冠心病和冠心病合并糖尿病檢測靶標及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及冠心病和冠心病合并糖尿病檢測靶標及其應(yīng) 用，更具體的涉及冠心病和冠心病合并糖尿病檢測靶標FRG1及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 冠心病(coronary heart disease，CHD)即冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的簡稱，指 冠狀動脈發(fā)生粥樣硬化引起的管腔狹窄或閉塞，導(dǎo)致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟 病，也稱為缺血性心臟病。我國每年約有幾百萬人死于心血管病，在這之中尤其以冠心病對 人民健康的威脅最大。關(guān)于動脈粥樣硬化現(xiàn)在己經(jīng)確立了多種危險因素，其中以糖尿病特 別突出，糖尿病患者與非糖尿病人群相比冠心病發(fā)病率常高出數(shù)倍，病情進展十分迅速，約 75%糖尿病患者最后死于冠心病。隨著糖尿病的患病率的增加，其患病人群中的青壯年人 逐年增長，對社會和家庭的危害更加嚴重。雖然多年來對關(guān)于動脈粥樣硬化的基礎(chǔ)和臨床 研究的取得了很大的進步，發(fā)現(xiàn)其發(fā)病與遺傳、炎癥、免疫、代謝等緊密相關(guān)，但是其具體機 制仍未完全闡明，此外，冠心病合并糖尿病的發(fā)病機制研究更少，目前臨床迫切需要尋找冠 心病、冠心病合并糖尿病的分子診斷標記，進行早預(yù)防、早治療，尤其是對冠心病合并糖尿 病患者，早期診斷將有效提高患者生存率。
[0003] 為解決目前冠心病和冠心病合并糖尿病早期分子診斷標記稀缺的問題，發(fā)明人對 2例單純冠心病患者，6例冠心病合并糖尿病患者及10例健康人對照外周血樣本進行高通量 測序，結(jié)合生物信息學方法分析進行靶點基因的篩選，挑選出候選基因 FRG1，進一步，通過 實驗證實了 FRG1基因與冠心病和冠心病合并糖尿病具有很好的相關(guān)性，并且可以用來區(qū)分 這兩種疾病，為臨床的防治提供參考，進一步，發(fā)明設(shè)計了針對FRG1的高效干擾RNA，為后續(xù) 治療制劑的研制提供基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的冠心病和冠心病合并糖尿病輔助診斷靶標具有很 好的臨床應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供檢測FRG1基因和/或其表達蛋白的制劑在制備冠心病和/ 或冠心病合并糖尿病診斷制劑中的應(yīng)用。
[0005] 進一步，冠心病和/或冠心病合并糖尿病的診斷制劑包括用熒光定量PCR方法、基 因芯片方法檢測外周血中FRG1基因和/或FRG1蛋白的表達。
[0006] 熒光定量PCR法是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標記 跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品模板的 初始濃度。熒光定量PCR的出現(xiàn)，極大地簡化了定量檢測的過程，而且真正實現(xiàn)了絕對定量。 多種檢測系統(tǒng)的出現(xiàn)，使實驗的選擇性更強。自動化操作提高了工作效率，反應(yīng)快速、重復(fù) 性好、靈敏度高、特異性強、結(jié)果清晰。
[0007] 基因芯片又稱為DNA微陣列(DNA microarray)，可分為三種主要類型：1)固定在聚 合物基片(尼龍膜，硝酸纖維膜等)表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標記的靶 基因與其雜交，通過放射顯影技術(shù)進行檢測。2)用點樣法固定在玻璃板上的DNA探針陣列， 通過與熒光標記的靶基因雜交進行檢測。3)在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷酸探針 陣列，與熒光標記的靶基因雜交進行檢測?；蛐酒鳛橐环N先進的、大規(guī)模、高通量檢測 技術(shù)，應(yīng)用于疾病的診斷，其優(yōu)點有以下幾個方面:一是高度的靈敏性和準確性;二是快速 簡便;三是可同時檢測多種疾病。
[0008] 用于熒光定量PCR方法檢測冠心病和/或冠心病合并糖尿病中FRG1基因的產(chǎn)品含 有一對特異性擴增FRG1基因的引物;所述的基因芯片包括與FRG1基因的核酸序列雜交的探 針。
[0009] 進一步，冠心病和/或冠心病合并糖尿病的診斷制劑包括用免疫方法檢測FRG1蛋 白的表達。優(yōu)選所述免疫檢測方法檢測冠心病和冠心病合并糖尿病中FRG1蛋白表達的為 western blot和/或ELISA和/膠體金檢測方法。
[0010] 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標 記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測大分子抗原和特異性抗體 等，具有快速、靈敏、簡便、載體易于標準化等優(yōu)點。ELISA檢測試劑盒根據(jù)檢測目的和操作 步驟可分為間接法、雙抗夾心法、競爭法、雙位點一步法、捕獲法測IgM抗體、應(yīng)用親和素和 生物素的ELISA JLISA檢測試劑盒中生色底物可選擇辣根過氧化物酶(HRP)或者堿性磷酸 酶(AP)。
