用于治療和預(yù)防黃斑變性的組合物和方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求保護(hù)2013年4月17日提交的美國臨時專利申請No.61/813,014的權(quán)益， 其在本文W其全文通過提述并入。
[0003] 序列表
[0004] 本申請包含將WASCII形式經(jīng)由EFS-Web提交的序列表，且其在本文W其全文通過 提述并入。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明一般地設(shè)及用于治療和預(yù)防黃斑變性的方法。具體地，本發(fā)明與使用白細(xì) 胞介素-17的抑制劑用于治療或預(yù)防年齡相關(guān)性黃斑變性的方法相關(guān)。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是老年人中中央不可逆失明的首要原因。AMD的早期臨 床表現(xiàn)設(shè)及碎片的視網(wǎng)膜下堆積(玻璃痛）。逐漸發(fā)展伴隨顯著的黃斑細(xì)胞變性和萎縮的地 圖狀萎縮(geographic atro地y，GA)，或新生血管性AMD(nAMD)，其中在疾病末期伴隨脈絡(luò) 膜新生血管的發(fā)生W試圖捶救變性的視網(wǎng)膜。黃斑視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)變性后感光 細(xì)胞萎縮時導(dǎo)致失明。（化rcio等，Invest Ophthalmol .Vis. Sci . (1996)37:1236-1249.
[000引發(fā)病機(jī)理取決于年齡、環(huán)境和遺傳風(fēng)險因子，但對疾病發(fā)作負(fù)責(zé)的分子機(jī)制仍在 很大程度上未知。最為突出的已知遺傳因子是存在于免疫調(diào)節(jié)補(bǔ)體因子H(CFH)基因內(nèi)的錯 義突變化dwards等，Science(2005)308:421-424)。在該發(fā)現(xiàn)之后，許多研究已鑒別了與疾 病相關(guān)的活性補(bǔ)體蛋白。補(bǔ)體組分巧a血清水平在AMD患者血清化ecker等,Hum Mol Genet (2010)19:209-215;Reynolds等，Invest Ophthalmol Vis Sci(2009)50:5818-5827; Scholl等，PLoS 0ne(2008)3:e2593)和AMD玻璃痛（Nozaki等，Proc.化tl.Acad.Sci.U.S.A (2006)103: 2328-2333)兩者中都有顯著升高。C5a在人CD4+T淋己細(xì)胞中刺激白細(xì)胞介素-17A(IL17A)的產(chǎn)生化iu等J IYansl Med(2011)9:lll)且該IL17A細(xì)胞因子已知驅(qū)動慢性 炎癥W及自身免疫和神經(jīng)退行性疾病，包括多發(fā)性硬化和阿爾茨海默氏?。℉u等， Neurology(2010)75:2079-2086)。因此，運些數(shù)據(jù)將在AMD患者中觀察到的增加的IL17A蛋 白血清水平與玻璃痛中增強(qiáng)的補(bǔ)體表達(dá)關(guān)聯(lián)在一起化iu等J化ansi Med(2011)9:lll)。 此外，已報到IL17受體C(IL17RC)基因在具有不同（discordant)疾病的雙胞胎和兄弟姐妹 中W及在大型群體中的區(qū)別性低甲基化表明IL17A通路為該疾病中的關(guān)鍵成員（Wei等， Cell Repods(2012)2:1151-1158)。盡管IL17A存在于AMD患者血清中，但其是否與視網(wǎng)膜 變性相關(guān)仍未知。
[0009] 本發(fā)明是基于對IL17抑制劑可用于治療黃斑變性的意外發(fā)現(xiàn)。IL17A，一種促炎性 細(xì)胞因子，在焦視網(wǎng)膜變性中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。與年齡匹配的對照相比，IL17A和 IL17RC轉(zhuǎn)錄物及蛋白在AMD患者黃斑中顯著升高，且具有重組IL17A的ARPE-19細(xì)胞系的治 療降低了細(xì)胞生存力，引起胞漿脂質(zhì)的積聚并誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。
