一種串聯鴨α、γ干擾素基因及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域的基因融合表達，具體涉及一種串聯鴨α、γ干擾素基因 及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 干擾素（interferon，IFN)是一類在同種細胞上具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)等 多種生物學功能的糖蛋白。1957年，由Isaacs等首次發(fā)現。國際干擾素命名委員會根據干擾 素的抗原特性和分子結構的差異，將干擾素分為2個型。α干擾素（IFN-α)屬I型干擾素，在 1995年，由Schultz等成功克隆并表達，隨后，研究者相繼克隆出北京鴨、番鴨、麻鴨和紹興 鴨的IFN-a基因。IFN-a基因由576個核苷酸構成，共編碼191個氨基酸，含有信號肽。不同品 種間的鴨a干擾素基因相對較保守，核苷酸序列同源性在99.5 %~100 %之間。IFN-a主要參 與抗病毒、抗腫瘤過程，研究表明，重組鴨IFN-a對DHV有一定的治療作用，可以減少乙肝病 毒cccDNA向pgRNA的轉錄。此外，重組鴨a干擾素對流感病毒、新城疫病毒和呼腸孤病毒也有 一定的抑制作用。γ干擾素（IFN-γ )屬于II型干擾素，1999年，Schultz等證明了鴨IFN-γ 開放閱讀框含有495個堿基，可編碼164個氨基酸。IFN-γ可誘導病毒感染的細胞表達病毒 抗原，增加免疫系統識別和殺傷感染細胞的能力，還可作為免疫佐劑參與機體的免疫反應。 目前，關于鴨重組干擾素的研究仍局限于對單個干擾素的表達及活性研究，尚無將兩個鴨 干擾素基因串聯表達并檢測其抗病毒活性的例子。
[0003] 禽流感(Avian influenza,AI)是由流感病毒(Avian influenza virus)引起的急 性高度接觸性傳染病，臨床表現為嚴重的發(fā)病和死亡，或輕度呼吸道感染，或無癥狀。1878 年首次在意大利發(fā)現，目前，幾乎已遍布世界各地，給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經濟損失。流感 在家禽中以雞和火雞的易感性最高，鴨、鵝和鵪鶉等動物也能感染，1956年英國科學家首次 證明甲型流感病毒能夠感染鴨。近年來，在我國部分省份不斷出現鴨感染流感病毒的現象， 嚴重阻礙養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。
[0004] 鴨瘟(Duck plague，DP)是鴨的一種急性敗血性傳染病，臨床特征主要為體溫升 高，下痢，兩腳發(fā)軟無力，部分發(fā)病鴨表現為頭頸部腫大。該病傳播迅速，發(fā)病率高，鴨群感 染鴨瘟病毒后，往往引起大批量死亡。鴨瘟主要通過疫苗預防，若出現發(fā)病，可用聚肌胞(簡 稱Poly I: C，屬A級干擾素誘生劑)肌肉注射，效果顯著。

【發(fā)明內容】

[0005] 為克服上述現有技術中存在的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種串聯 鴨α、γ干擾素基因。本發(fā)明所述的串聯鴨α、γ干擾素基因易于生產，成本低，活性高，具有 疊加的鴨IFN-a、IFN- γ抗病毒功能，對流感和鴨瘟均有很好的治療效果。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述串聯鴨α、γ干擾素基因的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述表達串聯鴨α、γ干擾素基因的原核表達質粒 pET32a-IFNa-linker-IFNy。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述原核表達質粒pET32a-IFNa-linker-IFNy的制 備方法。
[0009] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述串聯鴨α、γ干擾素基因的應用。
[0010]本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現：一種串聯鴨〇、γ干擾素基因（1?_-linker-IFNy )，其核苷酸序列如下：
