一種重組慢病毒在hiv表型耐藥檢測(cè)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及及醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及了一種重組慢病毒在HIV表型耐藥 檢測(cè)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 過(guò)去的數(shù)十年中，多種HIV-1抑制藥物已批準(zhǔn)入市，用于HIV感染病人的治療?；?HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶和（或）蛋白酶的兩種或多種抑制劑聯(lián)合應(yīng)用的高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法 (HAART)，被公認(rèn)為是治療HIV感染病人最有效方法之一。它不僅能夠提高HIV感染病人的生 活質(zhì)量也能降低HIV的感染風(fēng)險(xiǎn)。盡管HAART能夠抑制病毒的復(fù)制和降低HIV感染的風(fēng)險(xiǎn)，但 不能清除HIV-1感染者體內(nèi)的病毒。因此，抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法會(huì)因藥物選擇性壓力下新現(xiàn)的 耐藥毒株而大打折扣。因此，很有必要監(jiān)測(cè)耐藥毒株并對(duì)臨床精準(zhǔn)抗病毒治療提供指導(dǎo)。
[0003] 目前，對(duì)于HIV藥物耐藥性檢測(cè)主要有基因型和表型耐藥兩種檢測(cè)類型?；蛐湍?藥檢測(cè)是通過(guò)序列分析，能檢出HIV-1靶基因中特定耐藥相關(guān)的基因突變，因其操作簡(jiǎn)便， 成本低廉，及在線的評(píng)估系統(tǒng)的應(yīng)用，較表型耐藥檢測(cè)常用。但是，基因型檢測(cè)不能用于解 釋不常見(jiàn)的突變或幾種突變型的混合突變。表型耐藥檢測(cè)，能夠在體外測(cè)定HIV-1抑制劑作 用下的病毒產(chǎn)量或酶活性，能夠直接測(cè)定每種抑制劑的耐藥水平，而無(wú)需知曉HIV-1毒株的 基因突變。因此，表型耐藥檢測(cè)對(duì)于HIV-1感染的病人，特別是為已經(jīng)多次治療的病人提供 精準(zhǔn)的藥物指導(dǎo)是很有意義的。通常情況下，表型耐藥檢測(cè)是分離和培養(yǎng)臨床毒株。但是， 這些檢測(cè)需要采集獻(xiàn)血者新鮮的外周血單個(gè)核細(xì)胞，這將耗時(shí)耗力。最近，有一些檢測(cè)基于 重組病毒的單環(huán)感染，或用感染性粒子進(jìn)行多輪感染。盡管這些檢測(cè)用于表型耐藥分析有 巨大的應(yīng)用前景，但是，由于采用高通量定量螢火蟲螢光素酶表達(dá)系統(tǒng)，成本還是很高昂， 再就是可能存在著生物安全問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種重組慢病毒在HIV表型耐藥檢 測(cè)中的應(yīng)用，該重組慢病毒安全高效毒副作用小成本低，將其應(yīng)用于HIV表型耐藥檢測(cè)中， 能為臨床上合理有效地選用抗HIV藥物提供重要參考依據(jù)。該重組慢病毒帶有的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒， 其報(bào)告基因 Luciferase與ZsGreen位于pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen上，且由CMV啟動(dòng)子控 制報(bào)告基因1^1(^€6瓜86與286代611的表達(dá)，使得!11￥-1抑制劑的抗病毒效果能夠簡(jiǎn)易地通過(guò) 在倒置熒光顯微鏡下觀察到或通過(guò)測(cè)定熒光素酶活性而獲得，將P〇l區(qū)導(dǎo)入后，多種細(xì)胞用 具有此轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的重組慢病毒均可進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，通用性強(qiáng)。
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)： 本發(fā)明的發(fā)明思路基于以下考慮。第一，在艾滋病人臨床治療工作中，表型耐藥檢測(cè)能 為患者個(gè)體化治療提供參考。但是表型耐藥檢測(cè)是分離和培養(yǎng)臨床毒株。但是，以往的檢測(cè) 方法存在耗時(shí)耗力或是成本高昂，及生物安全性的問(wèn)題。基于此，發(fā)明人開發(fā)了一種具有新 的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的重組慢病毒，它具有簡(jiǎn)易操作性、較好的生物安全性及通用性。