[0011]常用的免疫膠體金檢測技術(shù)：（1)免疫膠體金光鏡染色法細胞懸液涂片或組織切 片，可用膠體金標記的抗體進行染色，也可在膠體金標記的基礎(chǔ)上，以銀顯影液增強標記， 使被還原的銀原子沉積于已標記的金顆粒表面，可明顯增強膠體金標記的敏感性。（2)免疫 膠體金電鏡染色法可用膠體金標記的抗體或抗抗體與負染病毒樣本或組織超薄切片結(jié)合， 然后進行負染。可用于病毒形態(tài)的觀察和病毒檢測。（3)斑點免疫金滲濾法應(yīng)用微孔濾膜作 載體，先將抗原或抗體點于膜上，封閉后加待檢樣本，洗滌后用膠體金標記的抗體檢測相應(yīng) 的抗原或抗體。（4)膠體金免疫層析法將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金 標記試劑(抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上，當待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上 后，通過毛細作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標記試劑后相互反應(yīng)，當移動至固定的 抗原或抗體的區(qū)域時，待檢物與金標試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集 在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。該法現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條，使用十分方便。 [00 12]進一步，檢測FRG1蛋白的ELI SA法為使用ELI SA檢測試劑盒。所述試劑盒中的抗體 可采用市售的FRG1單克隆抗體。進一步，所述的試劑盒包括:包被FRG1單克隆抗體的固相載 體，酶標二抗，酶的底物，蛋白標準品，陰性對照品，稀釋液，洗滌液，酶反應(yīng)終止液等。
[0013] 進一步，檢測FRG1蛋白的膠體金法為使用檢測試劑盒，所述的抗體可采用市售的 FRG1單克隆抗體。進一步，所述的膠體金檢測試劑盒采用膠體金免疫層析技術(shù)或膠體金滲 濾法。進一步，所述的膠體金檢測試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)(T)噴點有抗FRG1單克隆 抗體、質(zhì)控區(qū)(C)噴點有免疫球蛋白IgG。
[0014] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測冠心病和/或冠心病合并糖尿病的熒光定量PCR 試劑盒，其特征在于，所述試劑盒檢測基因 FRG1，采用特異的上游引物和下游引物，上游引 物序列為SEQ ID N0.12,下游引物序列為SEQ ID N0.13。
[0015] 進一步，該PCR試劑盒適合于目前存在市場上的所有類型熒光定量基因擴增儀，靈 敏度高，定量快速準確、穩(wěn)定性好，具有良好的應(yīng)用前景。
[0016] 進一步，上述熒光定量PCR試劑盒組分包括:特異性引物、內(nèi)參引物、焚光定量PCR 反應(yīng)液。其中所述的特異性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQ ID N0.12， 下游引物序列為SEQIDN0.13。所述內(nèi)參引物為β-aCtin內(nèi)參引物，上游引物序列為SEQID NO. 14,下游引物序列為SEQ ID NO. 15。
[0017] 所述的試劑盒還包含RNA抽提試劑。
[0018] 本發(fā)明目的是提供了一種冠心病和/或冠心病合并糖尿病檢測試劑盒，所述的檢 測試劑盒檢測FRG1蛋白。進一步的，所述的試劑盒還包括其他檢測試劑。
[0019] 本發(fā)明目的是提供了一種檢測冠心病和冠心病合并糖尿病的基因芯片，所述的基 因芯片包括與FRG1基因的核酸序列雜交的探針。
[0020] 本發(fā)明的目的在于提供FRG1基因和/或其蛋白抑制劑在制備抗冠心病和/或冠心 病合并糖尿病制劑中的應(yīng)用。
[0021] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先通過高通量測序結(jié)合生物信息學方法篩選到候選基 因 FRG1，繼而通過分子生物學方法驗證了 FRG1與冠心病和冠心病合并糖尿病的關(guān)系:FRG1 與冠心病和冠心病合并糖尿病具有很好的相關(guān)性，可用于制備抗冠心病和冠心病合并糖尿 病制劑和/或冠心病和冠心病合并糖尿病診斷制劑，具有重要的臨床應(yīng)用價值。
[0022]進一步，抗冠心病和/或冠心病合并糖尿病制劑是指可以抑制FRG1基因的表達的 制劑。本領(lǐng)域人員熟知抑制基因的表達通?？梢圆捎孟率龇椒ㄖ械囊环N和/或幾種:通過激 活FRG1基因的抑制基因、激活FRG1基因的抑制基因表達的蛋白、采用RNA干擾技術(shù)抑制FRG1 基因表達、激活促進FRG1基因 mRNA降解的mi cr oRNA、導(dǎo)入促進FRG1基因編碼蛋白降解的分 子、抑制促進FRG 1基因表達的因子及蛋白的表達。