對橙色粘球菌jch-04次級代謝產(chǎn)物分離純化提取抗霉枯草菌素的方法
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明涉及橙色粘球菌JCH-04，具體涉及一種對橙色粘球菌JCH-04次級代謝產(chǎn)物 分離純化提取抗霉枯草菌素的方法。
【背景技術】
[0002] 抗菌脂肽具有區(qū)別于常規(guī)抗生素的全新抗菌機制，不僅不易產(chǎn)生耐藥性，而且對 傳統(tǒng)藥物已具有耐藥性的菌株仍然有良好的殺菌和抑菌功效；同時，其抗菌譜之廣、抗菌效 果佳、不殘留，對G_、G+菌、真菌和支原體等均具有良好的抑制和殺滅作用，隨著達托霉素、 棘白霉素等新一代脂肽類抗生素的上市，越來越多的科研工作者將目光轉(zhuǎn)移至對該類抗菌 物質(zhì)的研發(fā)上，使其成為綠色安全、新型高效的抗菌藥物的研發(fā)方向。
[0003] 抗菌脂肽常見于解淀粉芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌的次級代謝產(chǎn)物中，而粘細菌 作為天然活性物質(zhì)的生產(chǎn)者，是一類重要的藥源菌，可產(chǎn)生異常豐富的次級代謝產(chǎn)物，包括 芳香族，雜環(huán)類，醌類，大環(huán)類，聚醚類，多烯類，肽類化合物等，卻未見報道其可產(chǎn)抗菌脂肽 類物質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于:提供一種對橙色粘球菌JCH-04次級代謝產(chǎn)物分離純化提取抗 霉枯草菌素的方法，對橙色粘球菌JCH-04進行發(fā)酵培養(yǎng)，由其次級代謝產(chǎn)物分離純化提取 抗霉枯草菌素 (Mycosubtilin)，它是抗菌脂肽的一種，擴大抗菌脂肽的提取途徑。
[0005] 本發(fā)明的技術解決方案是:對橙色粘球菌JCH-04的次級代謝產(chǎn)物進行分離純化提 取抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)，該澄色粘球菌JCH-〇4(Myxococcus fulvus JCH-04)在中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，地址:北京市朝陰區(qū)大屯路中國科學 院微生物研究所，保藏日期2009年1月22日，保藏編號為:CGMCCNo. 2893;取一環(huán)菌種接種于 裝有25mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30°C 180rpm培養(yǎng)2天得種子液;將種子液以體積比1: 10接種于含有l(wèi)〇〇mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30°C 180rpm培養(yǎng)6天，得發(fā)酵液；將 1000mL發(fā)酵液用60目篩過濾，收集樹脂，裝入層析柱中，用質(zhì)量濃度20%甲醇沖洗，再用純甲 醇洗脫，收集洗脫液，50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮得粗提物;粗提物1.9631g中分別加入50mL的水和 乙酸乙酯，混勻后離心，吸取水相，冷凍干燥得凍干粉;凍干粉563.5mg用3mL純甲醇溶解，離 心，取上清液，通過Sephadex LH-20凝膠層析分離，收集140~180min的餾分;將餾分于50°C 旋蒸濃縮至2mL，通過半制備色譜分離，收集保留時間為39.159 min和42.919 min的組分， 分別為C14 Mycosubtilin和C15 Mycosubtilin。
[0006] 其中，對橙色粘球菌JCH-04的次級代謝產(chǎn)物進行分離純化提取抗霉枯草菌素 (Mycosubtilin)的具體步驟是： (1)種子液培養(yǎng):取上一環(huán)保藏編號為CGMCC No. 2893的橙色粘球菌JCH-04的菌種接種 于裝有25mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30°C 180rpm培養(yǎng)2天，得種子液;其中，使用的液體 種子培養(yǎng)基配方g/L計為：土豆淀粉5.0~15,葡萄糖2~5,酵母粉0.5~10，脫脂奶粉 2.0~10，CaCl20.5~2.0，MgS〇4 · 7Η20 0.5~2.0，F(xiàn)e3+-Na-EDTA 0.005~0.02,去離子水定 容至lOOOmL，pH 7.2; (2) 發(fā)酵培養(yǎng):將上述種子液以體積比1:10接種于含有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角 瓶中，30°C 180rpm培養(yǎng)6天，得發(fā)酵液;其中，使用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方g/L計為：土豆淀 粉5.0~15,葡萄糖2~5,酵母粉0.5~10，脫脂奶粉2.0~10，CaCl 20.5~2.0，MgS〇4· 7H20 0.5~2.0，F(xiàn)e3+-Na-EDTA 0.005~0.02,甘油 5.0~15，XAD-16 大孔吸附樹脂 15~ 30,去離子水定容至1000mL，pH 7.2; (3) 提取粗產(chǎn)物:將上述1000mL發(fā)酵液用60目篩過濾，收集樹脂，先用水洗去樹脂表面 殘留的發(fā)酵液，然后將樹脂裝入玻璃層析柱中，層析柱規(guī)格2 X 50cm，用100mL質(zhì)量濃度20% 甲醇以lmL/min的流速流過樹脂柱清洗樹脂，再用純甲醇以lmL/min的流速洗脫樹脂，收集 