一種檢測曲霉屬產(chǎn)毒真菌的lamp通用引物及包含該引物的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測曲霉屬產(chǎn)毒真菌的LAMP通用引物以及包含該引物的試劑 盒，同時涉及一種使用包含該引物的試劑盒快速檢測曲霉屬產(chǎn)毒真菌的方法。屬于食品安 全檢測和微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 曲霉屬產(chǎn)毒真菌是常見腐生真菌，多見于發(fā)霉的糧食、糧制品及其它霉腐的 有機(jī)物上，菌落生長較快，結(jié)構(gòu)疏松，菌體由許多復(fù)雜的分枝菌絲構(gòu)成。曲霉屬是叢 梗孢目、叢梗孢科中的一個屬，產(chǎn)真菌毒素的菌種主要有：黃曲霉（A. flavus)、寄生 曲霉（A. parasiticus)、雜色曲霉（A. versicolor)、煙曲霉（A. fumigatus)、赫曲霉 (Aspergillus ochraceus)、溜曲霉（Aspergillus tamari)、灰綠曲霉（A. glaucus)、構(gòu)巢曲 霉（A. nidurans)等。這些曲霉菌的有毒次級代謝產(chǎn)物為黃曲霉毒素、雜色曲霉素、煙曲霉 震顫素、赭曲霉毒素等
[0003] 曲霉屬產(chǎn)毒真菌及真菌毒素廣泛地污染農(nóng)作物、食品及飼料等植物源性產(chǎn)品。有 些真菌能夠直接引起人和動物的疾病，真菌毒素不但會影響人和動物的健康，而且還會造 成十分嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此急需研究簡便、經(jīng)濟(jì)和可靠的快速檢測技術(shù)。本發(fā)明主要研 究曲霉屬產(chǎn)毒真菌的快速檢測方法，主要檢測菌種包括黃曲霉、寄生曲霉、雜色曲霉、煙曲 霉和溜曲霉。
[0004] 目前我國對產(chǎn)毒真菌的檢測都是根據(jù)菌體形態(tài)和顯微鏡下特征進(jìn)行分類與鑒定， 但是該方法鑒定周期長、時效性差，需要有經(jīng)驗的專家或?qū)嶒炄藛T才能準(zhǔn)確分辨，且容易出 現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足高速發(fā)展的食品和飼料進(jìn)出口檢測需求。近些 年來，國內(nèi)和國外已經(jīng)開始運(yùn)用生物化學(xué)和分子生物學(xué)等方法開始對產(chǎn)毒真菌進(jìn)行檢測。 PCR基礎(chǔ)上發(fā)展而來的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)，是由日本榮研株式會社的Notomi等人于2000年開發(fā)出來的一種新型核酸擴(kuò)增方 法。它依賴于4條特異性引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可高效、 快速、高特異地擴(kuò)增靶序列。這種鏈置換型的DNA聚合酶，使模板兩端的引物結(jié)合處循環(huán)出 現(xiàn)環(huán)狀單鏈結(jié)構(gòu)，保證引物順利的與模板結(jié)合，進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)。該技術(shù)更克服了需要 反復(fù)熱變性的PCR反應(yīng)的特點，有效避免了升降溫的過程當(dāng)中耗時的缺點，實現(xiàn)了恒溫條 件下的連續(xù)快速擴(kuò)增，可以在15_60min之內(nèi)擴(kuò)增10 9-101(]倍靶序列拷貝。擴(kuò)增產(chǎn)物檢測快 速簡單，方法多樣，主要有肉眼觀察沉淀法、熒光染料檢測法、瓊脂糖凝膠電泳法和濁度儀 檢測法。LAMP具有擴(kuò)增效率高，靈敏度強(qiáng)，特異性好的優(yōu)點，而且不需要昂貴的PCR儀和試 劑，只需要一個恒溫加熱裝置即可，成本低，適用于在基層使用，在普通的實驗室具有很好 的應(yīng)用前景，適用于曲霉屬產(chǎn)毒真菌的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種檢測曲霉屬產(chǎn)毒真菌的LAMP通用引物，和一種包含該引物的 試劑盒，以及一種使用該試劑盒檢測曲霉屬產(chǎn)毒真菌的LAMP方法，可以快速、特異、簡便、 廉價的檢測曲霉屬產(chǎn)毒真菌，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)在相關(guān)檢測方面速度慢、成本高等不足，對 農(nóng)作物、食品、某些藥品及飼料安全檢測具有重要作用。
