毒 到死亡的時間僅3~5分鐘。PTX中毒沒有特效藥，臨床目前主要是采取催吐、洗胃和活性炭 胃內(nèi)毒素吸附等有限的治療的手段。隨著有害赤潮的不斷加劇以及人類對海鮮產(chǎn)品愈發(fā)的 熱衷，加大對海洋生物毒素的監(jiān)控力度，加強海產(chǎn)品檢測新技術(shù)的開發(fā)，特別是研究建立特 異性強、靈敏度尚、現(xiàn)場尚效快速的巖沙海癸毒素的檢測方法，對于進一步完善我國食品衛(wèi) 生檢驗標(biāo)準(zhǔn)體系，提高食品的衛(wèi)生質(zhì)量，保障人們生命安全，具有十分重要的重要意義。
[0003] 目前對巖沙海葵毒素檢測最權(quán)威的是小鼠生物法，但這種方法特異性差、靈敏度 低，同時涉及倫理道德等問題已不主張使用。高效液相色譜法(HPLC)是毒素檢測中運用最 為廣泛、技術(shù)比較完善的一種檢測方法，可以和多種儀器聯(lián)和使用，大大提高了檢測的靈敏 度和特異性。然而，該方法耗時長、樣品前處理繁瑣、儀器昂貴等問題而難以普及。免疫分析 法特別是酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)是一種靈敏度高、特異性好、可實現(xiàn)現(xiàn)場快速分析的方 法，在食品安全、生物毒素檢測領(lǐng)域已較為廣泛地應(yīng)用。該技術(shù)的核心是制備高靈敏性和高 特異性的抗體，但是由于抗體的制備過程復(fù)雜，儲存條件苛刻，穩(wěn)定性差等問題很大程度上 限制了該技術(shù)在PTX檢測中的應(yīng)用。
[0004] 適配體是一種功能類似于抗體的單鏈DNA或RNA分子，是通過體外篩選技術(shù)SELEX (指數(shù)富集性配體系統(tǒng)進化，Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment)從寡核酸文庫中獲得的核苷酸序列。與抗體相比，適配體作為一種新型的分子 識別元件具有明顯的優(yōu)越勢，例如：不需要免疫動物可體外合成，易于標(biāo)記和修飾，免疫原 性低，穩(wěn)定性高，組織滲透性強等。這些特性使適配體在分析診斷領(lǐng)域，醫(yī)藥研究領(lǐng)域得到 廣泛應(yīng)用。近年來已有學(xué)者將適配體應(yīng)用于海洋生物毒素檢測領(lǐng)域，同生物傳感器平臺結(jié) 合，研發(fā)了許多快速、新穎的檢測方法而備受關(guān)注。
[0005] 然而，關(guān)于與PTX特異性結(jié)合的分子識別探針，與PTX特異性結(jié)合的高親和力適配 體，以及該適配體的親和常數(shù)鑒定、優(yōu)化及應(yīng)用尚無相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一條與巖沙?？舅靥禺愋越Y(jié)合的高親和力適配體及其 應(yīng)用。本發(fā)明的第二目的是提供上述適配體在制備樣品中痕量巖沙?？舅氐姆蛛x富集試 劑中、在制備巖沙海葵毒素檢測試劑或試劑盒中、在制備預(yù)防或治療巖沙?？舅刂卸舅?物中，以及在制備去除水體中巖沙?？舅刂苿┲械榷喾矫娴膽?yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的主要技術(shù)方案是:基于改良的磁珠 SELEX技術(shù)篩選得到一條與巖沙?？?毒素特異性結(jié)合的高親和力適配體。該單鏈DNA適配體可用于樣品中痕量PTX的分離富集， 食品中PTX的分析檢測，中和或拮抗PTX藥物的制備，以及水體中PTX的去除。
[0008] 本發(fā)明的第一方面，是提供了一條與巖沙海葵毒素(PTX)特異性結(jié)合的高親和力 適配體，具有如下所示的通式：
[0009] 57 -ACCGACCGTGCTGGACTCA-N42-ACTATGAGCGAGCCTGGCG-37 ；
[0010] 其中，N代表堿基A，T，C，G中任一個，N42代表長度為42bp的隨機序列。
[0011]優(yōu)選的，所述單鏈DNA適配體選自以下序列中的任一條： [0012]APTptx13WSEQIDNO:2K*;
[0013] ΑΡΤΡΤΧ5:如SEQ ID N0:1 所示；
[0014] APTPTX39JnSEQIDN0:8K*;
[0015] APTPTXl4JnSEQIDN0:3K*;
[0016] APTPTX18JnSEQIDN0:4K*。
[0017] 本發(fā)明的第二方面，是提供了上述適配體在制備樣品中PTX的分離富集試劑中的 應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明還提供了上述適配體在制備巖沙?？舅貦z測試劑、試劑盒或傳感器中的 應(yīng)用。所述的試劑、試劑盒或傳感器可用于快速檢測水體或水產(chǎn)品中的PTX。
