一種微藻混合培養(yǎng)制備油脂的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)和生物能源領(lǐng)域，具體涉及一種能夠耐受高濃度C02并在堿 性環(huán)境下微藻混合培養(yǎng)制備油脂的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于化石能源的日趨減少和使用化石能源造成溫室效應的增加，越來越多的科研 工作者把目光集中到可再生能源的開發(fā)和利用上。生物質(zhì)能作為地球上最重要的可再生能 源，它包括林業(yè)生物質(zhì)、農(nóng)作物、水生植物、農(nóng)業(yè)廢棄物等。在諸多的生物質(zhì)能源中，微藻是 重要的可再生資源。它們具有分布廣泛、生物量大、光合作用效率高、環(huán)境適應能力強、生長 周期短、生物量產(chǎn)量高等特點。其細胞中含獨特的初級或次級代謝產(chǎn)物，化學成分復雜。微 藻的太陽能轉(zhuǎn)化效率可達到3. 5%，是生產(chǎn)藥品、精細化工品和新型燃料的潛在資源，從微藻 中得到的脂肪酸可轉(zhuǎn)化成脂肪酸甲脂，即生物柴油。
[0003] 隨著世界經(jīng)濟的發(fā)展，大量的化石能源的使用和消耗，導致能源的短缺和環(huán)境的 日益惡化，特別是C02的急劇增加引起的溫室效應越來越嚴重，微藻的生長周期短、光合效 率高，C0 2固定效率高，一定條件下可達陸生植物的10倍以上，不僅可以減少C02排放，同時 也降低了培養(yǎng)成本；除〇) 2外，廢氣中的一些SOx、NOx等成分也隨著微藻的代謝被凈化處 理，有效減少有害氣體排放，因此利用微藻油脂作為原料生產(chǎn)的生物柴油是目前最有可能 滿足世界運輸所需燃料的可再生能源。
[0004] 目前對于小球藻、柵藻等產(chǎn)油微藻研究的較多。CN20110144545.6公開了一株 柵藻藻株，該藻株的生長可利用人工培養(yǎng)基或經(jīng)適當處理的廢水生長，其特點是油脂產(chǎn) 率高于目前大多數(shù)分藻株，該藻株應用領(lǐng)域包括co2的固定，廢水的凈化，油脂、蛋白質(zhì)、 色素、淀粉、多糖、核酸的生產(chǎn)。CN20120154470.4公開了一株富油海洋微藻微擬球藻（ yVaiMocAJoro/wis )藻株及其應用，該藻株可在pH=4. 5的環(huán)境下正常生長，其油 脂含量可達35%。CN20111019480. X公開了一株微藻藻株耶.）及其用于生 產(chǎn)生物柴油的應用，利用該藻株可生產(chǎn)高附加值的多不飽和脂肪酸，包括亞麻酸C18:3和 神經(jīng)酸C24:1，其在獲得生物柴油的同時，獲得高附加值的副產(chǎn)品。這些專利都未涉及藻種 對二氧化碳的耐受性。CN102703326A公開了一種高C0 2耐受性和固定率的微藻及其選育方 法，但該專利所提供的藻株并未涉及該藻株的油脂含量。上述專利要么不能高效利用〇) 2生 產(chǎn)油脂，要么獲得的生物質(zhì)中油脂含量不夠高。特別是在實際應用中，當環(huán)境中C02體積分 數(shù)大于5v%時，大部分微藻的生長將受到抑制，固碳效率低；同時一般微藻在中性條件下適 宜生長，在偏酸性或者偏堿性的條件下不利于微藻的生長，而微藻利用〇) 2-般是以溶解在 水中的HC03離子形式存在的，二氧化碳在中性環(huán)境下溶解度低，不利于藻類吸收利用。
[0005] 劉平懷等(有機碳源對單針藻細胞生長、油脂積累和光合作用的影響，生物工程， 2012，33(18): 224-246)介紹了利用有機碳源培養(yǎng)單針藻的一種生產(chǎn)方式，培養(yǎng)結(jié)束雖然 生物量超過了 l〇g/L，但該種方式為單針藻異養(yǎng)培養(yǎng)方式，培養(yǎng)過程中利用葡萄糖等有機碳 源來實現(xiàn)細胞生長，這種培養(yǎng)方式?jīng)]有利用〇) 2等無機碳源經(jīng)濟，而且有機碳源的加入，在 培養(yǎng)過程易產(chǎn)生染菌問題，影響藻細胞的生長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有藻種不能滿足耐受和吸收高濃度C02，固定C02效率低的問題，本發(fā)明提 供了一種能夠耐受高濃度C0 2并在堿性環(huán)境下微藻混合培養(yǎng)制備油脂的方法。本發(fā)明方法 提高了微藻培養(yǎng)體系對高濃度co2的耐受性和溶解性，提高了固碳效率，微藻油脂的收獲量 明顯提高，能夠進行生物柴油的生產(chǎn)。
[0007] 本發(fā)明微藻混合培養(yǎng)制備油脂的方法，包括如下內(nèi)容：（1)將微藻培養(yǎng)基與斜生 柵藻FSH-Y2種子液加入到光生物反應器中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)體系的pH值為10~12,通入氣體 中C0 2的含量控制在5v%以下，培養(yǎng)2~5天；（2)調(diào)節(jié)培養(yǎng)體系的pH值為8~10,接入 纖維藻SS-B7種子液進行混合培養(yǎng)，通入氣體中C0 2含量為5v%~45v%，；（3)培養(yǎng)至生長 穩(wěn)定期結(jié)束，收獲微藻細胞；所述的斜生柵藻（FSH-Y2和纖維藻 耶.）SS-B7,分別于2012年9月11日和2013年4月15日保藏于"中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心"，保藏編號分別為CGMCC No. 6551和CGMCC No. 7478〇
