0·9、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、96、100、200、300、400、500、600、 700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500和/或500(^8/1111血清濃度/單 次或多次施用或它們的任何范圍、數(shù)值或部分。
[0087]作為非限制性實例，對象的治療可使用單次劑量、輸注劑量或重復劑量在1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少之一，或者可選地或另外地，1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52周中的至少之一，或 者可選地或另外地，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20年中的至 少之一，或者它們的任何組合提供一次或定期劑量的本發(fā)明的組合物：〇.lng/kg/天至 100mg/kg/天，如0·0001、0·001、0·01、0·1、0·5、0·9、1·0、1·1、1·5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、 80、90 或 I OOmg/kg/天。
[0088]在某些實施方式中，本發(fā)明的藥物組合物的劑量可任選地包括約0.01mg/kg至約 0.511^/1^的他克莫司，包括但不限于0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、 0.1、0.2、0.3、0.4和/或0.511^/1^/施用或它們的任何范圍、數(shù)值或部分，或者以實現(xiàn)約2.0、 2.5、 2.9、3.0、3.5、3.9、4.0、4.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、 8·9、9·0、9·5、9·9、10、10·5、10·9、11、11·5、11·9、20、12·5、12·9、13·0、13·5、13·9、14·0、 14.5、 4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、 10.9、 11、11.5、11.9、12、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14、14.5、15、15.5、15.9、16、16.5、 16.9、 17、17.5、17.9、18、18.5、18.9、19、19.5、19.9、20ng/ml的血液水平的他克莫司。
[0089] 具體地，可以將本發(fā)明的藥物組合物在幾周的病程內(nèi)一周施用至少一次。在一個 實施方式中，將藥物組合物在幾周至幾月內(nèi)一周施用至少一次。在另一實施方式中，將藥物 組合物在四周至八周內(nèi)一周施用一次。在另一實施方式中，將藥物組合物在四周內(nèi)一周施 用一次。
[0090] 更具體地，藥物組合物可以如下施用：一天至少一次保持約2天、一天至少一次保 持約3天、一天至少一次保持約4天、一天至少一次保持約5天、一天至少一次保持約6天、一 天至少一次保持約7天、一天至少一次保持約8天、一天至少一次保持約9天、一天至少一次 保持約10天、一天至少一次保持約11天、一天至少一次保持約12天、一天至少一次保持約13 天、一天至少一次保持約14天、一天至少一次保持約15天、一天至少一次保持約16天、一天 至少一次保持約17天、一天至少一次保持約18天、一天至少一次保持約19天、一天至少一次 保持約20天、一天至少一次保持約21天、一天至少一次保持約22天、一天至少一次保持約23 天、一天至少一次保持約24天、一天至少一次保持約25天、一天至少一次保持約26天、一天 至少一次保持約27天、一天至少一次保持約28天、一天至少一次保持約29天、一天至少一次 保持約30天或一天至少一次保持約31天。
