一種卡那霉素殘留的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是一種基于適體引發(fā)的核酸外切酶ΠΙ(Εχο III)循環(huán)酶切的卡那霉素的 檢測方法，特別是牛奶中卡那霉素殘留的檢測方法，屬于分析化學領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 卡那霉素是一種用于治療革蘭陰性菌和革蘭陽性菌感染的氨基糖苷類廣譜抗生 素，是臨床上最為常用的抗感染藥物之一。和其他的氨基糖苷類抗生素一樣，卡那霉素在動 物性食品中的殘留可能會引起食入者過敏，長期食用卡那霉素殘留超標食品還可導致耳和 腎毒性等毒副作用。歐共體規(guī)定牛奶中的卡那霉素最大殘留限量為O.lSyg/g(約318.5ηΜ)。 因此，需要建立針對卡那霉素檢測的有效方法從而加強對產(chǎn)品中抗生素殘留的監(jiān)控，以滿 足實際生產(chǎn)生活的需要。
[0003] 核酸適體是通過體外篩選獲得的核酸序列，能夠與多種目標物質(zhì)高效、特異地結(jié) 合。由于上述優(yōu)勢，核酸適體已經(jīng)成為了抗體的有效替代，廣泛的應用于小分子、蛋白質(zhì)和 細胞的檢測。伴隨著卡那霉素適體(K-aptamer)的發(fā)現(xiàn)，基于適體的卡那霉素檢測方法得到 了發(fā)展。核酸外切酶III(Exo III)是一種針對雙鏈DNA的平末端3'端進行切割的核酸酶。通 過將K-aptamer和Exo III結(jié)合，就可以很方便的實現(xiàn)信號的放大，將其應用于卡那霉素的 檢測即可實現(xiàn)實際樣品中卡那霉素的靈敏檢測。
[0004] 現(xiàn)今檢測卡那霉素常見技術(shù)主要包括有分光光度法，高效液相色譜法，熒光法，酶 聯(lián)免疫法及電化學法等。與其他分析檢測方法相比，電化學方法具有的設備簡單，價格低 廉、靈敏度高、簡便快捷等優(yōu)點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是將核酸適體、核酸外切酶的循環(huán)酶切及電化學檢測技術(shù)的優(yōu)勢結(jié) 合起來，建立一種簡單、成本低廉，而又具有極高靈敏度并可方便應用于實際樣品卡那霉素 殘留的檢測方法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案:本發(fā)明是一種基于適體引發(fā)的核酸外切酶IlKExo III)循環(huán) 酶切的卡那霉素殘留的檢測方法，將金電極表面修飾單鏈DNA(ssDNA)，加入少量卡那霉素 適體(K-aptamer)使之與ssDNA配對結(jié)合形成雙鏈DNA(dsDNA)，得到存在少量dsDNA和大量 ssDNA的電極修飾界面;加入Exo III，利用Exo III可特異性的酶切dsDNA中ssDNA的特性， 導致K-aptamer的釋放，而釋放的K-aptamer又可以重新和電極表面的ssDNA結(jié)合形成dsDNA 促使Exo III的再次切割；當體系存在卡那霉素時，卡那霉素與K-aptamer的特異性結(jié)合抑 制了Exo III的循環(huán)酶切，使得電極表面的ssDNA得以保留且保留量與卡那霉素的濃度成正 比；利用ssDNA可吸附電信號分子六氨合f了（RuHex)，米用電分析方法對電極表面吸附的 RuHex進行定量，通過測定一系列標準濃度卡那霉素的所得到的RuHex峰值大小繪制標準曲 線，即可實現(xiàn)實際牛奶樣品中卡那霉素殘留的靈敏檢測。
[0007] 方法包括以下步驟:金電極的預處理、ssDNA的修飾、K-aptamer與電極表面ssDNA 的互補配對結(jié)合、樣品孵育、Exo III的循環(huán)酶切，卡那霉素殘留的電化學表征。
[0008] (1)金電極的預處理
