結(jié)合egfr和met的多功能抗體的制作方法
【專利摘要】提供多功能抗體和/或抗原結(jié)合片段，所述多功能抗體和/或抗原結(jié)合片段結(jié)合人表皮生長因子受體(EGFR)和MET并抑制其活性，并且在治療其中發(fā)病機(jī)理受EGFR和MET介導(dǎo)的癌癥和其他疾病、病癥或狀況中是有效的。
【專利說明】結(jié)合EGFR和MET的多功能抗體
[00011本發(fā)明涉及結(jié)合人表皮生長因子受體(EGFR)和MET的多功能抗體、其生產(chǎn)方法、包 含所述多功能抗體的藥物組合物及其用途。
[0002] EGFR是生長因子受體的1類酪氨酸激酶家族的成員，其在細(xì)胞生長、分化和存活中 起重要作用。這些受體的激活通常經(jīng)特異性配體結(jié)合與酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的隨后自磷酸化 而發(fā)生。該激活引發(fā)涉及細(xì)胞增殖和存活的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的級(jí)聯(lián)。
[0003] 靶向EGFR并阻斷EGFR信號(hào)傳導(dǎo)途徑的癌癥療法的多種策略已經(jīng)建立。小分子酪氨 酸激酶抑制劑例如吉非替尼和埃羅替尼阻斷胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)中EGFR的自磷酸化，由此抑 制下游信號(hào)傳導(dǎo)事件。面對抗EGFR酪氨酸激酶抑制劑的臨床使用的主要挑戰(zhàn)之一是癌癥對 這類療法的內(nèi)在和獲得性抗性。另一方面，某些治療性單克隆抗體(mAb)靶向EGFR的胞外部 分，其導(dǎo)致阻斷配體結(jié)合并從而抑制導(dǎo)致細(xì)胞增殖的抑制的下游事件。已經(jīng)批準(zhǔn)嵌合小鼠/ 人抗EGFR單克隆抗體C225(或西妥昔單抗)和帕尼單抗(完全人抗EGFR mAb)用于治療轉(zhuǎn)移 性結(jié)腸直腸癌和頭頸癌，所述抗體靶向EGFR的外部。然而，其腫瘤含有KRAS突變的患者經(jīng)常 無法從西妥昔單抗或帕尼單抗療法中獲益。KRAS突變通過持續(xù)發(fā)送生長信號(hào)（即使EGFR已 被阻斷)改變腫瘤細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)特性。
[0004] MET，酪氨酸激酶超家族的一個(gè)成員，是人肝細(xì)胞生長因子(HGH的人受體。HGF結(jié) 合至MET導(dǎo)致受體二聚化或多聚化、胞內(nèi)區(qū)中多個(gè)酪氨酸殘基的磷酸化、催化激活、和下游 信號(hào)傳導(dǎo)。MET還經(jīng)不依賴于配體的機(jī)制進(jìn)行激活，包括受體過表達(dá)、擴(kuò)增和突變。MET激活 增強(qiáng)細(xì)胞增殖、迀移、形態(tài)發(fā)生和存活，其與侵襲性細(xì)胞表型和差的臨床結(jié)果相關(guān)。因此， MET也是抗癌療法的革E標(biāo)。例如，onartuzumab，本領(lǐng)域中也稱為單臂（one-armed) 5D5、 0A5D5或MetMAb，已經(jīng)開發(fā)用于癌癥的潛在治療，并且是衍生自MET激動(dòng)性單克隆抗體的 人源化的、單價(jià)的、詰抗的抗MET抗體(參見，例如，Spigel, D.R.,等，Randomized Phase II Trial of Onartuzumab in Combination With Erlotinib in Patients With Advanced Non Small-Cell Lung Cancer, J. Clinical Oncology, 31(32):4105-4114 (November 2013)和Xiang H·，等，Onartuzumab (MetMAb):Using Nonclinical Pharmacokinetic and Concentration - Effect Data to Support Clinical Development, Clin Cancer Res·, (SOlSDeOnartuzumab結(jié)合MET并與MET保留在細(xì)胞表 面上，阻止HGF結(jié)合和隨后的MET磷酸化以及下游信號(hào)傳導(dǎo)活性和細(xì)胞應(yīng)答。
[0005] WO 2010/059654描述了多種MET抗體，包括高親和力拮抗性抗體，所述抗體結(jié)合 MET的α-鏈內(nèi)的表位并且在HGF存在或不存在的情況下并在通過獲得功能突變(其通常對已 知的MET拮抗劑是抗性的）表征的腫瘤中誘導(dǎo)MET內(nèi)化和/或降解。公開于WO 2010/059654中 的MET抗體之一 LY2875358，已被報(bào)道不具有對MET的激動(dòng)劑活性或另外具有對MET可忽略的 激動(dòng)劑活性（參見，例如，Zeng, W·，等，104rd AACR Annual Meeting,海報(bào)#5465 (2013 年)）。