[0091 ] 可選地，藥物組合物可以如下施用:每1天約一次、每兩天約一次、每3天約一次、每 4天約一次、每5天約一次、每6天約一次、每7天約一次、每8天約一次、每9天約一次、每10天 約一次、每11天約一次、每12天約一次、每13天約一次、每14天約一次、每15天約一次、每16 天約一次、每17天約一次、每18天約一次、每19天約一次、每20天約一次、每21天約一次、每 22天約一次、每23天約一次、每24天約一次、每25天約一次、每26天約一次、每27天約一次、 每28天約一次、每29天約一次、每30天約一次或每31天約一次。
[0092] 本發(fā)明的藥物組合物可替選地可以如下施用：每一周約一次、每兩周約一次、每3 周約一次、每4周約一次、每5周約一次、每6周約一次、每7周約一次、每8周約一次、每9周約 一次、每10周約一次、每11周約一次、每12周約一次、每13周約一次、每14周約一次、每15周 約一次、每16周約一次、每17周約一次、每18周約一次、每19周約一次、每20周約一次。
[0093 ]可替選地，本發(fā)明的藥物組合物可以如下施用:每1個月約一次、每兩個月約一次、 每3個月約一次、每4個月約一次、每5個月約一次、每6個月約一次、每7個月約一次、每8個月 約一次、每9個月約一次、每10個月約一次、每11個月約一次或每12個月約一次。
[0094] 可替選地，藥物組合物可以如下施用：一周至少一次保持約兩周、一周至少一次保 持約3周、一周至少一次保持約4周、一周至少一次保持約5周、一周至少一次保持約6周、一 周至少一次保持約7周、一周至少一次保持約8周、一周至少一次保持約9周、一周至少一次 保持約10周、一周至少一次保持約11周、一周至少一次保持約12周、一周至少一次保持約13 周、一周至少一次保持約14周、一周至少一次保持約15周、一周至少一次保持約16周、一周 至少一次保持約17周、一周至少一次保持約18周、一周至少一次保持約19周或一周至少一 次保持約20周。
[0095] 可替選地，藥物組合物可以如下施用：一周至少一次保持約1個月、一周至少一次 保持約兩個月、一周至少一次保持約3個月、一周至少一次保持約4個月、一周至少一次保持 約5個月、一周至少一次保持約6個月、一周至少一次保持約7個月、一周至少一次保持約8個 月、一周至少一次保持約9個月、一周至少一次保持約10個月、一周至少一次保持約11個月 或一周至少一次保持約12個月。
[0096] 本發(fā)明的藥物組合物(例如，干細胞動員劑和/或免疫抑制劑)可通過相同或不同 的施用途徑同時或相繼施用。藥物組合物還可以與一種或多種另外的治療劑組合。用于本 發(fā)明的方法中的藥物組合物的特性和量的確定可由本領(lǐng)域普通的醫(yī)學從業(yè)者使用本領(lǐng)域 已知的標準技術(shù)容易地進行。在【具體實施方式】中，本發(fā)明的干細胞動員劑可以與有效量的 免疫抑制劑組合施用。在其它【具體實施方式】中，干細胞動員劑和免疫抑制劑可以與有效量 的另一干細胞動員劑、另一免疫抑制劑或另一治療劑組合施用。
[0097] 在多種實施方式中，本發(fā)明的干細胞動員劑結(jié)合免疫抑制劑（以及任選地另一干 細胞動員劑、另一免疫抑制劑或另一治療劑)可以如下施用:在大約同時、間隔小于1分鐘、 間隔小于2分鐘、間隔小于5分鐘、間隔小于30分鐘、間隔1小時、間隔約1小時、間隔約1至約2 小時、間隔約2小時至約3小時、間隔約3小時至約4小時、間隔約4小時至約5小時、間隔約5小 時至約6小時、間隔約6小時至約7小時、間隔約7小時至約8小時、間隔約8小時至約9小時、間 隔約9小時至約10小時、間隔約10小時至約11小時、間隔約11小時至約12小時、間隔約12小 時至18小時、間隔18小時至24小時、間隔24小時至36小時、間隔36小時至48小時、間隔48小 時至52小時、間隔52小時至60小時、間隔60小時至72小時、間隔72小時至84小時、間隔84小 時至96小時或間隔96小時至120小時。在特定實施方式中，在就診的相同患者內(nèi)施用兩種或 更多種療法。
