一種扇貝足絲蛋白體外表達(dá)方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物材料領(lǐng)域，特別是一種扇貝足絲蛋白體外表達(dá)方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 浩瀚的海洋是一座巨型生物寶庫(kù)，包含著成千上萬(wàn)的已知或未知的陸生生物所不 具有的獨(dú)特的生物資源。許多海洋生物在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中形成了各種各樣的黏附作用以 適應(yīng)和對(duì)抗動(dòng)態(tài)的海洋環(huán)境，這在潮間帶的生物類群中表現(xiàn)尤為突出。海洋無(wú)脊椎動(dòng)物可 暫時(shí)或永久性的吸附于各種生物或物體表面，它們進(jìn)化出了獨(dú)特的黏附機(jī)制以促進(jìn)吸附作 用。海洋多毛類Phragmatopoma ca 1 ifornica能夠用分泌出的蛋白黏附劑混合海底的貝殼 及沙粒制造保護(hù)性的管子。這種黏附劑可以廣泛黏附海洋中的多種材料。刺參Holothuria forskali在受到驚嚇時(shí)可以防御性地排出許多管狀物(Cuvierian tubules)，生化鑒定表 明這些管狀物所含蛋白質(zhì)與糖類的比例為3比2,并且所含的不溶性蛋白比例很大?？扇苄?的蛋白包括十種富含酸性氨基酸的蛋白，分子量從17到220kD。藤壺直接永久性地黏附于海 洋水下基質(zhì)表面(船體，采油平臺(tái)及管道等）。藤壺幼蟲的初始黏附是通過(guò)氧醌連接將二羥 苯丙氨酸（多巴，Dopa)組裝在一起，這也包括海洋貽貝Mytilus spp.的黏附蛋白，而成體的 黏合劑實(shí)質(zhì)上與幼體有很大差別，其中富含絲氨酸、蘇氨酸和甘氨酸。這三組蛋白質(zhì)中疏水 性和親水性的殘基交替排列，這些基序被認(rèn)為是在海水中蛋白的裝配中起著重要的作用。 海水及淡水貽貝科黏附蛋白與藤壺的黏合蛋白有所不同，因?yàn)樗陌被峄蚺c藤壺 不同（主要以含有大量多酚蛋白成分為特征），貽貝黏附蛋白含有大量的修飾過(guò)的3，4_ Dopa，以及對(duì)特定氨基酸的化學(xué)修飾(羥基化）。目前從紫貽貝M.edulis中已鑒定出至少十 種與黏附作用相關(guān)的蛋白，這也反映出了對(duì)這種生物黏附結(jié)構(gòu)研究的得心應(yīng)手，以及其作 為仿生學(xué)研究目標(biāo)的趨勢(shì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種扇貝足絲蛋白體外表達(dá)方法及應(yīng)用，以提供生物仿生 研究思路，為生物材料拓展新的研究方向。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明公開了一種扇貝足絲蛋白體外 表達(dá)方法，其特征在于，包括了蛋白的質(zhì)譜鑒定，具體操作步驟如下：
[0005] 扇貝足絲蛋白的采集:將市售的櫛孔扇貝培養(yǎng)在19°C恒溫循環(huán)海水的條件下，每 隔一天用干凈手術(shù)刀片對(duì)黏附在培養(yǎng)籠中的足絲纖維蛋白進(jìn)行刮取，進(jìn)行足絲全蛋白的收 集，收集到的足絲纖維置于-20°c冰箱內(nèi)保存；
[0006] 扇貝足絲蛋白的粗提取:將收集到的扇貝足絲蛋白干粉在液氮中研磨成粉末，分 裝到1.5mL EP管中，加入30yL 5 %醋酸-鹽酸胍裂解液，37 °C金屬浴抽提足絲蛋白30分鐘， 然后于20,000g 4°C高速離心30分鐘，取上清，作為扇貝足絲黏附蛋白粗提液；
[0007]蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定:將提取的蛋白質(zhì)透析濃縮后按照每100yg蛋白質(zhì)底物加入3.3yg 酶的比例加入lyg/uL的Trypsin，37°C水浴24小時(shí)，利用Q-Exactive質(zhì)譜儀檢測(cè)消化后得到 的肽段溶液中的肽段信號(hào)，以實(shí)驗(yàn)室自己建立的櫛孔扇貝足轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)為模板，對(duì)質(zhì)譜 檢測(cè)到的肽段序列進(jìn)行搜索；
[0008] 體外表達(dá):基于足轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)應(yīng)的0RF，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，利用PCR技術(shù)獲得目的 片段，構(gòu)建其中針對(duì)第一段重復(fù)序列的體外重組表達(dá)系統(tǒng)，DNA測(cè)序驗(yàn)證體外重組表達(dá)系統(tǒng) 構(gòu)建成功，之后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主菌中進(jìn)行體外重組表達(dá)。
