一種羅氏沼蝦的雌雄性別調(diào)控方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物性別調(diào)控技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羅氏沼蝦的雌雄性別 調(diào)控方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)是世界上蝦蟹養(yǎng)殖大國(guó)，在沿海地區(qū)蝦蟹的養(yǎng)殖形成了龐大的產(chǎn)業(yè)，成為當(dāng) 地經(jīng)濟(jì)的重要支柱，推動(dòng)農(nóng)民生活水平提高。在蝦蟹類(lèi)的生長(zhǎng)過(guò)程中，雌性和雄性個(gè)體存在 著巨大的差異。羅氏沼蝦在生長(zhǎng)過(guò)程中存在雌雄兩態(tài)性，在相同的養(yǎng)殖條件下，雄蝦體重是 雌蝦的2-4倍。利用這種雄性特征的優(yōu)勢(shì)開(kāi)展全雄單性養(yǎng)殖具有很好的產(chǎn)業(yè)前景，提高水產(chǎn) 養(yǎng)殖效益。
[0003] 動(dòng)物的性別決定是一個(gè)可塑的生物發(fā)育過(guò)程。性別決定分化發(fā)育過(guò)程中原始生殖 腺開(kāi)關(guān)性別決定相關(guān)基因，隨后開(kāi)啟雌雄特異的相關(guān)基因發(fā)育成雄性或雌性，并在多種基 因的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控體系下進(jìn)行性腺的發(fā)育。因此，可以通過(guò)調(diào)控動(dòng)物體內(nèi)的性別決定相關(guān)基因 或雌雄特異的相關(guān)基因表達(dá)水平，從而誘導(dǎo)獲得雌雄性別可控的動(dòng)物個(gè)體。羅氏沼蝦的ZW-ZZ染色體性別決定機(jī)制具有不完全性，同時(shí)受環(huán)境、上位或其他遺傳因素影響。因此，利用 分子或化學(xué)手段，在沼蝦性別分化關(guān)鍵時(shí)期調(diào)節(jié)雄性沼蝦體內(nèi)關(guān)鍵性控基因的表達(dá)，可使 雄性個(gè)體發(fā)生性別逆轉(zhuǎn)，獲得假雌個(gè)體，開(kāi)展雌性性別的調(diào)控。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種調(diào)控羅氏沼蝦雌雄性別的技術(shù)方 法，實(shí)現(xiàn)蝦類(lèi)全雄苗種生產(chǎn)技術(shù)，尤其是羅氏沼蝦的單性全雄苗種的培育技術(shù)。
[0005] 本發(fā)明的方法，是在羅氏沼蝦胚胎發(fā)育期至胚后發(fā)育的后期幼體期之前，降低或 沉默羅氏沼蝦體內(nèi)序列為SEQ ID NO: 1的性別蛋白或其衍生蛋白的表達(dá)量來(lái)完成的；
[0006] 作為優(yōu)選，是在胚胎發(fā)育的原腸胚至潘狀幼體期、胚后發(fā)育的后期幼體早期進(jìn)行 操作；
[0007] 這里所述的衍生蛋白，是與SEQ ID NO: 1的性別蛋白具有70%或以上同源性，且與 SEQ ID N0:1的性別蛋白的功能相同的蛋白；
[0008] 所述的降低或沉默羅氏沼蝦體內(nèi)序列為SEQ ID NO: 1的性別蛋白或其衍生蛋白的 表達(dá)量;是通過(guò)降低編碼性別蛋白基因的表達(dá)量來(lái)完成；
[0009] 作為實(shí)施例的一種優(yōu)選，是將能干擾性別蛋白編碼基因表達(dá)的雙鏈RNA分子轉(zhuǎn)入 羅氏沼蝦體內(nèi)來(lái)實(shí)現(xiàn)的；
[0010] 所述的雙鏈RNA分子，包括正義鏈和與正義鏈互補(bǔ)的反義鏈;其中的正義鏈與性別 蛋白的編碼基因 cDNA的序列（SEQ ID N0:2)部分或全部相同或互補(bǔ)；
[0011]作為優(yōu)選，所述的正義鏈的核苷酸序列為SEQ ID N0:3;
[0012] 所述的轉(zhuǎn)入羅氏沼蝦體內(nèi)，是通過(guò)顯微注射、浸泡或投喂方式來(lái)完成的；