[0098] 在某些實施方式中，組合的本發(fā)明的干細胞動員劑結(jié)合免疫抑制劑（以及任選地 另一干細胞動員劑、另一免疫抑制劑或另一治療劑)循環(huán)施用。循環(huán)療法涉及施用第一療法 (例如，干細胞動員劑)保持一段時間，隨后施用第二療法（例如，免疫抑制劑)保持一段時 間，任選地，隨后施用可能的第三療法保持一段時間等，并重復該相繼施用，例如，循環(huán)，以 便降低對其中一種療法形成抗性，避免或降低其中一種療法的副作用和/或改善治療的功 效。在某些實施方式中，可以重復本發(fā)明的組合療法的施用并且施用可以隔開至少1天、2 天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2個月、75天、3個月或至少6個月。
[0099]無需進一步詳述，據(jù)信本領(lǐng)域技術(shù)人員使用前面描述，可在最大程度上利用本發(fā) 明。下述實施例僅為示例性的，并且不以任何方式限制本公開的其余部分。
[0100] 實施例
[0101] 提出下列實施例以便為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供本文所述和要求保護的化合物、 組合物、制品、裝置和/或方法如何制得和評價的完整的公開內(nèi)容和說明，旨在是純粹示例 性的，并且不旨在限制發(fā)明人視為的發(fā)明范圍。雖然就數(shù)字(例如，量、溫度等)而言已努力 確保準確，但仍應該對某些誤差和差異在此處進行說明。除非另外指出，否則份是重量份， 溫度以°(：計或為環(huán)境溫度，并且壓力等于或接近大氣壓。存在以下反應條件的許多變型和 組合:例如，組分濃度、所需要的溶劑、溶劑混合物、溫度、壓力以及可以用于優(yōu)化從所描述 的工藝中獲得的產(chǎn)品純度和產(chǎn)率的其它反應范圍和條件。僅需要合理的和常規(guī)的實驗來優(yōu) 化這類工藝條件。
[0102] 在全皮層切除之后內(nèi)源性干細胞的藥理學動員顯著促進皮膚再生:AMD3100和他 克莫司的協(xié)同活性
[0103] 干細胞療法已經(jīng)在治療包括皮膚創(chuàng)傷在內(nèi)的多種病狀中顯示出希望，但實際應用 仍難以實現(xiàn)。在此，我們顯示由AMD3100和低劑量的他克莫司產(chǎn)生的內(nèi)源性干細胞動員能夠 將完全治愈由手術(shù)切除產(chǎn)生的全皮層創(chuàng)傷的時間減少25%。同樣重要的是，治愈伴隨著瘢 痕形成減少以及毛囊再生。尋找機制中，我們發(fā)現(xiàn)與低劑量的他克莫司組合的AMD3100動員 增加數(shù)目的譜系-陰性c-Kitf3、CD34l)和CD1331?干細胞。低劑量的他克莫司還增加創(chuàng)傷 部位中含有SDF-I的巨噬細胞的數(shù)目，從而增強動員的干細胞至創(chuàng)傷的"拉入"。譜系示蹤顯 示CD133干細胞在增強毛細血管和毛囊新生起關(guān)鍵作用，有助于更迅速且完美的治愈。我們 的發(fā)現(xiàn)提供對于創(chuàng)傷愈合和組織再生的重要治療方法。
[0104] 材料和方法
[0105] 動物。C57BL/6J小鼠購買自 Jackson Laboratory (Bar Harbor，ME)并且在本研究 中被命名為野生型小鼠。CDl 33+/C-L小鼠（Zhu等，2009)獲得自St Jude Children's Research Hospital (Memphis，TN) QmT/mG小鼠由 Steven D · Leach博士友情提供。mT/mG在 Cre切除之前表達細胞膜靶向的tdTomato( "mT"），并且在Cre切除之后表達細胞膜靶向的 EGFP("mG"），從而允許實時可視化和區(qū)別重組細胞和非重組細胞(Muzumdar等，2007)。當 mT/mG小鼠與CD133-Cre小鼠雜交時(Zhu等，2009)，mG標記的GFP可通過可誘導的CD133-Cre 轉(zhuǎn)基因系生成（Zhu 等，2009) DDA(RTlAa)大鼠購買自 Harlan Sprague-Dawley (Indianapolis，I N，USA)。將所有動物保持在Johns Hopkins醫(yī)療機構(gòu)（Johns Hopkins Medical Institutions)的無特定病原的設施中。根據(jù)NIH指導方針并且在Johns Hopkins 大學動物護理委員會(Johns Hopkins University Animal Care Committee)批準的方案 下護理動物。將年齡-和性別-匹配的小鼠和大鼠用于實驗。需要醫(yī)療照顧的動物提供有適 當?shù)墨F醫(yī)護理或執(zhí)業(yè)的獸醫(yī)的治療并且從所述的研究中排除。