[0006] 美國專利號(hào)7，723，484描述了人源化和親合力優(yōu)化的EGFR特異性抗體及其抗原結(jié) 合部分，其抑制EGFR的激活。更具體地，該專利尤其描述了全長單克隆抗體，其如通過在室 溫下進(jìn)行的Sapidyne KINEXA所測量的，以亞皮摩爾結(jié)合親合力(Kd)結(jié)合人表皮生長因子 受體(EGFR)。
[0007] MET和EGFR共表達(dá)于許多腫瘤中。阻斷一種受體趨于上調(diào)另一種，頻繁地且經(jīng)常迅 速導(dǎo)致對單一藥劑治療的抗性（Engelman, J.A.，等MET amplification leads to gef itinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science , 2007; 316:1039-43)。相反地，暴露于抑制MET藥劑延長時(shí)期的MET擴(kuò)增的肺癌細(xì)胞經(jīng)EGFR 途徑發(fā)展抗性（McDermott，U ·，等，Acquired resistance of non-small cell lung cancer cells to MET kinase inhibition is mediated by a switch to epidermal growth factor receptor dependency, Cancer Res., 2010; 70(4):1625-34)〇 [0008] MET抗體和EGFR抗體的共施用需要注射兩種單獨(dú)的產(chǎn)品或單一注射兩種不同抗體 的共制劑。兩種注射允許劑量的量和時(shí)機(jī)的靈活性，但對于患者而言在依從性和疼痛上是 不便的。共制劑也可以提供劑量的量的一些靈活性，但通常是非常具有挑戰(zhàn)性的或不可能 發(fā)現(xiàn)允許兩種抗體的化學(xué)和物理穩(wěn)定性的配制條件，這是由于兩種不同抗體的不同分子特 征。
[0009] WO 199509917公開了生產(chǎn)雙特異性、四價(jià)抗體的方法，其使用重組DNA技術(shù)，通過 產(chǎn)生融合至具有不同特異性的完整抗體的單鏈片段可變(scFv)抗體。這種基因融合體通過 轉(zhuǎn)染表達(dá)，產(chǎn)生具有雙特異性的四價(jià)抗體。然而，本領(lǐng)域中通常認(rèn)為當(dāng)遵循本領(lǐng)域中的教導(dǎo) 包括WO 199509917同時(shí)嘗試產(chǎn)生可用的雙特異性抗體時(shí)，技術(shù)人員通常會(huì)遇到與所產(chǎn)生的 雙特異性抗體的化學(xué)和物理穩(wěn)定性相關(guān)的問題。常常是，在所產(chǎn)生的雙特異性抗體中需要 氨基酸改變以充分克服這些問題。本領(lǐng)域中既未說明對氨基酸改變的需要，也未說明將克 服所產(chǎn)生問題的實(shí)際改變。此外，需要的改變最經(jīng)常地是非常規(guī)的或不是來源于公知常識(shí)。 同樣，通常發(fā)現(xiàn)，當(dāng)相比于其親代抗體時(shí)，從已知抗體產(chǎn)生的雙特異性抗體在至少一種重要 的功能性藥代動(dòng)力學(xué)或藥效動(dòng)力學(xué)特性中是不那么令人滿意的。
[0010] PCT國際公開WO 2010/1 15551公開了三價(jià)、雙特異性抗人EGFR和MET抗體 (BsABOl)，其中單鏈Fab片段即單臂5D5融合至西妥昔單抗的兩個(gè)重鏈之一的羧基末端。已 報(bào)道相比于由單特異性、單價(jià)親代MET抗體誘導(dǎo)的MET的內(nèi)化，BsABO 1降低MET的內(nèi)化。在 0VCAR-8增殖測定中，相比于用西妥昔單抗和onartuzumab的組合的2%抑制，BsABO 1導(dǎo)致8% 抑制。在HGF存在的情況下，相比于用西妥昔單抗和onartuzumab的組合的10%抑制，BsABOl 導(dǎo)致15%抑制。
[0011] 另外地，已經(jīng)公開了使用受控Fab臂交換(cFAE)，一種涉及在還原條件下混合兩種 親代抗體(在該情況下，具有對EGFR或MET的特異性）隨后再氧化的方法，生成靶向EGFR和 cMET的雙特異性抗體EMl-mAb (Moores, S·，等，EORTC Annual Meeting，海報(bào) #B241 (2013年））。尤其報(bào)道了 EMl-mAb相比于單價(jià)對照抗體的組合在至少一種體外ERK磷酸化測 定中展示出優(yōu)秀的活性。
[0012] 美國專利申請公開US 2014/0302029描述了生成靶向EGFR和CMET的雙特異性抗 體，其通過將基于西妥昔單抗序列的抗EGFR scFv與針對c-Met的小鼠抗體（即AbF46)的親 合力成熟且人源化的衍生物的IgG2 Fc的C末端融合而構(gòu)建。
