一種暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌種衰退的判定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌種衰退的判定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 暗褐網(wǎng)柄牛肝菌(Phlebopus portentosus)屬于牛肝菌目（Boletales)小牛肝菌 科(13〇1〇1：；[116130636)網(wǎng)柄牛肝菌屬(？111613(^118)，是云南省西雙版納地區(qū)每年雨季市場上 常見的食用菌，暗褐網(wǎng)柄牛肝菌也是目前唯一能實現(xiàn)菇房周年栽培的牛肝菌。目前對于暗 褐網(wǎng)柄牛肝菌的栽培主要通過野生菌株或者菇房栽培菌株組織分離獲得母種，母種進一步 擴繁后進行栽培測產(chǎn)來選育優(yōu)良菌株。目前栽培模式下，優(yōu)良菌株在繼代一定次數(shù)后就會 發(fā)生衰退，只能通過不斷地分離、篩選優(yōu)良菌株來保證生產(chǎn)的延續(xù)性。為了防止勿用衰退菌 株造成不可挽回的經(jīng)濟損失，在進入生產(chǎn)之前有效辨別菌株活力顯得極其重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌種衰退的判定方法，通 過本發(fā)明所述方法能夠及時對暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌種活性作出預(yù)判，進而有效防止栽培衰退 菌株造成的經(jīng)濟損失。
[0004] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：
[0005] 1、暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌種活性衰退的判定方法，包括如下步驟：
[0006] (1)觀察菌落形態(tài)、測定生長速率:菌株30°C避光培養(yǎng)，分別于至少5個不同時間點 十字交叉法測量菌落半徑，計算平均菌落生長速率；同時于菌絲體長滿培養(yǎng)皿時觀察菌落 形態(tài)特征;與菌株第一代原種相比，菌落吐水少，菌核小，平均菌落生長速率變化率2 10% ;
[0007] 所述平均菌落生長速率變化率=(I菌株平均菌落生長速率一第一代原種平均菌 落生長速率|)/第一代原種平均菌落生長速率X100% ;
[0008] 所述平均菌落生長速率為：以不同時間點為橫坐標，不同時間點對應(yīng)的平均菌落 半徑為縱坐標，獲取的直線斜率即為菌株平均菌落生長速率；
[0009] (2)測定菌落淀粉酶分泌能力：菌株培養(yǎng)15天后用剛果紅法或盧戈氏碘液法獲得 淀粉變色圈，然后采用十字交叉法測定平均菌落直徑和平均變色圈直徑，并與菌株第一代 原種對應(yīng)結(jié)果數(shù)據(jù)進行比較，采用剛果紅法測定變色圈直徑/菌落直徑的比值降低幅度2 10%，采用盧戈氏碘液法測定變色圈直徑/菌落直徑的比值降低幅度2 5% ;
[0010] (3)可溶性蛋白分析:菌株150rpm、30°C避光振蕩培養(yǎng)7天，過濾，濾渣清洗，除水， 液氮研磨至粉碎，取粉碎物用pH為7.2的磷酸鹽緩沖液混勾，12000rpm離心10min，吸取上清 液即為可溶性蛋白樣品，采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行可溶性蛋白分析，與菌株第一 代原種相比，相對分子量為40 .OkDa的可溶性蛋白條帶變?nèi)?，而相對分子量?2. OkDa的可 溶性蛋白條帶增強；
[0011] (4)酯酶同工酶分析:菌株150rpm、30 °C避光振蕩培養(yǎng)7天，過濾，濾渣清洗，除水， 液氮研磨至粉碎，取粉碎物用pH為5.6的磷酸鹽緩沖液混勾，12000rpm離心10min，吸取上清 液即為酯酶同工酶樣品，使用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行酯酶同工酶分析，與菌株第 一代原種相比，相對分子量為37. OkDa的酯酶同工酶活性增強。
[0012] 優(yōu)選的，步驟（1)所用培養(yǎng)基為Ml固體培養(yǎng)基，（3)和(4)中所用培養(yǎng)基為Ml液體培 養(yǎng)基。
[0013] 優(yōu)選的，按重量份計，所述Ml液體培養(yǎng)基的成分組成為：
[0014] 去皮馬鈴薯200.0份，葡萄糖20.0份，酵母膏2.0份，MgS〇4 · 7H20 1.0份，KH2P〇4l.O 份，水1000.0份;Ml固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加15.0份瓊脂粉。
[0015] 優(yōu)選的，步驟(2)中盧戈氏碘液法測定淀粉變色圈直徑使用的菌種培養(yǎng)基為Ml淀 粉固體培養(yǎng)基，按重量份計，所述Ml淀粉固體培養(yǎng)基的成分組成為：