[0106] 體內(nèi)切除創(chuàng)傷模型。將8-12周齡的動物用異氟烷麻醉。刮剃背部皮膚并用聚維酮 碘和70 %乙醇清洗。在小鼠中，將中線和在中線各側(cè)I cm的四個點通過鋼筆做標記。兩個點 在肋緣水平，兩個點在指定用于切除的部位的髂嵴處(圖1A)。在大鼠中，四個切除創(chuàng)傷位于 中線任一側(cè)Icm以及肋緣與髂嵴之間中點的上方和下方Icm(圖7a)。將消毒的一次性活檢穿 孔器(直徑為5mm;Milte X)垂直對齊標記的中心，通過施加壓力并且同時扭動穿通皮膚和肉 膜。重復相同程序，從而在每只動物上生成四處創(chuàng)傷(Tomlinson和Ferguson，2003)。在恢復 意識之后，將動物各自飼養(yǎng)。對于用夾板固定創(chuàng)傷的小鼠模型，在中背部上的中線的各側(cè)進 行一個5mm切除。然后，將直徑為創(chuàng)傷直徑兩倍的炸面圈形、0.5mm厚的娃酮夾板(Grace Bio-Laboratories，Bend，OR)居中、縫合并粘牢（KrazyG丨ue?;Elmer，s Inc ·，Columbus， OH)(圖 IF;Gal iano等，2004)。
[0107] 對動物皮下注射AMD3100(AMD) (I · Omg kg-1，每兩天，Sigma-Aldrich，St Louis， MO)或他克莫司（T)(0.Img kg'每天，購買自Johns Hopkins醫(yī)院的藥房）。從第0天至完全 閉合當天，將較高劑量的AMD(5.0mg kg^1，每兩天)或T(1 .Omg kg'每天)施用至受傷小鼠 以測定劑量-響應。
[0108] 以指定的時間間隔對每個創(chuàng)傷部位數(shù)碼拍照，并且使用Adobe Photoshop(版本 7.0;Adobe Systems，San Jose，CA)測定照片上的創(chuàng)傷區(qū)。將隨著時間的推移創(chuàng)傷區(qū)的變化 表達為最初創(chuàng)傷區(qū)的百分比（圖1B)。
[0109] 通過局部皮內(nèi)注射抗-SDF-I抗體使SDF-I失活。在另外一系列實驗中，在產(chǎn)生創(chuàng)傷 之后，在用雙重藥物療法(AMD+低劑量的T)治療之前，將含50μ1的15yg Hir1Uu等，2013)中 和的抗-SDF-I抗體(MAB310,R&D Systems ,Minneapolis，MN)的鹽水皮內(nèi)注射至右側(cè)的兩個 創(chuàng)傷，而將在左側(cè)的其它兩個創(chuàng)傷用等量的同種型匹配IgG(MCA 1209，AbD Serotec， Raleigh，NC)處理作為對照。將流體以每日一次注入接近創(chuàng)傷的皮膚并且注入創(chuàng)面，隨后進 行組合方案治療直至創(chuàng)傷閉合。在整個觀察期，這些行為平行于單獨用鹽水處理的另一陰 性(媒介物)對照組。
[0110]組織學和顯微術(shù)。在損傷之后第3天、第5天、第7天、第9天和第15天收集來自創(chuàng)傷 部位的組織。
[0111]譜系示蹤研究:雙重治療的小鼠的創(chuàng)傷部位的CD 133+細胞的主要積聚（圖3B)促 進使用體內(nèi)譜系示蹤系統(tǒng)以進一步探究CD 133+干細胞/祖細胞在皮膚再生中的作用。為激 活由CD133C-L基因座表達的CreERT2,從而不可逆地激活在CD133+細胞及其后代中GFP的表 達，在手術(shù)之前7天，將成年mT/mG; CD 133+/C-L-RosaEGFP小鼠腹膜內(nèi)注射溶解于玉米油中 的5.0mg他莫昔芬(Sigma)(圖6a;Muzumdar等，2007)。參考描述CD1