用于鑒別靶細胞特異性靶表位的靶抗原發(fā)現(xiàn)、表型篩選及其用圖
【專利說明】用于鑒別靶細胞特異性靶表位的靶抗原發(fā)現(xiàn)、表型篩選及其用途
[0001 ] 相關(guān)申請
[0002]本申請要求涉及2013年6月28日提交的名稱為“勒抗原發(fā)現(xiàn)和表型篩選”的美國臨時申請第61/840，583號的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容全文并入本文。
[0003]發(fā)明背景
[0004]結(jié)合多肽，例如抗體及其片段，作為治療和診斷劑在商業(yè)上十分重要。篩選結(jié)合多肽的傳統(tǒng)方法一般采用可溶性抗原。然而，對于某些細胞表面抗原，這些抗原上的構(gòu)象表位在抗原從質(zhì)膜溶出(solubilized)時改變，導致不能產(chǎn)生可以識別天然抗原的結(jié)合多肽。因此，本領(lǐng)域需要篩選可以特異性結(jié)合處于其天然構(gòu)象的細胞表面抗原的結(jié)合多肽的新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了鑒別特異性結(jié)合細胞表面抗原的結(jié)合多肽(例如，抗體或其抗原結(jié)合片段)的方法和組合物。本發(fā)明的方法一般地包括將結(jié)合多肽的多樣化核酸展示文庫與細胞外表面上展示的細胞表面抗原接觸;和從文庫分離特異性結(jié)合細胞外表面上的細胞表面抗原的至少一個文庫成員。本發(fā)明的方法和組合物特別有利的地方在于它們允許快速鑒別結(jié)合靶細胞表面抗原的天然形式的結(jié)合多肽。這些方法和組合物也允許鑒別新型的、有治療作用的細胞類型特異性抗原或表位。
【附圖說明】
[0006]圖1是本發(fā)明的示例性DNA展示組合物和篩選方法的示意圖。
[0007]圖2是本發(fā)明的示例性DNA展示組合物和篩選方法的示意圖。
[0008]圖3是本發(fā)明的方法中采用的示例性靶細胞篩選策略的示意圖。
[0009]圖4是本發(fā)明的方法中采用的示例性平行篩選和深度測序策略的示意圖。
[0010]圖5是本發(fā)明的方法中采用的示例性平行篩選和深度測序策略的示意圖。
[0011]圖6是本發(fā)明的方法中采用的示例性平行篩選和深度測序策略的示意圖。
[0012]圖7是本發(fā)明的方法中采用的示例性平行篩選策略結(jié)果的示意圖。
[0013]圖8描繪了示出使用本發(fā)明的方法選擇的高親和性VH分子的基于FACS結(jié)合分析的結(jié)果的圖。
[0014]圖9描繪了示出使用本發(fā)明的方法選擇的VH分子的差異結(jié)合的圖。
[0015]圖10描繪了示出使用本發(fā)明的方法選擇的VH分子的差異結(jié)合的圖。
[0016]詳細描述
[0017]1.定義
[0018]本文所用術(shù)語“核酸展示文庫”是指任何本領(lǐng)域認可的體外無細胞表型-基因型相聯(lián)展示，包括，但不限于如例如美國專利第7，195，880;6，951，725;7，078，197;7，022，479;6,518,018；7,125,669；6,846,655；6,281,344；6,207,446；6,214,553；6,258,558；6,261,804；6,429,300；6,489,116；6,436,665；6,537,749；6,602,685；6,623,926；6,416,950；6,660，473;6，312，927;5，922，545;和6，348，315號中，以及在肌2010/011944中陳述的那些，其均通過引用全文并入本文。
[0019]本文所用術(shù)語“抗原”是指被結(jié)合多肽識別的分子。
[0020]本文所用術(shù)語“特異性結(jié)合”是指結(jié)合分子(例如VH或VL域)以至少約1x10—6M、1x10—7M、1x10—8M、1x10—9M、1x10—1qM、1x10—nM、1x10—12M 或更高的親和性結(jié)合抗原，和/或以比其對非特異性抗原的親和性高至少2倍的親和性結(jié)合靶的能力。
[0021]本文所用術(shù)語“抗體”是指包含四條多肽鏈的免疫球蛋白分子一一通過二硫鍵相互連接的2條重(H)鏈和2條輕(L)鏈——及其多聚體(multimer)(例如，IgM)。每條重鏈包含重鏈可變區(qū)(縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含3個域，CHl、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(縮寫為VL)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含I個域(CLl) 和VL區(qū)可進一步細分成超變區(qū)，稱為互補決定區(qū)(CDR)，穿插有更保守的稱為框架區(qū)(FR)的區(qū)域。