[0006] 為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
[0007] -種檢測曲霉屬產(chǎn)毒真菌的LAMP通用引物，其特征在于，其中包括：
[0008] 外側(cè)正向引物 F3 :5' -TTGGTGGTGGTATTGCCAA-3' ；
[0009] 外側(cè)反向引物 B3 :5' -GACGTGCATGTTGAGGCC-3' ；及
[0010] 內(nèi)側(cè)正向引物 FIP :5 ' -CAGAACAGGGGCGACCTCAC-CTTCACCAACGTTGCTTCGA-3 ' ；
[0011] 內(nèi)側(cè)反向引物 BIP :5' -AGCACAAGGTCCAGATCTGGGT-TCCTCACCAACGGACTTGA-3' ；
[0012] 以及環(huán)引物 LF :5' -GCACGGATGACACCCTTG-3' ；
[0013] 環(huán)引物 LB :5，-CCGTCGTGCTGGTCCTA-3，。
[0014] -種包含上述LAMP通用引物的檢測曲霉屬產(chǎn)毒真菌的試劑盒，包括LAMP引物、 BstDNA聚合酶、含dNTPs的反應(yīng)緩沖液和去離子水，其特征在于，其中包括的LAMP通用引物 為上述的LAMP通用引物。
[0015] 上述的檢測曲霉屬產(chǎn)毒真菌的試劑盒，其特征在于，所述的含dNTPs的反應(yīng)緩沖 液包含（1犯1^2.8111111〇1/1、40111111〇1/1?!18.8的1^8-!1(：1、20111111〇1/11((：1、20111111〇1/1(順 4)2504、 16臟〇1八]\%304、0.2%吐溫20以及1.61]1〇1八甜菜喊。
[0016] 上述的檢測曲霉屬產(chǎn)毒真菌的試劑盒，其特征在于，所述的LAMP通用引物包括 40pmol/y L 引物 FIP50y L、40pmol/y L 引物 ΒΙΡ50μ L、5pmol/y L 引物 F3 50μ L、5pmol/ μ L 引物 B3 50 μ L、20pmol/ μ L 引物 LF50 μ L、20pmol/ μ L 引物 LB50 μ L。
[0017] 上述的檢測曲霉屬產(chǎn)毒真菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中Bst DNA聚合酶 的濃度為8U/μ L，含量為50 μ L，含dNTPs的反應(yīng)緩沖液含量為lmL，去離子水含量為lmL。
[0018] -種利用上述的試劑盒檢測曲霉屬產(chǎn)毒真菌的方法，其特征在于，包括以下步 驟：
[0019] (1)提取模板 DNA;
[0020] (2)以步驟⑴中提取的DNA為模板，采用上述的檢測曲霉屬產(chǎn)毒真菌的試劑盒進(jìn) 行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)；
[0021] (3) LAMP擴(kuò)增結(jié)果判定。
[0022] 上述的檢測方法，其特征在于，步驟（2)中的LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μ L，各組分 含量如下：
[0023] 模板DNA 2pL 40pmol/VL 引物 ΠΡ lpL 40 pmol/pL 引物 BIP l(xL 5 pmol^iL 引物 F3 ΙμL 5 pmol/pL 引物 B3 ΙμL 20pmol/pL 引物 LB 1成 20 pmol/pL 引物 LF 1 μL 含dNTP的反應(yīng)緩沖液 12.5|iL DNA聚合酶 l|〇L dd Η20 3.5μL。