[0009] 用1微米、0.3微米的三氧化二粉末分別對直徑為3mm金圓盤電極進行拋光，之后用 酒精和超純水分別超聲5分鐘。清洗之后將金圓盤電極分別置于水虎魚(濃硫酸:H 2〇2的體積 比為3:1)和50 %的硝酸溶液中浸泡5分鐘和30分鐘。之后將處理好的電極置于0.5MH2S〇4中， 在0-1.5V電壓范圍內(nèi)進行循環(huán)伏安掃描，掃速設置為0. lV/s，直至達到穩(wěn)定后，用氮氣吹干 電極界面。
[0010] (2)ssDNA 的修飾
[0011] 用固定溶液（l〇mM Tris，lmM EDTA，0.1M NaCl，10mM TCEP，pH 7.4)稀釋ssDNA至 1 μΜ。將（1)中處理好的金電極置于上述100yL溶液中，室溫浸泡12h后，隨后用超純水沖洗，以 去除金表面未共價結(jié)合的核酸分子。緊接著再將電極浸泡在ImM巰基己醇(MCH)溶液1小時， 之后再次用超純水沖洗。
[0012] 上述ssDNA的序列為 j'-SH-TCG GCT TAG CCT CAA CCC CCA-3'。
[0013] (3)K_aptamer與電極表面ssDNA的互補配對結(jié)合
[0014] 用雜交溶液（l〇mM PBS，0.25M NaCl，pH 7.4)稀釋K-aptamer至InM。將（2)中得到 的ssDNA修飾的電極浸泡于上述100yL溶液中，之后90°C加熱5分鐘，再緩慢冷卻至室溫，使 得ssDNA與K-aptamer充分配對結(jié)合。
[0015] 上述K-aptamer的序列為 W-TGG GGG TTG AGG CTA AGC CGA-3'〇
[0016] (4)樣品孵育
[0017] 用綁定溶液（10禮？85,0.謂似(：1，5111]\11%(：12,5111]\11((：1印!17.4)稀釋卡那霉素至 不同的濃度的標準液。將(3)中得到的修飾電極浸泡在上述50yL不同濃度的卡那霉素溶液 中 37°C 孵育 10 分鐘。之后用沖洗溶液（2〇111]\11^8-!1(：1，0.謂恥(：1，5111]\11^(：12，1%了￥6611-20，？!17.4)沖洗。
[0018] (5)Exo III的循環(huán)酶切
[0019] 將經(jīng)過⑷處理得到的電極浸泡在50yL含有?υ·μΓ1 Exo III(購自NEB)的1XNEB 溶液(與Exo III配套，直接稀釋后使用即可）中37°C反應1小時。
[0020] (6)卡那霉素殘留的電化學表征
[0021]用沖洗溶液充分沖洗經(jīng)過（5)處理的電極，之后用含有5μΜ RuHex的10mM Tris-HC1緩沖溶液(pH 7.4)掃描電極。本檢測采用的電化學工作站(CHI 660E)，以飽和甘汞電極 為參比電極，鉑電極為對電極。使用的掃描手段為方波伏安法，電位設置為-0.56V到-0.1 V， 掃速0.025V/S?？敲顾氐牧吭蕉啵槐Ａ舻膕sDNA也就越多，得到的電信號也就越強。通過 繪制標準曲線，計算出樣品中卡那霉素的濃度。
[0022]在lpM to 500pM范圍內(nèi)，電信號隨著卡那霉素濃度的升高而增加，電信號與濃度 存在線性關(guān)系。
[0023]本發(fā)明的有益效果:①本方法利用K-aptamer對卡那霉素的選擇性，結(jié)合Exo III 的信號放大和電化學檢測方法靈敏、方便的優(yōu)勢，實現(xiàn)了牛奶中卡那霉素的檢測，靈敏度極 高，對牛奶中卡那霉素的快速、靈敏檢測具有重要意義;②在方法學上具有普遍借鑒意義， 通過改變體系中的適體序列，就可以設計出多種抗生素殘留檢測的高靈敏度的分析方法。
【附圖說明】
[0024] 圖1為基于適體引發(fā)的Exo III循環(huán)酶切的卡那霉素殘留檢測原理圖
[0025] 圖2為基于適體引發(fā)的Exo III循環(huán)酶切的卡那霉素殘留檢測條件優(yōu)化圖
[0026] 圖3為基于適體引發(fā)的Exo III循環(huán)酶切的卡那霉素殘留檢測專一性圖
[0027] 圖4為不同濃度卡那霉素存在下，電化學信號與卡那霉素的濃度關(guān)系圖
【具體實施方式】
[0028] 實施例1.基于適體引發(fā)