甲醇洗脫液200mL，將200mL甲醇洗脫液于50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮得油脂狀粗提物，稱重為 1.9631g； (4) 萃取:粗提物1.9631 g中分別加入50mL乙酸乙酯和50mL水，溶解粗提物，lOOOOrpm離 心3min，乙酸乙酯相和水相分層，用移液器吸取水相，將水相冷凍干燥得凍干粉，稱重 563.5mg； (5) Sephadex LH-20凝膠層析：用3mL純甲醇溶解凍干粉563.5mg，離心取上清液，通過 Sephadex LH-20凝膠層析分離，凝膠層析柱規(guī)格為2X50cm，Sephadex LH-20凝膠量為20g， 洗脫劑為甲醇，流速〇.611117111；[11，收集140~180111；[11的餾分 ； (6) 半制備色譜分離:將上述餾分于50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至2mL，再采用半制備色譜分離 純化，制備柱為C18柱(Hedera 0DS-2,5ym，10.0X250 mm)，檢測波長215nm，進樣量2mL，收 集保留時間為39.159 min和42.919 min的組分，于50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙腈后，冷凍干燥，分 別得C14 Mycosubtilin 31.4mg和C15 Mycosubtilin 28.6mg0
[0007] 其中，C14 Mycosubtilin分子結構式為：
C15 Mycosubtilin為其同系物，在脂肪酸直碳鏈上多一個亞甲基(-CH2)。
[0008] 本發(fā)明的優(yōu)點是： 1、從橙色粘球菌的次級代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了抗霉枯草菌素的兩個同系類化合物，擴大抗 菌脂肽的提取途徑，并提供了發(fā)酵制備、分離純化方法，實現(xiàn)有效分離。
[0009] 2、利用本發(fā)明的方法，提高了得率，從1L的發(fā)酵液中提取到C14 Mycosubti 1 in 31.4mg和C15 Mycosubtilin 28.6mg，收率遠高于酸沉淀法，經(jīng)HPLC分析，純度達到了98% 以上。
[0010] 3、本發(fā)明涉及到抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)同系物對G一、G+菌、真菌和支原體 等均具有良好的抑制和殺滅作用，不易產(chǎn)生耐藥性，對于開發(fā)綠色安全、新型高效的抗菌藥 物具有重大意義。
【附圖說明】
[0011] 圖1為G1紅外光譜圖。
[0012] 圖2為G2紅外光譜圖。
[0013]圖3為茚三酮實驗結果。
[0014]圖4為G1質(zhì)譜分析結果。
[0015]圖5為G2質(zhì)譜分析結果。
[0016]圖6為G1氨基酸分析結果。
[0017]圖7為G2氨基酸分析結果。
[0018]圖8為G1二級質(zhì)譜分析結果。
[0019] 圖9為C14 Mycosubtilin HPLC圖。
[0020] 圖 10為C15 Mycosubtilin HPLC圖。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合具體實施例進一步說明本發(fā)明的技術解決方案，實施例不能理解為是對 技術方案的限制。
[0022] 實施例:依以下步驟對橙色粘球菌JCH-04的次級代謝產(chǎn)物進行分離純化提取得抗 霉枯草菌素(Mycosubtilin) (1) 種子液培養(yǎng):取上一環(huán)保藏編號為CGMCCNo . 2893的橙色粘球菌JCH-04的菌種接種 于裝有25mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30°C 180rpm培養(yǎng)2天，得種子液;其中，使用的液體 種子培養(yǎng)基配方g/L計為：土豆淀粉5.0~15,葡萄糖2~5,酵母粉0.5~10，脫脂奶粉 2.0~10，CaCl 20.5~2.0，MgS〇4 · 7H20 0.5~2.0，F(xiàn)e3+-Na-EDTA 0.005~0.02,去離子水定 容至 1000mL，pH 7.2; (2) 發(fā)酵培養(yǎng):將上述種子液以體積比1:10接種于含有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角 瓶中，30°C 180rpm培養(yǎng)6天，得發(fā)酵液;其中，使用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方g/L計為：土豆淀 粉5.0~15,葡萄糖2~5,酵母粉0.5~10，脫脂奶粉2.0~10，CaCl 20.5~2.0，MgS〇4· 7H20 0.5~2.0，F(xiàn)e3+-Na-EDTA 0.005~0.02,甘油 5.0~15，XAD-16 大孔吸附樹脂 15~ 30,去離子水定容至1000mL，pH 7.2; (3) 提取粗產(chǎn)物:將上述1000mL發(fā)酵液用60目篩過濾，收集樹脂，先用水洗去樹脂表面 殘留的發(fā)酵液，然后將樹脂裝入玻璃層析柱中，層析柱規(guī)格2 X 50cm，用100mL質(zhì)量濃度20% 甲醇以lmL/min的流速流過樹脂柱清洗樹脂，再用純甲醇以lmL/min的流速洗脫樹脂，收集 甲醇洗脫液200mL，將200mL甲醇洗脫液于50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮得油脂狀粗提物，稱重 1.