[0019] 本發(fā)明還提供了上述適配體在制備預(yù)防或治療巖沙海葵毒素中毒藥物中的應(yīng)用。 所述的藥物也為中和巖沙?？舅囟拘缘乃幬?、或為巖沙?？舅剞卓箘┑取Ｋ龅乃幬?可以緩解、治愈巖沙?？舅刂卸緦?dǎo)致的呼吸困難、呼吸衰竭、驚厥、痙攣、運動失調(diào)、嗜睡、 四肢無力、虛脫、嘔吐、消化道廣泛出血、休克、死亡等癥狀。
[0020] 本發(fā)明還提供了上述適配體在制備去除水體或水產(chǎn)品中巖沙海葵毒素制劑中的 應(yīng)用。所述的制劑可以完全去除水體或水產(chǎn)品中的巖沙海葵毒素，或者降低水體或水產(chǎn)品 中巖沙?？舅氐暮渴蛊溥_到聯(lián)合國衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧農(nóng)組織規(guī)定及推薦的標(biāo)準(zhǔn)以 下。
[0021 ]本發(fā)明鑒于PTX穩(wěn)定性高，水溶性好的結(jié)構(gòu)特點，設(shè)計了基于改良的磁珠 SELEX技 術(shù)，篩選得到與PTX高親和力、強特異性結(jié)合的單鏈DNA適配體。這些適配體作為與PTX特異 性結(jié)合的分子識別探針，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性強、免疫原性低、成本低、易制備、 修飾和標(biāo)記等優(yōu)勢?？捎糜跇悠分泻哿縋TX的分離富集，食品中PTX的分析檢測，中和巖沙海 葵毒素藥物的制備，拮抗巖沙?？舅厮幬锏闹苽?，以及水體中毒素的去除。
[0022]因此，本發(fā)明的適配體面向?qū)嶋H應(yīng)用具有巨大的潛力。
【附圖說明】
[0023]圖1巖沙?？舅毓潭ㄖ留然揎椀拇胖楸砻娴氖疽鈭D。
[0024]圖2是基于磁珠 SELEX技術(shù)PTX適配體篩選的示意圖。
[0025] 圖3是每一輪篩選中適配體與靶分子PTX的結(jié)合率圖。
[0026] 圖4基于生物膜干涉技術(shù)測定適配體親和力的擬合曲線圖。
[0027]圖5是適配體ΑΡΤρτχ13親和力和特異性鑒定圖。
【具體實施方式】
[0028]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0029]下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人， 分子克?。簩嶒炇抑改希∟ew York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的 條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非 另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外， 任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方 法與材料僅作示范之用。
[0030] 實施例1.巖沙?？舅卦隰然揎椀拇胖楸砻娴墓潭?br>[0031] PTX與磁珠的偶聯(lián)示意圖如圖1所示，具體過程為：（a)配制25mM的MES溶液，調(diào)節(jié)pH 至6.0，取400yL、30mg/mL羧基修飾的磁珠用pH 6.0的MES溶液清洗3-5遍。分別加入500yL、 50mg/mL新鮮制備的EDC和NHS溶液于上述漂洗過的磁珠中，充分混勻，室溫低速旋轉(zhuǎn)孵育 30min。孵育結(jié)束后，將裝有磁珠的離心管放置于強磁鐵上吸附5min，移去上清液，得到活化 的磁珠。（b)取200yL活化的磁珠，加入500yL、20yg/mL的PTX溶液，室溫低速旋轉(zhuǎn)孵育60min。 孵育結(jié)束后，未結(jié)合到磁珠上的PTX用MES溶液沖洗，磁性分離回收上清液。在PTX-磁珠復(fù)合 物中加入200yL、0.5M乙醇胺封閉磁珠表面未耦合的羧基，以提高篩選的效率。封閉結(jié)束后， 用篩選緩沖液(2〇11111^8-!1(：1、10〇1111恥(：1、211111%(：12和511111((：14!17.5)漂洗數(shù)次后，加 入200yL的篩選緩沖液，4 °C保存，作為正向篩選的磁珠。上清液中未固化至磁珠表面的PTX 用紫外分光光度計測含量，計算出耦合效率為91.7%。（c)在剩余的200yL活化的磁珠中入 200yL、0.5M乙醇胺溶液，室溫低速旋轉(zhuǎn)孵育60min。孵育結(jié)束后，用篩選緩沖液漂洗數(shù)次，加 入200yL的篩選緩沖液，4 °C保存，用作反向篩選。
[0032]實施例2.隨機ss