一種含有保護(hù)劑的毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種能夠準(zhǔn)確檢測(cè)生物制藥如抗體純度的毛 細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis, CE)技術(shù)由傳統(tǒng)凝膠電泳（gel electrophoresis)發(fā)展而來(lái)，其以高壓電產(chǎn)生的強(qiáng)電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以微內(nèi)徑的石英毛細(xì)管 為分離通道。相比傳統(tǒng)的凝膠電泳，CE具有自動(dòng)化、快速、準(zhǔn)確定量性、高分辨率等優(yōu)點(diǎn)，很 多生物分子，例如蛋白質(zhì)、多糖及核酸等都可以使用毛細(xì)管電泳來(lái)進(jìn)行分析。十二烷基磺酸 鈉毛細(xì)管電泳（CE-SDS)技術(shù)是在毛細(xì)管分離緩沖液中加入線性凝膠形成分子篩，加入陰 離子表面活性劑十二烷基磺酸鈉 （sodium dodecyl sulfate, SDS)緩沖液至樣品中使蛋白 變性，并且和蛋白質(zhì)通過(guò)1 : 1.4的質(zhì)量比結(jié)合，由于這種SDS結(jié)合蛋白的質(zhì)荷比相同，使 得該結(jié)合蛋白在進(jìn)行毛細(xì)管分離時(shí)受到的電場(chǎng)力也相同，但由于不同分子的大小不同，因 而在線性凝膠分子篩中遷移受到的阻力大小不同，使得遷移速率不同，從而實(shí)現(xiàn)表觀上分 子量不同的分子得到分離。非還原型CE-SDS用碘乙酰胺處理，主要檢測(cè)單克隆抗體樣品中 的不同碎片、輕重鏈及共價(jià)結(jié)合的多聚體雜質(zhì)。
[0003] 美國(guó)Beckman公司PA800+型毛細(xì)管電泳儀及配套的檢測(cè)試劑盒含有以下組分：樣 品緩沖液（sample buffer),凝膠緩沖液（gel buffer),清洗液（0· 1M Na0H，0. 1M HC1)，內(nèi) 標(biāo)（inter standard)，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品（control standard)，其中樣品緩沖液（sample buffer) 含有100mM Tris-HCl，1% SDS及12. 5mM碘乙酰胺。我們?cè)谑褂迷撛噭┖兄械臉悠肪彌_液 對(duì)重組抗HER2人源化單克隆抗體（mAbl)進(jìn)行非還原型CE-SDS分子大小異構(gòu)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn) 在Beckman廠家推薦的檢測(cè)條件（70°C加熱10分鐘）下，得到的碎片含量（如含有一個(gè)抗體 輕鏈L和含有抗體重鏈-重鏈-輕鏈HHL的碎片）（見(jiàn)圖1，CE-SDS主峰含量89. 5 %，碎片 含量10. 5% )明顯高于使用其他方法如分子排阻色譜法（SEC-HPLC)所得到的含量（見(jiàn)圖 2, SEC-HPLC 主峰含量 >99%，碎片含量 <0.5%)。通過(guò)文獻(xiàn)（Taylor FR 等.Suppression of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis sample preparation aritfacts for analysis of IgG4half-antibodies. Analytical Biochemistry,2006, 353,204-208.)及我們的數(shù)據(jù)分析，這些增加的碎片雜質(zhì)可能是由于抗體和SDS結(jié)合并進(jìn) 行加熱處理過(guò)程中形成的降解產(chǎn)物。使用廠家推薦的碘乙酰胺作為抑制劑能明顯減少碎片 含量，但碎片含量仍明顯偏高（如含有12. 5mM碘乙酰胺作為保護(hù)劑能使抗體mAbl純度從 81 %增加到89. 5%，但繼續(xù)增加碘乙酰胺濃度至37. 5mM只能使純度增加至90. 6% )。因此， 如何找到一種能夠明顯降低碎片的形成，從而提高生物制藥如抗體檢測(cè)準(zhǔn)確度的方法是亟 待解決的問(wèn)題。
[0004] 我們發(fā)現(xiàn)，在含有碘乙酰胺的基礎(chǔ)上，加入其他類(lèi)型的保護(hù)劑還可以進(jìn)一步提高 抗體，例如mAbl的CE-SDS檢測(cè)純度，即能夠更加準(zhǔn)確地反映出抗體藥物的質(zhì)量，從而完成 了本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明實(shí)際所要解決的技術(shù)問(wèn)題，就是針對(duì)現(xiàn)有的非還原型CE-SDS檢測(cè)方法的 不足，提供了一種含有保護(hù)劑的毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)試劑盒，該試劑盒能提高非還原型 CE-SDS檢測(cè)抗體分子大小異構(gòu)體的準(zhǔn)確性。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] -種含有樣品緩沖液的毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)試劑盒，所述樣品緩沖液（sample buffer)中含有一種保護(hù)劑，所述保護(hù)劑濃度為10-5000mM，優(yōu)選為100-2000mM，更優(yōu)選 500-1000mM〇