[0010] Ccl2-/7Cx3crr/-/Crbird8(DK0/rd8)小鼠是進(jìn)行性焦視網(wǎng)膜變性（Chan 等， O地thalmic Res(2000)40:124-128;Tuo等，Invest O地thalmol Vis Sci(2007)48:3827-3836)的模型。DK0/rd8小鼠發(fā)展出兩種不同的病變類型：（1)"AMD樣"表現(xiàn)為R陽和感光細(xì)胞 內(nèi)節(jié)和外節(jié)（IS、0S)的變性和(2)影響內(nèi)和外核層（INL和0NL)神經(jīng)元的"營養(yǎng)不良"rd8-相 關(guān)病變。DK0/rd8病理表現(xiàn)為補(bǔ)體系統(tǒng)和視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的異常調(diào)節(jié)(Ross等，Exp.Eye Res. (2008)86:675-683;Shen等，Invest Ophthalmol Vis Sci(2011)52:2897-2904),其為 AMD病理的關(guān)鍵性免疫組分。驚訝的是，本申請的發(fā)明人已證實降低或抑制IL17活性在治療 DK0/rd8小鼠中有效。通過編碼可溶性IL17受體的腺相關(guān)病毒載體的玻璃體內(nèi)注射中和 IL17顯著改善感光細(xì)胞和R陽變性。已發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜變性是MAPK依賴性的，因為IL17抑制預(yù)防 化kl/2和p38憐酸化。因此，表明IL17在感光細(xì)胞和WE變性中起關(guān)鍵作用因此可用于治療 黃斑變性。
[0011] 因此一些方面，本發(fā)明針對用于在哺乳動物受試者中治療黃斑變性的方法。在實 施方案中，所述方法設(shè)及將包含編碼IL17抑制劑的重組載體的組合物施用至受試者患病 目艮。在實施方案中，所述方法設(shè)及將包含重組腺相關(guān)病毒的組合物施用至受試者的患病眼， 其中所述重組腺相關(guān)病毒包含編碼IL17抑制劑的核酸。
[0012] -些方面，本發(fā)明針對用于在哺乳動物受試者中治療或降低視網(wǎng)膜變性(例如焦 視網(wǎng)膜變性)的方法。在實施方案中，所述方法設(shè)及將包含編碼IL17抑制劑的重組載體的組 合物施用至受試者的患病眼。在實施方案中，所述方法設(shè)及將包含重組腺相關(guān)病毒的組合 物施用至受試者的患病眼，其中所述重組腺相關(guān)病毒包含編碼IL17抑制劑的核酸。在實施 方案中，所述受試者具有黃斑變性。
[0013] -些方面，本發(fā)明針對用于在哺乳動物受試者中治療或降低視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞 (RPE)變性、WE應(yīng)激或WE損傷的方法。在實施方案中，所述方法設(shè)及將包含編碼IL17抑制 劑的重組載體的組合物施用至受試者的患病眼。在實施方案中，所述方法設(shè)及將包含重組 腺相關(guān)病毒的組合物施用至受試者的患病眼，其中所述重組腺相關(guān)病毒包含編碼IL17抑制 劑的核酸。在實施方案中，所述受試者具有黃斑變性。
[0014] -些方面，本發(fā)明針對用于在哺乳動物受試者中治療或降低感光細(xì)胞變性的方 法。在實施方案中，所述方法設(shè)及將包含編碼IL17抑制劑的重組載體的組合物施用至受試 者的患病眼。在實施方案中，所述方法設(shè)及將包含重組腺相關(guān)病毒的組合物施用至受試者 的患病眼，其中所述重組腺相關(guān)病毒包含編碼IL17抑制劑的核酸。在實施方案中，所述感光 細(xì)胞變性在感光細(xì)胞的內(nèi)節(jié)（IS)中。在實施方案中，所述感光細(xì)胞變性在感光細(xì)胞的外節(jié) (OS)中。在實施方案中，所述感光細(xì)胞變性在感光細(xì)胞的內(nèi)節(jié)和外節(jié)（IS/0S)中。在實施方 案中，所述受試者具有黃斑變性。
[0015] -些方面，本發(fā)明針對用于在哺乳動物受試者的患病眼中降低脂褐素或糖原沉積 的方法。在實施方案中，所述方法設(shè)及將包含編碼IL17抑制劑的重組載體的組合物施用至 所述受試者的患病眼。在實施方案中，所述方法設(shè)及將包含重組腺相關(guān)病毒的組合物施用 至受試者的患病眼，其中所述重組腺相關(guān)病毒包含編碼IL17抑制劑的核酸。在實施方案中， 所述受試者具有黃斑變性。
[0016] -些方面，所述方法針對用于在哺乳動物受試者患病眼中降低[2,6-二甲基-8-(2,6,6-S甲基-1-環(huán)己締 -1-基）-化，3E，祀，7E-辛四締]-1-(2-?乙基）-4-[4-甲基-6(2， 6,6-立甲基-1-環(huán)己締 -1-基）1E，3E，祀，76-己立締]-化晚(A2E)的方法。在實施方案中，所 述方法設(shè)及將包含編碼IL17抑制劑的重組載體的組合物施用至所述受試者的患病眼。在實 施方案中，所述方法設(shè)及將包含重組腺相關(guān)病毒的組合物施用至受試者的患病眼，其中所 述重組腺相關(guān)病毒包含編碼IL17抑制劑的核酸。在實施方案中，所述受試者具有黃斑變性。