[0013] 因此，需要這樣的多功能抗體作為某些癌癥的有效藥物介入，所述多功能抗體以 高親合力結(jié)合MET和EGFR，有效中和通過HGF的MET激活和通過EGF家族配體的EGFR激活，和/ 或提供相比于單一藥劑的組合在內(nèi)化和/或降解MET和EGFR(野生型和突變體兩者）中優(yōu)秀 的活性。具體而言，期望的是這樣的抗MET/EGFR抗體，其i )可以更有效地治療特征在于具有 一個(gè)或多個(gè)KRAS突變的癌癥，ii)相比于單一藥劑的相關(guān)組合，證明在預(yù)防或延遲對其他 MET和/或EGFR抑制劑的抗性的發(fā)展中的優(yōu)秀活性，所述其他MET和/或EGFR抑制劑包括但不 限于埃羅替尼、吉非替尼、拉帕替尼和維羅非尼，iii)引起最低的或不引起可測量的激動(dòng)劑 活性，和/或iv)證明體內(nèi)穩(wěn)定性、物理和化學(xué)穩(wěn)定性包括但不限于熱穩(wěn)定性、溶解性、低自 結(jié)合和對于開發(fā)和/或用于治療癌癥可接受的藥代動(dòng)力學(xué)特征。然而，盡管普遍按照WO 199509917中的教導(dǎo)，當(dāng)嘗試產(chǎn)生包含WO 2010/059654的某些抗MET抗體和美國專利號(hào)7， 723，484的某些抗EGFR抗體的四價(jià)、多功能抗MET/EGFR抗體時(shí)，本發(fā)明人遇到與化學(xué)和物理 穩(wěn)定性以及關(guān)于靶受體MET和EGFR之一或兩者的期望的結(jié)合特性的喪失相關(guān)的明顯的問 題。因此，需要涉及許多氨基酸改變的廣泛的工程化工作以足以克服這些問題。本領(lǐng)域中既 未暗示對實(shí)際改變的需求也未暗示實(shí)際改變。此外，若干改變不是常規(guī)的或不是來源于公 知常識(shí)。類似地，親本抗體本身不具有這些問題，表明關(guān)鍵區(qū)域周圍的局部環(huán)境與多功能抗 MET/EGFR抗體的環(huán)境并不同。
[0014]因此，本發(fā)明提供了結(jié)合EGFR和MET的四價(jià)多功能抗體。這些多功能抗體誘導(dǎo)EGFR 和MET在細(xì)胞表面上的共定位、MET的內(nèi)化和/或降解、和令人驚奇的是，相比于西妥昔單抗 在具有高M(jìn)ET表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中EGFR甚至更大的內(nèi)化和降解。此外，這些抗MET/EGFR多功能 抗體展示在具有低至中等MET表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中比親本抗MET抗體更高的結(jié)合MET的抗體親 抗原性。
[0015] 因此，本發(fā)明提供了結(jié)合EGFR和MET的四價(jià)多功能抗體。這些多功能抗體誘導(dǎo)EGFR 和MET在細(xì)胞表面上的共定位、MET的內(nèi)化和/或降解、和令人驚奇的是，相比于西妥昔單抗 在具有高M(jìn)ET表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中EGFR甚至更大的內(nèi)化和降解。此外，這些抗MEG/EGFR多功能 抗體展示在具有低至中等MET表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中比親本抗MET抗體更高的結(jié)合MET的抗體親 抗原性。此外，這些多功能抗MET/EGFR抗體相比于兩種單獨(dú)抗體的組合在抑制細(xì)胞培養(yǎng)物 中以及小鼠異種移植模型中的腫瘤細(xì)胞生長中展示出優(yōu)秀的活性。它們還似乎在恢復(fù)對各 種靶療法包括埃羅替尼和PLX4032(即，B-Raf抑制劑)在HGF和/或EGF存在的情況下的腫瘤 細(xì)胞敏感性中比單獨(dú)的MET和EGFR抗體的組合具有優(yōu)秀的活性。此類抗MET/EGFR抗體還可 以證實(shí)針對高EGFR表達(dá)的腫瘤、或?qū)τ谝环N或多種抗EGFR抗體(例如西妥昔單抗、帕尼單抗 等)和/或EGFR的一種或多種小分子抑制劑(例如埃羅替尼）具有抗性或已變得有抗性的腫 瘤(包括但不限于攜帶KRAS突變的腫瘤)是更有效的。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，這些多 功能抗體同時(shí)結(jié)合MET和EGFR，中和MET通過HGF的激活和EGFR通過EGF的激活，抑制許多類 型的表達(dá)MET和EGFR的癌細(xì)胞的配體依賴性和配體不依賴性的細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)EGFR和MET在 細(xì)胞表面上的共定位，誘導(dǎo)MET的內(nèi)化和/或降解，和令人驚奇地，相比于西妥昔單抗在具有 高M(jìn)ET表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中EGFR甚至更大的內(nèi)化和降解。
[0016] 本發(fā)明的實(shí)施方案是多功能抗體，其包含： (a)抗體，所述抗體結(jié)合MET并包含： i) 重鏈，所述重鏈包含分別由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列組成的重鏈互補(bǔ)性決定區(qū)域 (CDR)HCDRl、HCDR2和HCDR3;和 ii) 輕鏈，所述輕鏈包含分別由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列組成的輕鏈CDR LCDR1、LCDR2和 LCDR3;和 (b) scFv多肽，所述scFv多肽結(jié)合人EGFR并包含： i) HCVR結(jié)構(gòu)域，所述HCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: i)、vixiSggntdyntpfx2g (seq id no: 9)(其中Xi為Y或w且X2Skstmparaldyydydfay (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和SCFV-HCDR3;和 ii) LCVR結(jié)構(gòu)域，所述LCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、XiYAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)(其中Xi為R或Y，X2為K或S，且X3為E或R)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3,并且其中所述 s cFv多肽的C末端經(jīng)肽接頭融合至MET抗體重鏈的N末端。
[0017] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案是多功能抗體，其包含： (a) 抗體，所述抗體結(jié)合MET并包含： i) 第一重鏈和第二重鏈，其中每一重鏈包含分別由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、 RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列組成的 重鏈CDR HCDRUHCDR2和HCDR3;和 ii) 第一輕鏈和第二輕鏈，其中每一輕鏈包含分別由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列組成的輕鏈 CDR LCDRl、LCDR2和LCDR3;和 (b) 第一scFv多肽和第二scFv多肽，其中每一scFv多肽結(jié)合人EGFR并且其中每一scFv 多肽包含： i) HCVR結(jié)構(gòu)域，所述HCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: i)、vixiSggntdyntpfx2g (SEQ id no: 9)(其中Xi為Y或w且X2Skstmparaldyydydfay (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和SCFV-HCDR3;和 ii) LCVR結(jié)構(gòu)域，所述LCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、XiYAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)(其中Xi為R或Y，X2為K或S，且X3為E或R)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3,并且其中第一 scFv多肽的C末端經(jīng)肽接頭融合至第一重鏈的N末端并且第二scFv多肽的C末端經(jīng)肽接頭融 合至第二重鏈的N末端。
[0018] 本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案為多功能抗體，其包含兩個(gè)第一多肽和兩個(gè)第二多 肽，其中兩個(gè)第一多肽包含SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53的氨基酸序列；且兩個(gè)第二多肽包含 SEQ ID NO: 33的氨基酸序列，且其中所述多功能抗體結(jié)合EGFR和MET。
[0019] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案是藥物組合物，其包含任一前述的多功能抗體、或其MET和 EGFR結(jié)合片段、和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
[0020] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案是任一前述的多功能抗體、或其MET和EGFR結(jié)合片段，其用 于治療。
[0021] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案是任一前述的多功能抗體、或其MET和EGFR結(jié)合片段，其用 于治療癌癥。
[0022]本發(fā)明的另一實(shí)施方案是任一前述的多功能抗體、或其MET和EGFR結(jié)合片段，其用 于治療其中MET和EGFR兩者均由患者腫瘤表達(dá)的癌癥。
[0023]本發(fā)明的另一實(shí)施方案是任一前述的多功能抗體、或其MET和EGFR結(jié)合片段，其用 于治療其中MET和/或EGFR由患者腫瘤以低、中等、或高水平表達(dá)的癌癥和/或腫瘤或?qū)τ谝?種或多種抗EGFR抗體(例如西妥昔單抗、帕尼單抗等）和/或EGFR的一種或多種小分子抑制 劑(例如埃羅替尼)具有抗性或已變得有抗性的腫瘤(包括但不限于攜帶KRAS突變的腫瘤）。 在本發(fā)明的多種實(shí)施方案中，多功能抗體或其MET和EGFR結(jié)合片段用于治療其中MET和/或 EGFR由患者腫瘤以低、中等、或高水平表達(dá)的癌癥和/或?qū)τ谝环N或多種抗EGFR抗體(例如 西妥昔單抗、帕尼單抗等)和/或EGFR的一種或多種小分子抑制劑(例如埃羅替尼)具有抗性 或已變得有抗性的腫瘤(包括但不限于攜帶一個(gè)或多個(gè)KRAS突變的腫瘤）的用途可以進(jìn)一 步包括在向患者施用本發(fā)明的多功能抗體或其MET和EGFR結(jié)合片段的步驟前，鑒定需要癌 癥治療的患者的步驟。