[0013] 本發(fā)明方法攻克目前水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域蝦類(lèi)全雄化苗種培育中遇到的技術(shù)難題，通過(guò) RNA干擾技術(shù)和基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)，進(jìn)行定向性別控制，誘導(dǎo)蝦類(lèi)動(dòng)物性別逆轉(zhuǎn)，不僅構(gòu)建 蝦類(lèi)性別控制和單性培育的驗(yàn)證技術(shù)體系和平臺(tái)，而且利用性別可控的雌性親本培育全雄 單性苗種。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1:雙鏈RNA干擾樣品的電泳圖；
[0015] 圖2:干擾效率檢測(cè)圖；
[0016] 圖3:羅氏沼蝦的雌雄性別檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0017] RNA干擾(RNAi)技術(shù)是利用體外合成siRNA或dsRNA，輸入到動(dòng)物體內(nèi)使目的基因 沉默，觀(guān)察目的蛋白缺失后的表觀(guān)變化。RNA干擾是指一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA誘發(fā)的 序列特異性基因沉默現(xiàn)象，其機(jī)制是通過(guò)阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制基因表達(dá)。當(dāng) 細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默。
[0018] 羅氏沼蝦為體外受精，其胚胎發(fā)育在雌蝦的腹部進(jìn)行，主要經(jīng)歷卵裂期、囊胚期、 原腸期、無(wú)節(jié)幼體期和潘狀幼體期，約20天時(shí)間孵化出膜。隨后，羅氏沼蝦潘狀幼體蛻皮11 次，經(jīng)歷24-30天的變態(tài)發(fā)育后成為后期幼體(P 〇st-larVal，PL)。本發(fā)明涉及的性別相關(guān)基 因在胚胎發(fā)育時(shí)期，從進(jìn)入原腸胚期開(kāi)始就有高量表達(dá)，隨著胚胎發(fā)育的推進(jìn)在無(wú)節(jié)幼體 和潘狀幼體期都維持一個(gè)恒量的轉(zhuǎn)錄水平，且在雄蝦的生殖腺中有高量的表達(dá)。因此，實(shí)施 RNA干擾的時(shí)間是在胚胎發(fā)育時(shí)期至胚后發(fā)育的后期幼體時(shí)期。作為優(yōu)選，實(shí)施RNA干擾的 時(shí)間是胚胎發(fā)育的原腸胚至潘狀幼體期及胚后發(fā)育的后期幼體早期(PL1-PL60)。
[0019] 實(shí)施例1
[0020] 申請(qǐng)人研究發(fā)現(xiàn)了羅氏沼蝦中一種與性別有關(guān)的基因，其編碼的氨基酸序列為 SEQ ID N0:l;cDNA的序列為SEQ ID N0:2;用該基因的部分同源序列SEQ ID N0:3及同族基 因序列SEQ ID N0:4為目標(biāo)基因分別進(jìn)行RNA干擾操作;具體步驟如下：
[0021] 1).RNA干擾樣品制備：
[0022]根據(jù)性別相關(guān)基因的cDNA序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的正向引物和反向引物，用于 PCR反應(yīng)擴(kuò)增獲得含有性別相關(guān)基因的開(kāi)放閱讀框中的部分核酸序列；抽提羅氏沼蝦雄性 生殖系統(tǒng)總RNA樣品，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆目的基因分子。其主要方法和步 驟如下所述：
[0023]將成熟雄性羅氏沼蝦置于冰浴中約l_2min，使其輕輕麻醉，解剖取雄性生殖系統(tǒng) 組織，迅速放到液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移到-80°C長(zhǎng)期保存。采用Trizol試劑來(lái)進(jìn)行總RNA的抽 提，具體方案如下：稱(chēng)量1 〇〇mg樣品，液氮研磨，加入lml的Tr i zo 1，振蕩混勻;4 °C，12，000 X g，離心10min;轉(zhuǎn)移上清到新的離心管，室溫放置5min;加入200μ1的氯仿，混勾;4°C，12，000 X g，離心15min;轉(zhuǎn)移75-80 %的上清到新的離心管，然后加入0.5ml的異丙醇，混勻，室溫放 置10!1^11;4°(：，12,000\8，離心101^11 ;棄上清，然后加入1111170%的乙醇，混勻；4°(：，7,500 X g，離心5min;棄上清，空氣干燥，加入適量水，4 °C溶解過(guò)夜。用紫外分光光度計(jì)(OD26Q/280) 測(cè)定RNA的濃度和質(zhì)量。濃度計(jì)算公式:RNA(ygAU) =0D26Q*0.04*稀釋倍數(shù)，Ratio = OD260/ OD280o