[0017] -些方面，本發(fā)明針對在哺乳動物受試者的患病眼中用于降低線粒體損傷的方 法。在實施方案中，所述方法設(shè)及將包含編碼IL17抑制劑的重組載體的組合物施用至所述 受試者的患病眼。在實施方案中，所述方法設(shè)及將包含重組腺相關(guān)病毒的組合物施用至受 試者的患病眼，其中所述重組腺相關(guān)病毒包含編碼IL17抑制劑的核酸。在實施方案中，所述 受試者具有黃斑變性。
[0018] 在上述方面和實施方案的任一項中，所述方法可設(shè)及將包含重組腺相關(guān)病毒 (rAAV)的病毒粒子的組合物施用至所述受試者的患病眼，其中所述重組腺相關(guān)病毒(rAAV) 的病毒粒子具有編碼IL17抑制劑的核酸(即所述重組載體在rAAV病毒粒子中）。
[0019] 在上述方法和實施方案的任一項中，所述組合物可進(jìn)一步包含眼科可接受的載 劑。
[0020] 在上述方面和實施方案的任一項中，所述組合物W治療上有效的量施用。
[0021] 在上述方面和實施方案的任一項中，所述IL17抑制劑可W是能夠結(jié)合并調(diào)節(jié)IL17 活性的IL17受體。
[0022] 在上述方面和實施方案的任一項中，所述IL17抑制劑可W是IL17A抑制劑（例如 IL17A 受體）。
[0023] 在一些實施方案中，所述IL17受體(例如IL17A受體)是可溶性受體。
[0024] 在上述方面和實施方案的任一項中，所述IL17抑制劑可W是包含IL17受體和多聚 化結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。在實施方案中，所述多聚化結(jié)構(gòu)域源自免疫球蛋白（Ig)(例如Ig重 鏈;Ig恒定區(qū)；Ig的化區(qū)；Ig的C冊等等）。在實施方案中，所述多聚化結(jié)構(gòu)域源自IgGl、IgG2、 IgG3或IgG4。在一些實施方案中，所述多聚化結(jié)構(gòu)域源自IgGl重鏈的恒定區(qū)。
[0025] 在實施方案中，當(dāng)所述融合蛋白表達(dá)時，產(chǎn)生所述融合蛋白的多聚體。在一些實施 方案中，所述多聚體是同型二聚體。
[00%]在一些實施方案中，所述IL17抑制劑是IL17A抑制劑，如能夠結(jié)合并調(diào)節(jié)IL17A活 性的IL17A受體。
[0027]在一些實施方案中，所述載體/核酸編碼融合蛋白，其包含：
[002引 （a)所述IL17A受體;和
[0029] (b)免疫球蛋白恒定區(qū)多聚化結(jié)構(gòu)域，
[0030] 其中當(dāng)所述融合蛋白表達(dá)時，產(chǎn)生融合蛋白的多聚體。
[0031 ]在進(jìn)一步的實施方案中，所述多聚體是同型二聚體。
[0032] 在額外的實施方案中，所述多聚化結(jié)構(gòu)域包含IgG的CH3結(jié)構(gòu)域，或其活性片段，如 來自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的多聚化結(jié)構(gòu)域。
[0033] 在其他額外的實施方案中，所述多聚化結(jié)構(gòu)域來自IgGl重鏈的恒定區(qū)。
[0034] 上述方法的其他實施方案中，所述IL17受體是可溶性IL17受體。
[0035] 在其他實施方案中，所述融合蛋白包含圖3B(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列或其活 性變體，其中所述活性變體與圖3B(SEQ ID N0:4)的所述序列具有至少85%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性。
[0036] 在上述任何方面和實施方案中，所述重組載體可W是重組病毒，如重組腺相關(guān)病 毒的病毒粒子或重組腺病毒。
[0037] 在上述任何方面和實施方案中，所述黃斑變性是年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)，如干 性施D。
[0038] 在任何上述的方面和實施方案中，所述組合物可W玻璃體內(nèi)施用。
[0039] -些方面，本發(fā)明針對包含編碼IL17抑制劑的多核巧酸的重組載體在制造用于治 療黃斑變性的藥物中的用途。在一些實施方案中，所述多核巧酸編碼融合蛋白，其中所述融 合蛋白包含：