[0024]本發(fā)明的另一實(shí)施方案是任一前述的多功能抗體或其MET和EGFR結(jié)合片段，其用 于治療NSCLC、SCLC、胃癌、結(jié)腸直腸癌、膽管癌、食道癌、黑素瘤包括但不限于葡萄膜黑素 瘤、腎癌、肝癌、膀胱癌、子宮頸癌、或頭頸癌。
[0025]本發(fā)明的另一實(shí)施方案是治療癌癥的方法，所述方法包括向有需要的人患者施用 有效量的任一前述多功能抗體、或其MET和EGFR結(jié)合片段。
[0026] 圖1說明顯示抗]\^1'/^6?1?多功能抗體順-￥1(和順-!19誘導(dǎo)癌細(xì)胞系!11993 (吧(^〇、 MKN45 (胃癌)和H441 (NSCLC)中EGFR和MET降解的western印跡結(jié)果。將癌細(xì)胞系用100 nM 抗體NH-YK、抗體NH-H9或?qū)φ湛贵w處理過夜。通過細(xì)胞裂解物的western印跡測定EGFR和 MET降解?？筂ET/EGFR多功能抗體NH-YK和NH-H9觸發(fā)了顯著的EGFR降解，然而西妥昔單抗或 親本抗MET抗體和西妥昔單抗的組合卻不會(huì)觸發(fā)。泳道I: higG4;泳道2 :抗MET Ab;泳道3 : 西妥昔單抗;泳道4抗MET Ab +西妥昔單抗;泳道5: NH-YK;泳道6: NH-H9。
[0027]圖2是顯示相比于施用媒介物對照或親本抗Met抗體和西妥昔單抗的組合(86.1% 的17^%)，施用抗腿1^6?1?多功能抗體順-￥1(導(dǎo)致在!11993小鼠異種移植模型中的腫瘤體積 的顯著更大降低(28.5%的T/C% ;p〈0.001)的圖。
[0028]圖3是顯示相比于施用媒介物對照或親本抗Met抗體和西妥昔單抗的組合，施用抗 MET/EGFR多功能抗體NH-YK導(dǎo)致在H441小鼠異種移植模型中的腫瘤體積的顯著更大降低 (28 · 5% 的 T/C% ;ρ〈0·001)的圖。
[0029]圖4是顯示相比于施用媒介物對照，施用抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK導(dǎo)致在EBC-1 NSCLC小鼠異種移植模型中的腫瘤體積的顯著更大降低(32.9%的T/C%; p〈0.001)的圖。
[0030] 圖5是顯示相比于施用親代MET抗體和西妥昔單抗的組合(分別T/C% = 17.4%，P 〈0.001和18.6%，P〈 0.001)或媒介物對照，施用抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK導(dǎo)致在 MKN45胃異種移植模型中相當(dāng)?shù)目鼓[瘤效力的圖。
[0031] 圖6是顯示以27 mg/kg施用抗MET/EGFR多功能抗體H9在攜帶H1993 NSCLC異種移 植物的免疫缺陷小鼠中導(dǎo)致比任何其他治療顯著更高的抗腫瘤效力的圖。利用媒介物對 照、抗MET/EGFR多功能抗體H9(4和27 mg/kg)、單獨(dú)抗MET(3和20 mg/kg)、西妥昔單抗（3 和20 mg/kg)或抗MET加西妥昔單抗的組合(3 mg/kg和20 mg/kg的每種抗體)每周一次處理 小鼠異種移植物，持續(xù)連續(xù)5周。
[0032] 圖7是顯示以27 mg/kg施用抗MET/EGFR多功能抗體H9在攜帶H441異種移植物的免 疫缺陷小鼠中導(dǎo)致比任何其他治療顯著更高的抗腫瘤效力的圖。利用媒介物對照、抗MET/ EGFR多功能抗體H9(4和27 mg/kg)、單獨(dú)抗MET(3和20 mg/kg)、西妥昔單抗（3和20 mg/ kg)或抗MET加西妥昔單抗的組合(3 mg/kg和20 mg/kg的每種抗體)每周一次處理小鼠異種 移植物，持續(xù)連續(xù)5周。
[0033] 術(shù)語"EGFR"、"ErbBΓ和"EGF受體"在本文中互換用于指EGFR蛋白（參見例如， UniProtKB/Swiss-Prot登錄P00533)。在本文中，"EGFR胞外結(jié)構(gòu)域"或"EGFR ECD"指細(xì)胞外 的EGFR結(jié)構(gòu)域，其錨定在細(xì)胞膜上，或處于循環(huán)中，包括其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，EGFR的 胞外結(jié)構(gòu)域可以包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域："結(jié)構(gòu)域Γ (從約1-158的氨基酸殘基）、"結(jié)構(gòu)域II"（氨基 酸殘基159-336)、"結(jié)構(gòu)域III"（氨基酸殘基337-470)，和"結(jié)構(gòu)域IV"（氨基酸殘基471-645)，其中邊界是大概的，并且可以有約1-3個(gè)氨基酸的變異。