[0016] 去皮馬鈴薯200.0份，葡萄糖10.0份，酵母膏2.0份，MgS〇4 · 7H20 1.0份，KH2P〇4l.O 份，水1000.0份，可溶性淀粉2.0份，瓊脂粉15.0份；
[0017] 剛果紅法測定淀粉變色圈直徑使用的菌種培養(yǎng)基在Ml淀粉固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加2 份剛果紅。
[0018] 優(yōu)選的，菌株在培養(yǎng)前先進行菌種活化，所述菌種活化條件為將菌株在Ml固體培 養(yǎng)基上活化，30°C避光培養(yǎng)20天。
[0019] 優(yōu)選的，步驟(3)中變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠中丙烯酰胺質(zhì)量體積濃度 為5%，分離膠中丙烯酰胺質(zhì)量體積濃度為10%，SDS質(zhì)量體積濃度為0.1 %，電泳電壓為濃 縮膠80V、分離膠150V。
[0020] 優(yōu)選的，步驟(3)中非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠中丙烯酰胺質(zhì)量體積濃 度為5%，分離膠中丙烯酰胺質(zhì)量體積濃度為8%，濃縮膠80V，分離膠150V。
[0021 ]優(yōu)選的，所述步驟（1)中測量菌落半徑的時間點分別在菌株培養(yǎng)的第3、6、9、12、15 和18天。
[0022] 本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明通過分析不同繼代次數(shù)下暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌落生 長速率，菌落形態(tài)特征，淀粉酶活性，可溶性蛋白圖譜，酯酶同工酶圖譜以及出菇測產(chǎn)各個 角度變化規(guī)律，找到可以表征暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌種隨繼代次數(shù)增多發(fā)生衰退的生理生化特 征，為菌種活力鑒定提供了有效的判定方法，該方法為暗褐網(wǎng)柄牛肝菌的菌種衰退提供了 有效的判定依據(jù)，大大降低了誤用衰退菌株的風險，有利于暗褐網(wǎng)柄牛肝菌栽培技術(shù)的推 廣。
【附圖說明】
[0023] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0024] 圖1菌株菌落形態(tài)圖。
[0025 ]圖2可溶性蛋白電泳圖譜，Μ:預(yù)染蛋白Mar k e r，相對分子量大小從上到下分別是 150，100,70,50,35,25,20kDa。
[0026]圖3酯酶同工酶電泳圖譜，Μ:預(yù)染蛋白Mar ker，相對分子量大小從上到下分別是 100，70，50，35，25kDa;其中，11023、13013上樣蛋白含量為A，B，C的一半。
[0027]以上附圖為原始圖片大小。
【具體實施方式】
[0028] 下面對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0029] 一、材料與設(shè)備 [0030] 1 · 1供試菌株
[0031] 暗褐網(wǎng)柄牛肝菌11023菌株；13013菌株；11023菌株栽培子實體組織分離菌株 11023-1372次繼代菌株（以下簡稱A)，5次繼代菌株（以下簡稱B)，8次繼代菌株（以下簡稱 〇〇
[0032] 1.2試劑、儀器設(shè)備與培養(yǎng)基 [0033] 1.2.1試劑
[0034]葡萄糖，酵母膏，剛果紅，碘，碘化鉀，乙酸-1-萘酯，乙酸-2-萘酯，固藍RR鹽， KH2P〇4，MgS〇4 · 7H20均為分析純，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；瓊脂粉為日本 進口分裝。
[0035] 1.2.2儀器設(shè)備
[0036] BIC-250型人工氣候箱，上海博訊公司;DYCE-25E型P4垂直電泳儀，北京六一公司； SK-100B恒溫搖床，上海蘇坤公司。
[0037] 1.2.2培養(yǎng)基
[0038] Ml培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200.0g(煮汁），葡萄糖20.0g，酵母膏2.0g，MgS〇4 · 7H20 1.0g，KH2P〇4l.Og，水1000.01111黑固體培養(yǎng)基另加15.(^瓊脂粉(暗褐網(wǎng)柄牛肝菌母種培養(yǎng) 基的篩選，西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，P 2Q9-m;暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌絲體培養(yǎng)基的碳源、氮源及無機 鹽的篩選研究，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，P145-149 ;