[0040] (a)所述IL17A受體;和
[0041] (b)免疫球蛋白恒定區(qū)多聚化結(jié)構(gòu)域，
[0042] 其中當(dāng)所述融合蛋白表達(dá)時，產(chǎn)生所述融合蛋白的多聚體。
[0043] 在一些實施方案中，所述IL17受體是可溶性IL17受體。
[0044] 在進(jìn)一步的實施方案中，所述融合蛋白包含圖3B(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列或 其活性變體，其中所述活性變體與圖3B(SEQ ID N0:4)的所述序列具有至少85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性。
[0045] 一些方面，所述發(fā)明針對用于治療或降低患病眼中黃斑變性、RPE變性、RPE應(yīng)激、 RPE損傷、感光細(xì)胞變性、脂褐素或糖原沉積;患病眼中的A2E;或線粒體損傷的組合物，其包 含編碼IL17抑制劑的重組載體的組合物(例如，用于本文描述的任一方法中使用）。
[0046] 一些方面，本發(fā)明針對用于治療或降低患病眼中的黃斑變性、R陽變性、RPE應(yīng)激、 RPE損傷、感光細(xì)胞變性、脂褐素或糖原沉積;患病眼中的A2E;或線粒體損傷的組合物，其包 含含有編碼IL17抑制劑的核酸的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)病毒粒子(例如，用于本文描述的 任一方法中使用）。
[0047] 在任何上述的方面和實施方案中，所述組合物包含治療上有效的量的重組載體或 rAAV病毒粒子。
[004引一些方面，本發(fā)明針對編碼IL17抑制劑的重組載體用于本文描述的任一方法的用 途。
[0049] -些方面，本發(fā)明針對包含編碼IL17抑制劑的核酸的rAAV病毒粒子用于治療或降 低患病眼中的黃斑變性、RPE變性、RPE應(yīng)激、RPE損傷、感光細(xì)胞變性、脂褐素或糖原沉積;患 病眼中的A2E;或線粒體損傷的用途(例如，依照本文描述的任一方法）。
[0050] -些方面，本發(fā)明針對包含本文描述的任一組合物的試劑盒。
[0051] -些方面，本發(fā)明針對包含本文描述的任一重組載體的試劑盒。
[0052] -些方面，本發(fā)明針對包含本文描述的任一 rAAV病毒粒子的試劑盒。
[0053] 上述方面中，所述試劑盒可進(jìn)一步包含用于使用所述組合物、重組載體或rAAV病 毒粒子在治療或降低患病眼中的黃斑變性、RPE變性、RPE應(yīng)激、RPE損傷、感光細(xì)胞變性、月旨 褐素或糖原沉積;患病眼中的A2E;或線粒體損傷的使用說明（例如，依照本文描述的任一方 法)。
[0054] 任何上述的方面和實施方案中，所述試劑盒包含治療上有效的量的組合物、重組 載體或rAAV病毒粒子。
[0055] -些方面，本發(fā)明針對包含本文描述的任一組合物的制品。
[0056] -些方面，本發(fā)明針對包含本文描述的任一重組載體的制品。
[0057] -些方面，本發(fā)明針對包含本文描述的任一 rAAV病毒粒子的制品。
[0化引在任何上述的方面和實施方案中，所述rAAV病毒粒子可包含AAVl、AAV2、AAV3、 AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrhS、AA 化 h8R、AAV9、AAVl 0、AAVrh 10、AAV11 或AAV12 血清型 衣殼。在相關(guān)的實施方案中，所述rAAV病毒粒子包含具有AAVl、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、 AAV6、AAV7、AAV8、AAVrhS、AA化h8R、AAV9、AAV10、AA化h 10、AAV11 或 AAV121TR 的重組載體。
[0059] 在一些實施方案中，所述rAAV病毒粒子包含AAV2血清型衣殼，且任選地，所述病毒 粒子包含具有AAV2ITR的重組載體。
[0060] 本發(fā)明的運些和其他實施方案基于本公開內(nèi)容對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將可 輕易發(fā)生。
[0061 ] 附圖簡述
[0062] 圖1A-1B(SEQ ID N0S:1和2)展示代表性的人IL17rA的全長核巧酸序列（圖1A)和 對應(yīng)的氨基酸序列（圖1B)。
[0063] 圖2是融合構(gòu)建體的示意圖，其包含可溶性IL17rA，所述IL17rA與人IgGl免疫球蛋 白的Fc區(qū)的C冊結(jié)構(gòu)域經(jīng)由九個Gly殘基(sIL17R-9gl廠C冊)接頭連接。