[0034] 術(shù)語"MET多肽"、"MET受體"、"MET"、"HGF受體"或"HGFR"在本文中互換使用，并且 除非另有說明，旨在指人受體酪氨酸激酶，以及其功能活性的突變形式，其結(jié)合人肝細(xì)胞生 長因子。MET的具體實(shí)例包括，例如GenBank登錄號(hào)NM_000245中提供的核苷酸序列編碼的人 多肽，或GenBank登錄號(hào)NP_000236中提供的多肽序列編碼的人蛋白質(zhì)。將MET的結(jié)構(gòu)圖示性 地描述為：
SEMA: S ema結(jié)構(gòu)域 PSI: Plexin、信號(hào)素和整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域 IPT: 4個(gè)免疫球蛋白、Plexins和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域 TM: 跨膜區(qū) JM: 近膜結(jié)構(gòu)域 KD: 激酶結(jié)構(gòu)域。
[0035] 人MET的胞外結(jié)構(gòu)域(在本文中，MET-ECD)具有例如SEQ ID NO: 35中所示的氨基 酸序列。然而，SEQ ID NO: 35的氨基酸1-24包含信號(hào)序列。因此，除非另有說明，如本文所用 的術(shù)語"MET-ECD"表示分別以SEQ ID NO: 35的氨基酸25和932開始和結(jié)束的成熟蛋白 (即，SEQ ID NO: 36KSEMA結(jié)構(gòu)域由MET的N末端的大概500個(gè)氨基酸殘基組成，并且含有<1-鏈（SEQ ID NO: 35的氨基酸殘基25-307(8卩，SEQ ID NO: 37)和β-鏈的部分（SEQ ID NO: 35的氨基酸殘基308-519(即，SEQ ID NO: 38))。
[0036]如本文所用，對于MET或EGFR對腫瘤或細(xì)胞系的細(xì)胞表面表達(dá)，術(shù)語"低"、"中等" 和"高"分別旨在表示每個(gè)細(xì)胞少于約30萬，高于約30萬，和高于約100萬個(gè)受體。
[0037] 如本文所用，"多功能抗體"指這樣的分子，其包含具有一種抗原結(jié)合特異性的抗 體和具有不同抗原結(jié)合特異性的抗原結(jié)合片段。優(yōu)選地，多功能抗體指這樣的分子，其包含 i)對MET具有抗原結(jié)合特異性的抗體，和ii)對EGFR具有抗原結(jié)合特異性的單鏈可變片段 (ScFv)0
[0038] 除非另有說明，如本文所用，術(shù)語"抗體"旨在指包含通過二硫鍵互相連接的兩條 重鏈(HC)和兩條輕鏈(LC)的免疫球蛋白分子。每一條鏈的氨基末端部分包括經(jīng)其中包含的 CDR主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的約100-約110個(gè)氨基酸的可變區(qū)。每一條鏈的羧基末端部分確定主 要負(fù)責(zé)效應(yīng)子功能的恒定區(qū)。
[0039] 除非另有說明，對于本發(fā)明的多功能抗體，如本文所用，術(shù)語"NH-YK"旨在指包含 兩個(gè)第一多肽和兩個(gè)第二多肽的多功能抗體，其中兩個(gè)第一多肽包含SEQ ID NO: 27的氨 基酸序列;并且兩個(gè)第二多肽包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列，并且其中所述多功能抗體 結(jié)合EGFR和MET。
[0040] 除非另有說明，對于本發(fā)明的多功能抗體，如本文所用，術(shù)語"NH-H9"旨在指包含 兩個(gè)第一多肽和兩個(gè)第二多肽的多功能抗體，其中兩個(gè)第一多肽包含SEQ ID NO: 29的氨 基酸序列;并且兩個(gè)第二多肽包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列，并且其中所述多功能抗體 結(jié)合EGFR和MET。
[0041] 除非另有說明，對于本發(fā)明的多功能抗體，如本文所用，術(shù)語"H9"旨在指包含兩個(gè) 第一多肽和兩個(gè)第二多肽的多功能抗體，其中兩個(gè)第一多肽包含SEQ ID NO: 52的氨基酸 序列;并且兩個(gè)第二多肽包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列，并且其中所述多功能抗體結(jié)合 EGFR和MET。
[0042] 除非另有說明，對于本發(fā)明的多功能抗體，如本文所用，術(shù)語"YK"旨在指包含兩個(gè) 第一多肽和兩個(gè)第二多肽的多功能抗體，其中兩個(gè)第一多肽包含SEQ ID NO: 31的氨基酸 序列;并且兩個(gè)第二多肽包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列，并且其中所述多功能抗體結(jié)合 EGFR和MET。
[0043] 如本文所用的術(shù)語"抗原結(jié)合片段"旨在表示保留結(jié)合其抗原的能力的任何抗體 片段。此類"抗原結(jié)合片段"可以選自？￥、80?￥、？&13、？(313'）2、？313'、8〇?￥-?(3片段和雙體?？?體的抗原結(jié)合片段將通常包含至少一個(gè)可變區(qū)。優(yōu)選地，抗原結(jié)合片段包含重鏈可變區(qū) (HCVR)和輕鏈可變區(qū)（LCVR)。更優(yōu)選地，抗原結(jié)合片段包含HCVRs和LCVRs，其賦予針對MET 和EGFR的抗原結(jié)合特異性（即，"MET和EGFR結(jié)合片段"）。
