一種酶法制備魷魚皮膠原蛋白肽的工藝方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種制備魷魚皮膠原蛋白肽的工藝方法，尤其是涉及一種酶法制備魷 魚皮膠原蛋白肽的工藝方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著我國(guó)水產(chǎn)品加工業(yè)的迅猛發(fā)展，加工過程中產(chǎn)生大量的廢棄物，包括魚皮、魚 鱗和魚骨等，約占魚體總重的50~70 %。但是水產(chǎn)品原料利用率低，大量水產(chǎn)品邊角料和廢 棄料被加工成飼料，沒有進(jìn)行精深加工，造成資源的極大浪費(fèi)，更嚴(yán)重的是導(dǎo)致環(huán)境污染。 同時(shí)，水產(chǎn)加工原料利用率低、高附加值產(chǎn)品稀少等成為了水產(chǎn)加工業(yè)面臨的最為突出的 問題，嚴(yán)重限制了水產(chǎn)加工業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈的延伸和可持續(xù)發(fā)展。
[0003] 水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物膠原含量很高，且與陸生動(dòng)物來源的膠原蛋白相比，水產(chǎn)膠原 蛋白具有更高的安全性。膠原蛋白肽在消化、吸收、營(yíng)養(yǎng)等方面具有很多優(yōu)勢(shì)，且由于活性 中心的暴露而具有很多獨(dú)特的生理活性，如抗氧化、抗過敏、抗腫瘤、抗衰老、預(yù)防關(guān)節(jié)炎、 降血壓、促進(jìn)傷口愈合、促進(jìn)皮膚膠原代謝、免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能。當(dāng)前，膠原蛋白肽已 經(jīng)被廣泛的用于食品、生物醫(yī)藥及美容化妝品、飼料添加劑以及其他領(lǐng)域。
[0004] 膠原蛋白肽的研究與開發(fā)已成為近年來的熱點(diǎn)，如何快速高效的提取純化膠原蛋 白肽成為關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種酶法制備魷魚皮膠原蛋白肽的工藝方法，通過該工藝方法可以 得到較好品質(zhì)的膠原蛋白肽產(chǎn)品。
[0006] -種酶法制備魷魚皮膠原蛋白肽的工藝方法，原料魷魚皮預(yù)處理后，先經(jīng)堿性蛋 白酶水解后，再經(jīng)復(fù)合蛋白酶繼續(xù)水解得到膠原蛋白水解液，其中，復(fù)合蛋白酶由木瓜蛋白 酶與風(fēng)味蛋白酶組成。
[0007] 作為優(yōu)選，原料預(yù)處理的步驟為：將魷魚皮解凍清洗干凈，用0.5 %NaOH溶液浸泡 12h，清水洗凈之后，切碎，真空包裝后貯藏于-20°c冰箱。
[0008] 作為優(yōu)選，堿性蛋白酶的加酶量為0.2~0.4%，堿性蛋白酶水解pH為9.5~10.5， 堿性蛋白酶水解溫度為47.5~52.5°C，堿性蛋白酶水解時(shí)間為3~δΙ^ρΗ、酶解時(shí)間、酶解溫 度、蛋白酶加酶量對(duì)酶解液抗氧化活性、酶解液水解度、多肽轉(zhuǎn)化率均會(huì)產(chǎn)生不同影響。
[0009] 作為優(yōu)選，復(fù)合蛋白酶中，木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量比為1:0.5~3。木瓜蛋 白酶與風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量比不同，其酶解液抗氧化活性、水解度、多肽轉(zhuǎn)化率均會(huì)有所不 同。
[0010] 作為優(yōu)選，復(fù)合蛋白酶的加酶量為0.2~0.4%，復(fù)合蛋白酶水解pH為7~8,復(fù)合蛋 白酶水解溫度為50~55°C，復(fù)合蛋白酶水解時(shí)間為2~5h <φΗ、酶解時(shí)間、酶解溫度、蛋白酶 加酶量對(duì)酶解液抗氧化活性、酶解液水解度、多肽轉(zhuǎn)化率均會(huì)產(chǎn)生不同影響。
[0011] 作為優(yōu)選，先用0.3%堿性蛋白酶在pH 10.5、溫度47.5°C條件下水解4h，再用 ο. 4 %復(fù)合蛋白酶在pH 7.5、溫度50 °C的條件下繼續(xù)水解4.5h，復(fù)合蛋白酶中，木瓜蛋白酶 與風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量比為1:2。結(jié)果酶解液的水解度可達(dá)28.89%、DPPH清除率為88.24%， 多肽轉(zhuǎn)化率為49.74%，同時(shí)84.56%的膠原蛋白肽分子量分布介于180Da~2000Da之間，可 以得到較好品質(zhì)的膠原蛋白肽產(chǎn)品。
[0012]作為優(yōu)選，水解后得到的膠原蛋白水解液經(jīng)活性炭過濾后，經(jīng)過超濾、二級(jí)納濾膜 過濾后，再經(jīng)過反滲透納濾，最后經(jīng)過噴霧干燥得到分級(jí)的膠原蛋白肽粉。膠原蛋白水解液 經(jīng)活性炭過濾后，經(jīng)過超濾，其主要除去活性炭、大分子、懸浮物等雜質(zhì)，二級(jí)納濾膜過濾， 其主要用于膠原蛋白肽的分子量分級(jí)，根據(jù)不同需要，可將絕大多數(shù)的膠原蛋白肽集中在 某一分子量區(qū)間，更易于人體的吸收;再經(jīng)過反滲透納濾，其用于產(chǎn)品的脫鹽與濃縮，在常 溫下，使得膠原蛋白肽成為低鹽母液，并可同時(shí)濃縮膠原蛋白肽;最后經(jīng)過噴霧干燥得到分 級(jí)的膠原蛋白肽粉。