[0064] 圖3A和3B(SEQ ID N0S:3和4)顯示圖2描述的sIL17RA-9gl廠CH3構(gòu)建體的核巧酸 序列和相應(yīng)的氨基酸序列。
[00化]圖4是質(zhì)粒pCBA2-int-BGH SIL17R-9G-C冊的圖示。
[0066] 圖5A和5B展示SIL17R與小鼠（圖5A)和人(5BUL17A的結(jié)合。結(jié)合WsIL17R VS.0D 吸收的pM濃度表示。
[0067] 圖6A-抓展示IL17A和IL17RC在病理性人AMD組織中高度表達(dá)。圖6A展示黃斑部脈 絡(luò)膜扣狀體(macular choroidal button)中IL17A表達(dá)的qRT-PCR定量。圖6B展示黃斑中 IL17A的表達(dá)。圖6C展示黃斑中IL17RC的表達(dá)。圖抓展示IL17A和IL17RC蛋白在黃斑節(jié)中的 免疫組化檢測。同型對照僅用第二抗體染色。GA =地圖狀萎縮;MMD =新生血管AMD,總計= GA+nAMD; G化二神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；I化二內(nèi)網(wǎng)層；I化二內(nèi)核層;0化=外網(wǎng)層;0化二外核層；IS/ OS=內(nèi)/外節(jié);R陽二視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。*:P<0.05;**:P<0.005;***:P<0.0005
[006引圖7展示用IL17A稀釋處理4她的細(xì)胞的MTT生存力測試。
[0069] 圖8展示用IL17F稀釋處理4她的細(xì)胞的MTT生存力測試。
[0070] 圖9A和9B展示IL17A的細(xì)胞類型依賴效果。圖9A展示用IL17A稀釋對腎C0S-7細(xì)胞 處理48小時的MTT測試的結(jié)果。圖9B展示通過qRT-PCR評估的ARPE-19和C0S-7間IL17RA和 IL17RC的相對表達(dá)。
[0071] 圖10A-10F展示IL17A敲低顯著改善AMD樣病灶。圖IOA展示巧7BL6N和巧7BL/6J小 鼠的組合對比DK0/rd8,視網(wǎng)膜1117a轉(zhuǎn)錄物作為年齡的函數(shù)的qRT-PCR量化。圖IOB展示接 受SIL17R-對比接受EV-視網(wǎng)膜的眼底結(jié)果。圖IOC展示來自相同小鼠的SIL17R和EV眼中A2E 濃度的配對比較。圖IOD展示SIL17R-VS-EV視網(wǎng)膜中代表性的組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)。與EV(星號） 相比SIL17R保存了感光細(xì)胞IS/0S且保持了 0化的厚度。EV視網(wǎng)膜額外展示了 WE變性。圖 IOE展示EV而非SIL17R RPE(上左和右）中觀察到大量的脂褐素。線粒體(m)在EV RPE(下左） 中不良且混亂分散但在SIL17R RPE(下右)表現(xiàn)良好且線性排列。EV RPE展示了大量的空 泡，未消化的OS和不良的基礎(chǔ)內(nèi)折（下左）。圖IOF展示通過蛋白質(zhì)免疫印跡的MAPK-依賴的 視網(wǎng)膜變性。蛋白分離前EV和SIL17R神經(jīng)視網(wǎng)膜用50ng/ml 1117a離體處理2小時。*:P< 0.05; : P<0.005:林林：P<0.0 OOOl。
[0072] 圖11展示在2個月的年齡相比巧7BL/6N視網(wǎng)膜在DK0/rd8中較高的表達(dá)。使用來自 每個種系(strain)的3只小贏的6份視網(wǎng)膜。
[0073] 圖12A-12C展示SIL17R在視網(wǎng)膜中的檢測。圖12A展示SIL17R蛋白的ELISA檢測。圖 12B展示視網(wǎng)膜1117a的qRT-PCR測量且圖12C展示1116 mRNA，*:P<0.05;n.s.二不顯著。
[0074] 圖13展示病灶計分的小贏內(nèi)配對比較，空載體化V)對比SIL17R(來自40只小贏的 共計80只眼）；對角線右側(cè)的全部點表明SIL17R-處理的眼相比其對應(yīng)對側(cè)表現(xiàn)更佳。
[0075] 圖14A和14B展示注射2個月后SIL17R相對EV視網(wǎng)膜中較化的I117rc轉(zhuǎn)錄物表達(dá)。 圖14A描述qRT-PCR的結(jié)果且圖14B展示末期凝膠。
[0076] 發(fā)明詳述