[0044]如本文所用的術(shù)語"互補(bǔ)性決定區(qū)域"和"CDR"旨在意指抗體或其抗原結(jié)合片段的 HC和LC多肽兩者的可變區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的非連續(xù)抗原結(jié)合位點(diǎn)（combining sites)。這些特定區(qū) 域已被其他人所描述，包括Kabat,等，Ann.NYAcad.Sci.l90:382-93 (1971); Kabat等， J. Biol.Chem.252:6609_6616 (1977); Kabat,等，Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991); Chothia，等，J. Mol.Biol.196: 901-917 (1987); MacCallum，等，J. Mol.Biol·，262:732-745 (1996);和 North,等，了· Mol.Biol.，406，228-256 (2011)，其中定義包括當(dāng)彼此比較時(shí)氨基酸殘基的重疊或子 集。
[0045] CDR散布在更保守的名為框架區(qū)（"FR"）的區(qū)域中。每一LCVR和HCVR由三個(gè)CDR和四 個(gè)FR構(gòu)成，從氨基端向羧基端按以下順序排列:FR I、CDRI、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。將輕鏈 的3個(gè)CDR稱為 "LCDR1、LCDR2和LCDR3" 并將重鏈的3個(gè)CDR稱為 "HCDR1、HCDR2和HCDR3" <XDR 包含大部分與抗原形成特異性相互作用的殘基。LCVR和HCVR區(qū)域內(nèi)CDR氨基酸殘基的編號(hào) 和位置與已知的慣例一致(例如Kabat (1991) Chothia (1987)、和/或North (2011))。在 本發(fā)明的不同實(shí)施方案中，抗體和/或抗原結(jié)合片段(例如scFv)的FR可以與人種系序列一 致，或者可以是天然或人工修飾的。
[0046] "單鏈片段可變（single chain fragment variable)"或"scFv"或"scFv多肽"指 包含經(jīng)接頭分子連接的抗體的LCVR結(jié)構(gòu)域和HCVR結(jié)構(gòu)域的單折疊的多肽。在此類scFv多肽 中，HCVR結(jié)構(gòu)域和LCVR結(jié)構(gòu)域可以以HCVR -接頭-LCVR或LCVR -接頭-HCVR次序。接 頭可以是柔性肽接頭，其使得HCVR結(jié)構(gòu)域和LCVR結(jié)構(gòu)域能夠折疊作為功能性單體單元用于 識(shí)別抗原。s cFv的LCVR結(jié)構(gòu)域的三個(gè)CDR本文稱為"s cFv-LCDR I、s cFv-LCDR2和s cFv-LCDR3" 且scFv的HCVR結(jié)構(gòu)域的三個(gè)CDR本文稱為 "scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3"。
[0047] 如本文所用，術(shù)語"表面等離子共振(SPR)"指通過檢測生物傳感器基質(zhì)內(nèi)的蛋白 質(zhì)濃度改變來允許分析實(shí)時(shí)相互作用的光學(xué)現(xiàn)象，例如使用BIAcore TM系統(tǒng)(Biacore Life Sciences Division, GE Healthcare, Piscataway, NJ)〇
[0048] 如本文所用，術(shù)語"KD"旨在指具體抗體-抗原或抗體片段-抗原相互作用的平衡解 離常數(shù)。
[0049] 術(shù)語"特異性結(jié)合"等等表示抗體或其抗原結(jié)合片段與抗原形成在生理?xiàng)l件下相 對穩(wěn)定的復(fù)合物。用于確定抗體是否特異性結(jié)合抗原的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包 括例如平衡透析、SPR等等。例如，如本發(fā)明上下文中所用的"特異性結(jié)合" MET或EGFR的抗體 包括如SPR測定中測量的以以下Kd結(jié)合MET-ECD (或其部分)和/或EGFR-E⑶(或其部分）的 抗體:小于約10 mM、小于約5 nM、小于約4 nM、小于約3 nM、小于約2 nM、小于約I nM、小于 約0.5 nM、小于約0.3 nM、小于約0.2 nM、或小于約0.1 nM。（參見，例如實(shí)施例1，本文）。優(yōu) 選的，本發(fā)明的多功能抗體如SPR測定中測量的以以下Kd特異性結(jié)合MET-ECD (或其部分） 和EGFR-ECD(或其部分）：約10 nM至約0.1 nM、約5 nM至約0.1 nM、約2 nM至約0.1 nM、約1 nM至約0.1 nM、約0.75 nM至約0.1 nM、約0.5 nM至約0.1 nM。