[0006] 一種重組慢病毒在HIV表型耐藥檢測(cè)中的應(yīng)用，該重組慢病毒是包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì) 粒和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞或293T細(xì)胞后得到的包裝體；其中，所述包裝質(zhì)粒為 psPAX2m_pol 質(zhì)粒;所述轉(zhuǎn)移質(zhì)粒為 pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen 質(zhì)粒。
[0007] 進(jìn)一步地，所述轉(zhuǎn)移質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0008] 進(jìn)一步地，所述轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括以下步驟:使用BamH I和Κρη I雙酶切 pMD2 ·G質(zhì)粒，回收酶切產(chǎn)物，收取119bp CMV片段;將pHAGE-EFla-IRES-ZsGreen質(zhì)粒用BamH I和Κρη I進(jìn)行雙酶切，回收4736bp pHAGE-IRES-ZsGreen片段;將回收的CMV片段和pHAGE-IRES-ZsGreen用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，連接成功后，提取的質(zhì)粒命名為pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen質(zhì)粒；使用Ncol和Xbal雙酶切PGL3_Promoter Vector，回收 1906bp Luciferase片 段，pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen質(zhì)粒用Ncol和Xbal雙酶切，回收4855bp的片段，將該片段和 Luciferase片段用T4DNA連接酶進(jìn)行連接;連接成功后，提取的質(zhì)粒即為pHAGE-CMV-Luc-IRES_ZsGreen〇
[0009] 進(jìn)一步地，所述p s PAX 2m-p ο 1質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖3所示。
[00?0] 進(jìn)一步地，所述psPAX2m-pol質(zhì)粒序列如SEQIDNo.6所示。
[0011 ] 進(jìn)一步地，所述pSPAX2m_pol質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括以下步驟： psPAX2載體重建:利用長(zhǎng)引物法突變psPAX2載體的酶切位點(diǎn)Agel，獲得psPAX2-l載體； 利用定點(diǎn)突變?cè)噭┖型蛔働SPAX2-1載體的酶切位點(diǎn)Apal，獲得psPAX2-2載體;Dpnl酶切 psPAX2-2載體，酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化XL 10-G0LD感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒提取，Apal酶切該質(zhì)粒，挑取酶 切產(chǎn)物鑒定測(cè)序，獲得psPAX2m載體，其序列如SEQIDN 0.4所示； psPAX2m-pol質(zhì)粒構(gòu)建:利用PCR擴(kuò)增pol片段，其序列如SEQIDNo.5所示；用ApaI和 Agel酶切擴(kuò)增后的pol片段回收并插入psPAX2m載體，得到psPAX2m-p〇l質(zhì)粒，其序列如SEQ ID No .6所示。
[0012] 進(jìn)一步地，所述psPAX2-l載體的序列如SEQIDNo.2所示。
[0013] 進(jìn)一步地，所述psPAX2-2載體的序列如SEQ ID No.3所示。
[0014] 進(jìn)一步地，所述psPAX2m載體的序列如SEQIDNo.4所示。
[0015]進(jìn)一步地，所述長(zhǎng)引物法突變psPAX2載體所用的引物為Agel-F和Agel-R，其中， AgeI-F：CGAAGAGCTC ATCAGAACAG TCAGACTCAT CAAGCTTCTC TATC； AgeI-R：CTGCTAGCTA TAGTTCTAGA GGTATCGGTT GTTTCGAGCT TATAG； 模板為 psPAX2，PCR 條件:94 °C 預(yù)變性 4min，94 °C 變性 20s、55 °C 退火 20s、72 °C 延伸 lmin， 循環(huán)35次，最后72°C延伸5min; 所述利用定點(diǎn)突變?cè)噭┖型蛔働sPAX2-1載體所用的引物為M-ApaI-F和M-ApaI-R;其 中， M-ApaI-F：GCC TTG AGG GGC CTC CGG GGA CGG CCC TTT GTG CGG GG M-ApaI-R：CCC CGC ACA AAG GGG CCG TCC CGG AGC CCC CTC AAG GC； 模板為 psPAX2-l，PCR 條件:95°C 預(yù)變性 2min，95°C 變性 30sec，55°C 退火 lmin，68°C 延伸 10min，循環(huán)18次。