[0009] 其中，足絲蛋白中富含PCGGXC(X為任意氨基酸殘基)及CVC片段的多肽序列。
[0010] 其中，重組表達(dá)后的蛋白提取方法如下：
[0011] 將菌體超聲破碎，之后沉淀用ros洗兩次后1M尿素洗兩次，將沉淀用20mM Tris-HCl/6M(pH 8.0)尿素溶解，室溫結(jié)合Nickels Beads(Qiagen)3小時(shí)，20mM Tris-HCl/6M尿 素 (pH 8.0)wash，5%HAc/6M尿素 (pH 3.6)洗脫，將洗脫后的樣品透析到超純水中，冷凍干 燥制備蛋白質(zhì)樣品。
[0012] 本發(fā)明同時(shí)公開了上述扇貝足絲蛋白在醫(yī)用材料制備領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明亦同時(shí)公開了上述扇貝足絲蛋白在紡織材料制備領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明具有 以下有益效果：
[0014] 本發(fā)明通過(guò)對(duì)提取的扇貝足絲纖維蛋白組分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了一種扇貝足絲蛋白 中的關(guān)鍵組分，并利用基因克隆技術(shù)從扇貝基因組中獲得了該基因重復(fù)序列部分的序列， 建立了該基因重復(fù)序列片段的體外重組表達(dá)，獲得了高效的體外重組表達(dá)。并對(duì)體外重組 表達(dá)蛋白進(jìn)行了分離純化及性質(zhì)研究。結(jié)果顯示該組分具有在溶液中折疊成為折疊片為 主的結(jié)構(gòu)，提示該組分是一種極具開發(fā)潛力的海洋生物蛋白材料，在醫(yī)用材料等多個(gè)領(lǐng)域 具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中PCR結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0016] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中蛋白質(zhì)的重組表達(dá)及初步純化后蛋白質(zhì)的電泳圖，其中條 帶1為Marker蛋白；條帶2為重組表達(dá)的全菌;條帶3為純化后的蛋白。
[0017] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中重復(fù)蛋白序列在不同pH下，在溶液中的構(gòu)象變化圖，其中 黑色線為pH=5時(shí)測(cè)得結(jié)果，灰色線為pH=8時(shí)測(cè)得結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0019] 實(shí)施例1
[0020] 本發(fā)明公開了一種扇貝足絲蛋白體外表達(dá)方法，包括了蛋白分析和體外擴(kuò)增兩個(gè) 步驟，其中蛋白分析的具體操作步驟如下：
[0021] 扇貝足絲蛋白的采集:將市售的櫛孔扇貝培養(yǎng)在19°C恒溫循環(huán)海水的條件下，每 隔一天用干凈手術(shù)刀片對(duì)黏附在培養(yǎng)籠中的足絲纖維蛋白進(jìn)行刮取，進(jìn)行足絲全蛋白的收 集，收集到的蛋白置于-20°C冰箱內(nèi)保存；
[0022] 扇貝足絲蛋白的粗提取:將收集到的扇貝足絲蛋白干粉在液氮中研磨成粉末，分 裝到1.5mL EP管中，加入30uL 5 %醋酸-鹽酸胍裂解液，37 °C金屬浴抽提足絲蛋白30分鐘， 然后于20,000g 4°C高速離心30分鐘，取上清，作為扇貝足絲黏附蛋白粗提液；
[0023]蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定:將提取的蛋白質(zhì)透析濃縮后按照每100ug蛋白質(zhì)底物加入3.3yg 酶的比例加入lyg/uL的Trypsin，37°C水浴24小時(shí)，利用Q-Exactive質(zhì)譜儀檢測(cè)消化后得到 的肽段溶液中的肽段信號(hào)。以實(shí)驗(yàn)室自己建立的櫛孔扇貝足轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)為模板，對(duì)質(zhì)譜 檢測(cè)到的肽段序列進(jìn)行搜索。在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲得了一條富含重復(fù)序列的蛋白質(zhì)陽(yáng)性 鑒定結(jié)果。
[0024]其中體外擴(kuò)增包括了以下步