[0011] Ttctcctgcagccccctgcgcctccacgacagcgccttcgcctgggacagcctccagctcctccgcaacatggctcc cagccccacacagccctgcccgcagcaacacgcgccttgctccttcccggacaccctcctggacaccaacgacacgc agcaagccgcacacaccgccctccacctcctccaacacctcttcgacaccctcagcagccccagcacccccgcgcac tggctccacaccgcacgccacgacctcctcaaccagcttcagcaccacatccaccacctcgagcgctgcttcccagc cgacgccgcgcgcctccacaggcgagggccccgcaaccttcacctcagcatcaacaagtacttcggctgcatccaac acttcctccagaaccacacctacagcccctgcgcatgggaccacgtccgcctcgaggctcacgcctgcttccagcgc atccaccgcctcacccgcaccatgcgcggtggaggaggctctggtggaggcggtagcggaggcggagggtcgatgac ttgccagacctactgcttgtttgttctctctgtcatcatgatttattttggatgttctggaagtgctttatttctag gtcaacttcaaaatgacatagacaaactgaaagctgattttaatgcaagtaattcggatgtagctgatggcaatcct gtttttatagagaaagtgaaaaactggacagagagaaatgaaaaaaggatcatactgagccagattgttaccctgta cttggaaatgctaaagaaaactgacatgtcaaagccacacatcaaaaatttatctgagcagctcaatactctgagaa ataccctttccaatgactacaagaagttcagagacctcgtggaactgtcaaaccttcagctgactggcttgaaaatc caacgcaaggctgtgagtgagctgttcagtgtcttacagaaactggtggagacttcgacttccaaaaggaaaaggag ccagtctccaaagagatgcagatgttaa〇
[0012] 所述的串聯鴨α、γ干擾素基因是應用重疊延伸PCR(gene splicing by overlap eXtenSi〇n，S0E-PCR)方法，將去除信號肽的鴨α、γ干擾素基因通過一疏水性柔性氨基酸接 頭（linker)(G4S)3連接，然后將串聯好的鴨IFNa-linker-IFNy基因克隆至原核表達載體 pET32a( + )上，構建成重組表達載體pET32a-IFNa-linker-IFNγ，通過BL21系統進行表達， 鑒定純化后，分別在體內和體外檢測其抗流感和鴨瘟活性。
[0013]上述的串聯鴨α、γ干擾素基因的制備方法，具體包括以下步驟：
[0014] (1)引物的設計與合成
[0015] 根據Genbank中提供的鴨IFN-a和IFN-γ序列，分別設計2對引物IFNa-Fl、IFNa-Rl 和IFN γ -FI、IFN γ -R1，用于擴增去除信號肽后的鴨IFN-a基因（核苷酸序列信息如SEQ ID N0:2)和IFN-γ基因（核苷酸序列信息如SEQ ID N0:3)，并分別在IFN-a上游和IFN-γ下游 加入BamH I和Hind III兩個酶切位點；同時，設計用于S0E-PCR的引物IFNa-R2和IFNy -F2， 其中，IFNa-R2中含有部分linker序列，IFN γ-F2中含有與IFNa-R2互補的linker序列；引物 序列如下:去除信號肽后IFN-a的擴增引物：
[0016] IFNa-Fl:CGGGATCC TTCTCCTGCAGCCCCCTGCG;
[0017] IFNa-Rl：CCCAAGCTTTTAGCGCATGGTGCGGGTGA；
[0018] IFNa-R2：
[0019] CTCCGCTACCGCCTCCACCAGAGCCTCCTCCACCGCGCATGGTGCGGGTG;去除信號肽后IFN- γ 的擴增引物：
[0020] IFN γ-FI：CGGGATCC TCTGGAAGTGCTTTATTTCT；
[0021] IFN γ-F2：
[0022] TCTGGTGGAGGCGGTAGCGGAGGCGGAGGGTCGTCTGGAAGTGCTTTATTTCT；
[0023] IFN γ-R1:CCCAAGCTTTTAACATCTGCATCTCTTTGGA;
[0024] (2)鴨α、γ干擾素基因的擴增
[0025] 從鴨外周血淋巴細胞中抽提RNA，經反轉錄后，得到擴增鴨α、γ干擾素基因的cDNA 模板；以此cDNA為模板，分別用上述引物IFNa-Fl、IFNa-Rl和正以41、正"-1?1，擴增出所 需鴨a、γ干擾素目的基因；
[0026] (3)S0E_PCR擴增串聯鴨α、γ干擾素基因（鴨IFNa-linker-IFNy基因）
[0027] 該過程主要包含3個PCR反應，第一個PCR:以IFNa-Fl和IFNa-R2為引物擴增出含有 部分1 inker序列的IFN-a，以IFN γ -F2和IFN γ -R1為引物擴增出含有部分1 inker序列的 IFN- γ，并分別進行膠回收;第二個PCR:以第一個PCR擴增出的基因為模板，不加引物，進行 10-15個PCR反應;第三個PCR反應，以