[0008] 其中，本發(fā)明所述保護(hù)劑能夠抑制生物藥如單抗由于在樣品處理過(guò)程中發(fā)生降解 形成碎片（fragmentation)，該保護(hù)劑選自糖、多元醇或氨基酸。本發(fā)明中，氨基酸均為本 領(lǐng)域的寬泛含義，包括其可藥用鹽的形式。其中，所述糖可選自果糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、 甘露糖、乳糖、麥芽糖、山梨糖、葡聚糖、糊精、環(huán)糊精、羥乙基淀粉或其組合，優(yōu)選葡萄糖、蔗 糖、海藻糖或甘露糖。所述多元醇可選自甘露醇、甘油、山梨醇、乳糖醇、麥芽糖醇、木糖醇、 丙二醇、聚乙二醇或其組合，優(yōu)選甘露醇。氨基酸可選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨 酸、半胱氨酸、谷酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、蛋氨酸、苯丙氨 酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸或其組合。
[0009] 其中，本發(fā)明所述樣品緩沖液進(jìn)一步含有緩沖液，所述緩沖液選自Tris緩沖液、 磷酸緩沖液、乙酸緩沖液、琥珀酸緩沖液、葡萄酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、抗壞血酸緩沖液、 酒石酸緩沖液、順丁烯二酸緩沖液、乳酸緩沖液、碳酸緩沖液、苯甲酸緩沖液、咪唑緩沖液或 氨基酸緩沖液，優(yōu)選Tris緩沖液，更優(yōu)選Tris-HCl緩沖液。該緩沖液的含量使得所述樣品 緩沖液的pH值在3. 0-10. 0之間。
[0010] 其中，本發(fā)明所述樣品緩沖液進(jìn)一步含有十二烷基磺酸鈉（SDS)，其含量在 0.1-5%(￥/\￥)之間，優(yōu)選0.5-2%(界/\￥)，更優(yōu)選1%(￥/\￥)。
[0011] 其中，本發(fā)明所述試劑盒進(jìn)一步含有碘乙酰胺，其含量在l_200mM之間，優(yōu)選 5-50mM之間，更優(yōu)選10-30mM。其中碘乙酰胺和試劑盒中的其他組分分開(kāi)單獨(dú)儲(chǔ)存，使用前 配置好混合。
[0012] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述的試劑盒中的樣品緩沖液含有如下組分：
[0013] (l)Tris-HCl 緩沖液 100mM
[0014] (2)十二烷基磺酸鈉（SDS) 1 % (w/w)
[0015] (3)葡萄糖或蔗糖或海藻糖或甘露醇500mM
[0016] pH 值為 9.0。
[0017] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了如上所述的樣品緩沖液的制備方法，包括：將處方量的緩沖 液，優(yōu)選Tris緩沖液，處方量的十二烷基磺酸鈉和處方量的保護(hù)劑，優(yōu)選葡萄糖，蔗糖，海 藻糖或甘露醇，溶解在適量的去離子水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3. 0-10. 0,優(yōu)選9. 0,接著用 去離子水定容至500mL，得到樣品緩沖液。使用時(shí)，將處方量的碘乙酰胺溶解在去離子水中， 配制成250mM的碘乙酰胺溶液，然后將待測(cè)樣品用樣品緩沖液稀釋至lmg/ml，再與碘乙酰 胺溶液按照95yL : 5yL的比例進(jìn)行混合，之后再進(jìn)行抗體分子大小異構(gòu)體的非還原型 CE-SDS的純度檢測(cè)。
[0018] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了如上所述的試劑盒在對(duì)抗體分子進(jìn)行非還原型CE-SDS檢測(cè) 時(shí)，抑制抗體分子裂解中的用途，其中，所述抗體分子優(yōu)選為重組抗HER2人源化單克隆抗 體、重組人鼠嵌合抗腫瘤壞死因子-α單克隆抗體、重組抗白介素-6受體人源化單克隆抗 體、T-DM1、重組抗腫瘤壞死因子-a全人源單克隆抗體或重組抗⑶52人源化單克隆抗體， 更優(yōu)選為重組抗HER2人源化單克隆抗體。
[0019] 本發(fā)明的有益效果為：
[0020] 使用本發(fā)明的添加了保護(hù)劑的毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)試劑盒，根據(jù)CE廠商Beckman 公司推薦的樣品處理方法（70°C加熱10分鐘），可以提高毛細(xì)管電泳法檢測(cè)生物制藥如抗 體純度的準(zhǔn)確性，降低由于實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程產(chǎn)生的檢測(cè)偏差，更能反映出樣品本身含有的抗 體分子大小異構(gòu)體特別是碎片的實(shí)際含量。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1未加入保護(hù)劑的重組抗HER2人源化單克隆抗體（mAbl)的非還原型CE-SDS 圖譜
[0022] 圖2重組抗HER2人源化單克隆抗體（mAbl)的SEC-HPLC圖譜
[0023] 圖3實(shí)施例2中不同類(lèi)型保護(hù)劑對(duì)重組抗HER2人源化單克隆抗體（mAbl)的非還 原型CE-SDS純度影響
[0024] 圖4實(shí)施例3中不同類(lèi)型保護(hù)劑對(duì)重組抗腫瘤壞死因子-α人鼠嵌合單克隆抗體 (mAb2)的非還原型CE-SDS純度影響
[0025] 圖5實(shí)施例4中不同蔗糖濃度對(duì)重組抗HER2人源化單克隆抗體（mAbl)的