[0077] 除非另外表明，本發(fā)明的實踐將采用化學(xué)、生化、重組DNA技術(shù)和免疫學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的 常規(guī)方法D這些技術(shù)在文獻(xiàn)中已詳盡解釋D參見，例如Fundamental Virology ,2nd Edition，vol.I&II(B.N.Fields和D.M.Knipe，eds.);Handbook of Experimental Immunology，VoIs.I-IV(D.M.Weir和C.C.BlackweII eds.,Blackwell Scientific Publications)；T.E. Creighton, Proteins : Structures and Molecular Properties (W.H.Freeman和Company，1993);A.L.Lehninger,BiochemiStry(Worth Publishers,Inc.， current addition);Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan eds.,Academic Press，Inc.);Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook等，4扣 ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，N.Y.，2012);Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,等 eds. ,2003);系列化書 Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.);PC民 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson, B.D.Hames和G.民.Taylor eds.,1995);Antibodies,A Laboratory Manual(Harlow和Lane, eds.，1988);Culture of Animal Ce 11s: A Manual of Basic Technique and Specialized Ap plications(民.I.Freshney ed.，J.Wiley 和 Sons ,2010); Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press;Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.CelI is，ed.，Academic Press，1998);Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.民oberts, Plenum Press，1998);Cell and Tissue Culture : Laboratory Procedures(A.Doyle， J.B.Griffi^s,和D.G.Newell，eds.,J.Wiley和Sons,1993-8);gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos,eds.,1987);PCR:The Polymerase Qiain 民eactio打，(Mullis等，eds.，1994);Curre打t Protocols in Immunology(J.E.Coligan^, eds.,1991);Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等，eds.，J.Wiley和Sons, 2002);Immunobiology(C.A.Janeway等，2004);Antibodies(P.Finch,1997);Antibodies: A Practical Approach(D.Catty.，ed.，I民L Press,1988-1989);Monoclonal Antibodies : A Practical Approach(P. Shepherd和C. Dean，eds.，Oxford University Press,2000); Using Antibodies : A Laboratory Manual(E. Harlow和D. Lane，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999);The Antibodies(M.Zanetti和J.D. Capra，eds.，Harwood Academic Publishers，1995);和Cancer : Principles and Practice of Oncology (V.T.DeVi1:a等，eds. ,J.B.