[0024] 上述的檢測方法，其特征在于，步驟（2)所述LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的溫度為63°C，時間為 60min〇
[0025] 上述的檢測方法，其特征在于，步驟（3)利用LA-320C濁度儀進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)， 通過程序顯示的渾濁度鑒定所述步驟（2)中特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。
[0026] 本發(fā)明的上述技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點：
[0027] 1.本發(fā)明所述的檢測曲霉屬產(chǎn)毒真菌的LAMP通用引物及包含該引物的試劑盒， 在檢測曲霉屬產(chǎn)毒真菌時快速和高效：核酸擴(kuò)增在lh內(nèi)即可完成，并且可檢測出多種類的 曲霉屬產(chǎn)毒真菌。有發(fā)明專利（授權(quán)公告號CN101381771B)涉及一種產(chǎn)黃曲霉毒素真菌環(huán) 介導(dǎo)等溫擴(kuò)增快速檢測方法，該方法僅是針對產(chǎn)黃曲霉毒素的真菌的檢測，而本發(fā)明的優(yōu) 點是可以檢測出曲霉菌屬中能夠產(chǎn)生真菌毒素的真菌，非針對于個別真菌毒素基因序列的 檢測。因此本發(fā)明可檢測出曲霉屬產(chǎn)毒真菌的污染，對曲霉屬產(chǎn)毒真菌污染的預(yù)防和檢測 具有重要意義。
[0028] 2.本發(fā)明所述的一種檢測曲霉屬產(chǎn)毒真菌的LAMP通用引物及包含該引物的試劑 盒，所述LAMP通用引物以曲霉屬產(chǎn)毒真菌共有的ATP檸檬酸裂解酶基因為靶基因進(jìn)行擴(kuò) 增；該基因序列在曲霉屬產(chǎn)毒真菌中具有高度的同源性，相對于其他真菌具有高度特異性， 因而可以實現(xiàn)曲霉屬產(chǎn)毒真菌的特異性檢測。
[0029] 3.本發(fā)明所述的LAMP法檢測曲霉屬產(chǎn)毒真菌，針對靶序列的6個區(qū)域設(shè)計了 4種 特異性引物，6個區(qū)域中任何一處與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增，且與其它種屬的真菌 不發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，因而具有高特異性；同時本方法具有高靈敏度，所需模板拷貝量少，檢測 下限約為lxl〇 12g/yL。
[0030] 4.本發(fā)明所述的LAMP反應(yīng)可操作性強(qiáng)，避免使用昂貴的熱循環(huán)儀，只要求簡單的 恒溫的反應(yīng)儀器，必要時只準(zhǔn)備恒溫的水浴加熱即可完成此操作；并且產(chǎn)物檢測方便，通過 肉眼觀察渾濁度就能實現(xiàn)；所述包含該引物的試劑盒中所用的檢測試劑均為市售常見化工 試劑，檢測便利。
【附圖說明】
[0031] 圖1為本發(fā)明實施例3中LAMP通用引物組檢測曲霉屬產(chǎn)毒真菌擴(kuò)增曲線圖。橫 坐標(biāo)代表反應(yīng)時間（min)，縱坐標(biāo)代表濁度。圖中曲線為本發(fā)明中的5種曲霉屬產(chǎn)毒真菌。
[0032] 圖2為本發(fā)明實施例4中LAMP通用引物反應(yīng)特異性分析的實時濁度檢測擴(kuò)增柱 狀圖，橫坐標(biāo)代表反應(yīng)時間（min)，縱坐標(biāo)代表濁度。1為黃曲霉；2為禾谷鐮刀菌；3為茄鐮 孢菌；4為島青霉菌；5為鮮綠青霉菌；6為金黃色葡萄球菌；7為大腸桿菌；8為陰性對照
[0033] 圖3為本發(fā)明實施例4中LAMP通用引物反應(yīng)特異性分析的實時濁度檢測擴(kuò)增曲 線圖，橫坐標(biāo)代表反應(yīng)時間（min)，縱坐標(biāo)代表濁度。圖中曲線為黃曲霉擴(kuò)增曲線，其它菌種 未發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。
[0034] 圖4為本發(fā)明實施例5中LAMP通用引物反應(yīng)靈敏度分析的實時濁度檢測擴(kuò)增柱 狀圖。橫坐標(biāo)代表反應(yīng)時間（min