[0024]利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA時(shí)，12.5μ1反應(yīng)體系中先加 入lyg RNA樣品和ΙμL ΙΟμΜ OligodT，混勻離心，置于PCR儀中70°C，5min，立即置于冰上;然 后，分別加入2·5μ1 5XReaction buffer，2.5yl 10mM dNTPs，0.5yl Ribonuclease 1池丨1^丨(^(冊(cè)1?1)和0.5以1]\^1^逆轉(zhuǎn)錄酶，加水補(bǔ)足總體積至12.5以1，混勻離心，置于?〇?儀 中 42°C，60min;-20°C保存待用。
[0025] 利用PCR擴(kuò)增的方法克隆目的基因分子，具體方法如下：首先，根據(jù)羅氏沼蝦性別 相關(guān)基因的cDNA序列（SEQ ID N0:2)設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物RNAi-PF:5'-GCTCTAGAGACACACCCTACATCTTCCAGC-3'（引物擴(kuò)增位置 1428bp-1449bp,下劃線(xiàn)為限制性?xún)?nèi) 切酶Xbal的酶切位點(diǎn)）和反向引物RNAi-PR: 5 ' -CGGGATCCAATATCATCCACGTCGCCTACT-3 '（引 物擴(kuò)增位置1850bp-1871bp，下劃線(xiàn)為限制性?xún)?nèi)切酶BamHI的酶切位點(diǎn)）。以雄性生殖系統(tǒng)組 織的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 °C變性5min，35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（94°C變性 30sec，55°C退火30sec，72°C延伸lmin)，最后72°C延伸ΙΟπ?η^δμΙ PCR反應(yīng)體系中，分別加 入2·5μ1 lOXTaq緩沖液，1·5μ1 25mM Mg2+，lyl 5mM dNTPs，lyl ΙΟμΜ RNAi-PF，lyl ΙΟμΜ RNAi-PR和2μ1 cDNA模板，0.25μ1 Taq聚合酶和11.75μ1滅菌去離子水。PCR產(chǎn)物用1.2 %瓊 脂糖凝膠電泳分析，然后采用QIAquick PCR purification kit純化，并作定量分析。
[0026] 然后，利用PET-T7質(zhì)粒構(gòu)建含有性別相關(guān)基因片段的表達(dá)載體，具體方法如下:利 用Xbal和BamHI限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物和pET-T7載體分別進(jìn)行雙酶切。pET-T7載 體雙酶切時(shí)，分別加入lyg PET-T7載體，ΙμL 10XK buffer，lyl Xbal限制性?xún)?nèi)切酶和ΙμL BamHI限制性?xún)?nèi)切酶，加水至終體積20μ1，37 °C反應(yīng)過(guò)夜。PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切時(shí)，分別加入1 yg PCR產(chǎn)物，ΙμL 10 XK buffer，ΙμL Xbal限制性?xún)?nèi)切酶和ΙμL BamHI限制性?xún)?nèi)切酶，加水 至終體積20yl，37°C反應(yīng)4hr。酶切后的產(chǎn)物用QIAquick Gel Extraction kit純化后進(jìn)行 電泳檢測(cè)，定量分析。
[0027] 隨后，將含有基因片段插入的pET-T7表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到表