[0008] 本發(fā)明所述FSH-Y2藻株在顯微鏡下藻細胞呈紡錘形，叢生，有細胞壁膜包裹，顏 色為深綠色；單個藻細胞直徑約為6~10 μ m。該藻株在高pH值下能夠更好的吸收利用二 氧化碳，快速生長繁殖。
[0009] 本發(fā)明所述纖維藻SS-B7藻株是一種淡水綠藻，在顯微鏡下藻細胞為綠色，鐮形 或弓形、叢生、彎曲，自中央向兩端漸尖細，末端尖，長大約5~6μπι，中央寬約2μπι。該藻 株能夠耐受高濃度的〇) 2和NOx，可以利用含C0 2和NOx的廢氣或煙氣進行光照自養(yǎng)生長獲 取富含油脂的生物質(zhì)，固碳效率高。
[0010] 本發(fā)明中，微藻培養(yǎng)基采用本領(lǐng)域人員熟知的BG11、SE、BBM等培養(yǎng)微藻的液體培 養(yǎng)基。斜生柵藻FSH-Y2種子液的制備如下：將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)為10~12,在溫度為20~ 30°C，光照周期為24h，光暗時間比為14:10,光照強度為2000~lOOOOLux，振蕩培養(yǎng)至對數(shù) 生長期。光生物反應器中加入的斜生柵藻FSH-Y2種子液與培養(yǎng)基的體積比1:10~1:5,通 入氣體為二氧化碳和氮氣，其中C0 2的含量控制在3v%~5v%。
[0011] 本發(fā)明中，纖維藻SS-B7種子液的制備如下：將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)為7~9,在溫度 為20~30°C，光照周期為24h，光暗時間比為14:10,光照強度為2000~lOOOOLux，振蕩培 養(yǎng)至對數(shù)生長期；纖維藻SS-B7種子液與培養(yǎng)基的體積比為1:20~1:10。混合培養(yǎng)的培養(yǎng) 溫度為20~30°C，光照周期為24h，光暗時間比為14:10,光照強度為2000~lOOOOLux。通 入氣體優(yōu)選使用含C0 2的廢氣或煙氣，其中C0 2含量為10v%~45v%，NOx含量為100 X 10 6~ 500X 10 6 (v/v)?；旌吓囵B(yǎng)至生長穩(wěn)定期結(jié)束，通過離心、沉降等方式收獲微藻細胞，測定 細胞干重和油脂含量，細胞干重可達到12g/L以上，油脂含量可達到細胞干重的45%以上。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以帶來以下有益效果： 1、本發(fā)明采用兩步法接入不同的微藻種子液進行混合培養(yǎng)，反應初期接入耐受高pH 的斜生柵藻FSH-Y2藻株在堿性條件下生長，可以抑制微藻培養(yǎng)初期雜菌和病蟲害的生長， 使微藻處于生長優(yōu)勢；同時高pH培養(yǎng)有利于通入高濃度二氧化碳的溶解，使二氧化碳更容 易被微藻吸收利用，有助于提高二氧化碳的固定效率； 2、 在利用二氧化碳和光照獲得生物質(zhì)的培養(yǎng)過程中，微藻混合培養(yǎng)并非是微藻單獨培 養(yǎng)的簡單組合，這兩種藻種互相配合，比單一藻種具有更高的的固碳效率和獲取更多的生 物質(zhì)和油脂含量； 3、 本發(fā)明的混合培養(yǎng)體系能夠耐受高濃度的0)2和NOx，可以利用廢氣中的C0 2進行自 養(yǎng)生長，固定C02，緩解目前工業(yè)社會帶來的溫室效應和廢氣污染問題。
【具體實施方式】
[0013] 下面通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。本發(fā)明中，wt%為質(zhì)量分數(shù)，V%為體 積分數(shù)。
[0014] 實施例1微藻種子液的制備 微藻培養(yǎng)米用BG11培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方如表1和表2所不。
[0015] 表1 BG11培養(yǎng)基
*表2表1中A5+Co solution的組成
首先按照表1和表2制備BG11液體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)斜生柵藻FSH-Y2的培養(yǎng)基的pH調(diào) 節(jié)為10,將培養(yǎng)纖維藻SS-B7的培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)為7. 5,然后將斜生柵藻FSH-Y2和纖維藻 SS-B7分別接種于上述培養(yǎng)基中。在恒溫光照搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25°C，光照周期為 24h，光暗時間比為14:10,光照強度為5000Lu X，120rpm振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，獲得斜生 柵藻FSH-Y2種子液和纖維藻SS-B7種子液，將上述種子液在15°C弱光下保存?zhèn)溆谩?br>[0016] 實施例2微藻油脂的制備 (1)在光生物反應器中，加入實施例1制備的FSH-Y2種子液和微藻培養(yǎng)基，F(xiàn)SH-Y2種 子液與培養(yǎng)基的體積比為1:5,培養(yǎng)基采用BG11培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的pH值控制為10,培養(yǎng)的 光照強度為5000LUX，光照周期為24h，光暗時間比為14:10,通入氮氣和二氧化碳的混合氣 體，其中二氧化碳含量為5v%。
[0017] (2)培養(yǎng)2天后，接入實施例1制備的纖維藻SS-B7種子液，