[0016]本發(fā)明具有如下有益效果:一種重組慢病毒在HIV表型耐藥檢測(cè)中的應(yīng)用，該重組 慢病毒安全高效毒副作用小成本低，將其應(yīng)用于HIV表型耐藥檢測(cè)中，能為臨床上合理有效 地選用抗HIV藥物提供重要參考依據(jù)。該重組慢病毒帶有的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，其報(bào)告基因 Luciferase與ZsGreen位于pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen上，且由CMV啟動(dòng)子控制報(bào)告基因 Luciferase與ZsGreen的表達(dá)，使得HIV-1抑制劑的抗病毒效果能夠簡(jiǎn)易地通過(guò)在倒置熒光 顯微鏡下觀察到或通過(guò)測(cè)定熒光素酶活性而獲得，將P〇l區(qū)導(dǎo)入后，多種細(xì)胞用具有此轉(zhuǎn)移 質(zhì)粒的重組慢病毒均可進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，通用性強(qiáng)。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為本發(fā)明中轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖； 圖2為本發(fā)明中轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建方法示意圖； 圖3為本發(fā)明中包裝質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖； 圖4為本發(fā)明中熒光顯微鏡下質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染情況;其中：左邊一列為載體突變前，病毒感 染293A細(xì)胞熒光百分比；右邊一列為載體突變后，病毒感染293A細(xì)胞熒光百分比，其中， A與D表示原始病毒液感染293A細(xì)胞熒光百分比； B與E表示原始病毒液稀釋10倍后感染293A細(xì)胞熒光百分比； C與F表示原始病毒液稀釋100倍后感染293A細(xì)胞熒光百分比 結(jié)果:從各個(gè)梯度百分比可以看出，載體改造后，對(duì)病毒的濃度和感染性無(wú)影響； 圖5中A~C分別為使用本發(fā)明重組慢病毒共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，抗HIV藥物司他夫定敏感性 與細(xì)胞數(shù)目、病毒Μ0Ι及病毒感染時(shí)間相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果； 圖6為本發(fā)明中重組慢病毒活性滴度情況； 圖7中A~C分別為使用本發(fā)明重組慢病毒共轉(zhuǎn)染TZM-B細(xì)胞，抗HIV藥物齊多夫定(D4T) 敏感性與細(xì)胞數(shù)目、病毒Μ0Ι及病毒感染時(shí)間相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果； 圖8中A~C分別為使用本發(fā)明重組慢病毒共轉(zhuǎn)染huh7.5細(xì)胞，抗HIV藥物齊多夫定 (D4T)敏感性與細(xì)胞數(shù)目、病毒Μ0Ι及病毒感染時(shí)間相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。
[0019] 本發(fā)明一種重組慢病毒系統(tǒng)是利用下述方法構(gòu)建的，步驟為： (1)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建 本發(fā)明的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒具有雙報(bào)告基因熒光素酶Luciferase與ZsGreen，其具體結(jié)構(gòu)如圖1 所示。Luciferase與ZsGreen為各自獨(dú)立表達(dá)的蛋白，而非融合蛋白。
[0020]如圖2所示，該轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建方法如下： (1.1) 使用BamH I和Κρη