[0022]本文所用術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”包括特異性結(jié)合抗原以形成復合體的任何天然存在的、可酶促獲得的、合成的或基因工程化的多肽或糖蛋白。使用任何適合的標準技術(shù)，例如蛋白水解消化或重組基因工程技術(shù)(包括操縱和表達編碼抗體可變域和任選地恒定域的DNA)，可以從例如完全抗體分子獲得抗體的抗原結(jié)合片段。抗原結(jié)合部分的非限制性實例包括:(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(V)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段;和(vii)由模擬抗體超變區(qū)的氨基酸殘基構(gòu)成的最小識別單元(例如，分離的互補決定區(qū)(CDR))。其他工程化分子，例如雙體、三體、四體和微型抗體(minibodies)也包含在表述“抗原結(jié)合部分”中。
[0023]本文所用術(shù)語“VH±或”和“VL±或”分別指單個抗體重鏈和輕鏈可變域，包含F(xiàn)R(框架區(qū))1、2、3和4以及CDR(互補決定區(qū))1、2和3(參見Kabat等，(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest.(NIH Publicat1n N0.91-3242,Bethesda))。
[0024]I1.細胞表面抗原
[0025]在某些方面，本發(fā)明提供了鑒別特異性結(jié)合細胞表面抗原的結(jié)合多肽的方法。
[0026]任何能夠在細胞表面上展示的抗原都可用于本發(fā)明的方法中，包括但不限于，蛋白質(zhì)、聚糖和/或脂質(zhì)抗原。在某些實施方式中，抗原是天然存在的分子。天然存在的抗原的適合的非限制性實例包括跨膜蛋白(例如，G蛋白偶聯(lián)受體)和GPI錨定蛋白。在某些實施方式中，抗原是非天然存在的重組或合成抗原。天然存在的抗原的適合的非限制性實例包括包含來自不同抗原分子的部分的嵌合抗原。在某些實施方式中，在實施本發(fā)明的方法之前已知抗原的身份。在某些實施方式中，在實施本發(fā)明的方法之前未知抗原的身份。
[0027]本發(fā)明的方法中采用的細胞表面抗原可以在任何細胞或細胞樣顆粒(例如，脂質(zhì)囊泡)上展示。在某些實施方式中，細胞是天然表達細胞表面抗原的細胞類型。在某些實施方式中，細胞是工程化以異源性表達細胞表面抗原的重組細胞。在某些實施方式中，細胞是正常細胞的疾病相關(guān)變異體(例如，腫瘤細胞)。
[0028]II 1.結(jié)合多肽
[0029]在某些方面，本發(fā)明提供了鑒別特異性結(jié)合細胞表面抗原的結(jié)合多肽的方法。
[0030]任何類型的結(jié)合多肽都可用于本發(fā)明的方法中，包括但不限于，抗體或其片段及免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。適合的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域包括但不限于纖連蛋白結(jié)構(gòu)域(參見，例如，Koide等，(2007) ,Methods Mol.B1l.352:95-109，其通過引用全文并入本文)、DARPin(參見，例如，Stumpp等(2008)Drug Discov.Today 13(15-16):695-701，其通過引用全文并入本文)、蛋白質(zhì)A的Z結(jié)構(gòu)域(參見，Nygren等(2008)FEBS J.275( 11):2668-76，其通過引用全文并入本文)、脂質(zhì)運載蛋白(參見，例如，Skerra等(2008)FEBS J.275(11): 2677-83，其通過引用全文并入本文)、Affilins(參見，例如，Ebersbach等(2007)J.Mol.B1l.372(1):172-85，其通過引用全文并入本文)、Af fitins(參見，例如，Krehenbr ink等(2008).J.Mol.B1l.383(5): 1058-68，其通過引用全文并入本文)、Avimers (參見，例如，Si Iverman等(2005 )Nat.B1technol.23(12): 1556-61，其通過引用全