[0013]本發(fā)明工藝條件下制備得到的膠原蛋白肽產(chǎn)品，不僅水解度、DPPH清除率、多肽轉(zhuǎn) 化率等均較為理想，而且97.63 %膠原蛋白肽分子量小于2000Da，具有較好的品質(zhì)和較高的 利用價(jià)值;本發(fā)明對(duì)魷魚皮膠原蛋白肽后期進(jìn)一步的分離純化及應(yīng)用具有較高的的理論指 導(dǎo)意義。
【附圖說明】
[0014] 圖1是本發(fā)明的工藝流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明所要保護(hù)的范圍并 不限于此。
[0016] 材料與試劑
[0017] 魷魚皮:購(gòu)于舟山魷魚加工廠，清洗瀝干后貯藏于-20 °C冰箱。
[0018] 堿性蛋白酶（2.4AU/g)、風(fēng)味蛋白酶（500LAPU/g):諾維信公司；木瓜蛋白酶 (200000U/g):廣西南寧龐博生物工程有限公司;Gly-Gly-Tyr-Arg:Sigma公司；二苯代苦味 ?；杂苫?DPPH)、硫酸銅、濃硫酸、硫酸鉀、茚三酮、果糖、甘氨酸、三氯乙酸、無水乙醇、氫 氧化鈉、濃鹽酸等均為分析純。
[0019] 儀器與設(shè)備
[0020] HH2型數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海嘉鵬科技有 限公司；UV-2550紫外可見分光光度計(jì)：日本SMMADZU公司；FD1.0-60型冷凍干燥機(jī):丹麥 Heto公司；臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)：美國(guó)Thermo Scientific公司；Milli_Q超純水裝置:美國(guó) MILLIP0RE公司；Kjeltec 2300全自動(dòng)凱氏定氮儀:瑞典F0SS公司;Waters 600高效液相色 譜儀，美國(guó)Waters公司；DELTA 320pH計(jì)：瑞士METTLER TOLEDO公司；J0YN-8000T噴霧干燥 機(jī):上海喬躍實(shí)業(yè)有限公司。
[0021] 參照?qǐng)D1，一種酶法制備魷魚皮膠原蛋白肽的工藝方法，原料魷魚皮預(yù)處理后，先 經(jīng)堿性蛋白酶水解后，再經(jīng)復(fù)合蛋白酶繼續(xù)水解得到膠原蛋白水解液，其中，復(fù)合蛋白酶由 木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶組成。
[0022] 具體步驟如下：
[0023] 原料預(yù)處理
[0024] 將魷魚皮解凍清洗干凈，用0.5%Na0H溶液浸泡12h，去除魷魚皮上的雜蛋白。清水 洗凈之后，切碎，真空包裝后貯藏于_20°C冰箱，用于后期試驗(yàn)。
[0025] 酶解過程
[0026] 取20g魷魚皮置于錐形瓶中，按1:4(質(zhì)量比）的比例加水，調(diào)節(jié)至合適pH，按適當(dāng)?shù)?比例添加蛋白酶，封住瓶口后置于水浴鍋中磁力攪拌水解一定時(shí)間，取出置沸水中滅酶 lOmin，冷卻搖勻后離心（4000r/min，lOmin)，得到膠原蛋白水解液，貯藏于4°C冰箱;其中， 添加蛋白酶的過程為:先經(jīng)一定量(0.2~0.4% )的堿性蛋白酶在一定pH(9.5~10.5)及溫 度條件(47.5~52.5°C )下水解一段時(shí)間（3~5h)后，再經(jīng)一定量(0.2~0.4% )的復(fù)合蛋白 酶在一定pH(7~8)及溫度條件(50~55°C)下繼續(xù)水解一段時(shí)間（2~5h)得到膠原蛋白水解 液，其中，復(fù)合蛋白酶由木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶組成，木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量比 為1:0.5~3。即風(fēng)味蛋白酶與木瓜蛋白酶在堿性蛋白酶酶解液基礎(chǔ)上進(jìn)行。
[0027]膠原蛋白水解液經(jīng)活性炭過濾后，經(jīng)過超濾，其主要除去活性炭、大分子、懸浮物 等雜質(zhì)，二級(jí)納濾膜過濾，其主要用于膠原蛋白肽的分子量分級(jí)，根據(jù)不同需要，可將絕大 多數(shù)的膠原蛋白肽集中在某一分子量區(qū)間，更易于人體的吸收;再經(jīng)過反滲透納濾，其用于 產(chǎn)品的脫鹽與濃縮，在常溫下，使得膠原蛋白肽成為低鹽母液，并可同時(shí)濃縮膠原蛋白肽； 最后經(jīng)過噴霧干燥得到分級(jí)的膠原蛋白肽粉。
[0028]水解度的測(cè)定
[0029]總氮的測(cè)定:凱氏定氮法，參照GB 5009.5-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì) 的測(cè)定》；
[0030]游離氨基氮的測(cè)定:取O.lOOOg干燥過的甘氨酸定容至100mL，取此液分別稀釋成2 μ g/mL~2 0 yg/mL的溶液用于標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。取2mL稀釋液加入1. OmL諱三酮顯色齊丨」，搖勾后 于沸水浴中加熱15min，冷卻后加入5mL 40%乙醇溶液混勾，靜置1