[0050] 術(shù)語"表位"指與抗體分子可變區(qū)內(nèi)的特定抗原結(jié)合位點(diǎn)（已知為互補(bǔ)位)相互作 用的抗原決定簇。單一抗原可以具有多于一個(gè)表位。因此，不同抗體可以結(jié)合抗原上的不同 區(qū)域并且可以具有不同的生物效應(yīng)。表位可以是構(gòu)象的或線性的。構(gòu)象表位由線性多肽鏈 不同區(qū)段的空間上并列的氨基酸來產(chǎn)生。線性表位是由多肽鏈中相鄰的氨基酸殘基產(chǎn)生的 表位。在某些情況下，表位可以包括抗原上的糖、磷?；蚧酋；糠?。
[0051] 如本發(fā)明內(nèi)所用的術(shù)語"接頭分子"或"接頭"優(yōu)選表示肽接頭。使用本發(fā)明某些實(shí) 施方案中利用的肽接頭以將抗體、抗原結(jié)合位點(diǎn)，和/或包含不同抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段 (例如scFv、全長抗體、Vh結(jié)構(gòu)域和/或Vii吉構(gòu)域)連接在一起以形成本發(fā)明的多功能抗體。優(yōu) 選地，肽接頭是富含甘氨酸的肽，其具有至少5個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少10個(gè)氨基酸，更優(yōu)選10-50個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述富含甘氨酸的肽接頭是(G xS)n,其中G=甘氨 酸，S=絲氨酸，（x=3并且n=3、4、5或6)或(x=4并且n=2、3、4或5)。例如，在本發(fā)明的一些實(shí)施 方案中，所述富含甘氨酸的肽接頭是(G xS)n，其中G=甘氨酸，S=絲氨酸，x=4并且n=2、3、4或5 (即分別是GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 47)、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 48)、 ggggsggggsggggsggggs(seqidno:49)Sggggsggggsggggsggggsggggs(seqidno: 50 ))。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可以將額外的甘氨酸或蘇氨酸，例如GSTG、TG、GG或 GGGT添加到(GxS)n格式化的富含甘氨酸的肽接頭的任一末端。例如，在本發(fā)明的一些實(shí)施方 案中，所述富含甘氨酸的肽接頭是GGGSGGGGSGGGGSGSTG (SEQ ID NO: 51)。
[0052] 術(shù)語"C末端"及其語法變體，包括但不限于羧基（carboxyl)末端、羧基（carboxy) 末端、C末端(C-terminal)、C末端(C-terminal end)或C00H末端在本文中用于表示氨基酸 鏈(蛋白質(zhì)或多肽)的末端，其可以以游離的羧基(-C00H)終止。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)從信使RNA翻譯時(shí)， 其從N-末端至C-末端產(chǎn)生。用于表示肽序列的慣例是在右邊描述C末端并從N至C末端列出 序列。
[0053]術(shù)語"N末端"及其語法變體，包括但不限于氨基末端、NH2末端、N末端或胺末端在 本文中用于表示氨基酸鏈(蛋白質(zhì)或多肽）的開始，以具有游離胺基(-NH2)的氨基酸終止。 用于表示肽序列的慣例是將N末端放在左邊并從N至C末端列出序列。
[0054]短語"人改造的抗體"或"人源化抗體"指本文公開的抗體化合物和這樣的抗體及 其抗原結(jié)合片段，所述抗體及其抗原結(jié)合片段具有與本文公開的抗體化合物類似的結(jié)合和 功能性質(zhì)，并且其具有來源于非人抗體的實(shí)質(zhì)上人或完全人環(huán)繞（surrounding) CDR的構(gòu) 架區(qū)。"構(gòu)架區(qū)"或"構(gòu)架序列"指構(gòu)架區(qū)1-4的任何一個(gè)。本發(fā)明包括的人改造抗體和抗原結(jié) 合片段包括這樣的化合物，其中構(gòu)架區(qū)1-4中的任何一個(gè)或更多個(gè)是實(shí)質(zhì)上人的或完全人 的，即其中存在單個(gè)實(shí)質(zhì)上或完全人構(gòu)架區(qū)1-4的任何可能組合。例如，這包括抗原結(jié)合化 合物，其中構(gòu)架區(qū)1和構(gòu)架區(qū)2、構(gòu)架區(qū)1和構(gòu)架區(qū)3、構(gòu)架區(qū)1、2和3等是實(shí)質(zhì)上人的或完全人 的。實(shí)質(zhì)上人構(gòu)架是與已知的人種系構(gòu)架序列具有至少約80%序列同一性的那些。優(yōu)選地， 實(shí)質(zhì)上人構(gòu)架與已知人種系構(gòu)架序列具有至少約85%、約90%或約95%的序列同一性。
[0055] 完全人構(gòu)架是與已知人種系構(gòu)架序列相同的那些。人構(gòu)架種系序列為本領(lǐng)域所知 并且可以從多種來源，包括IMGT ?，國際ImMunoGeneTics信息系統(tǒng)（參見例如，Marie-Paule Lefranc,等，Nucleic Acid Research，第37卷，數(shù)據(jù)庫期號(hào)，D1006-D1012)，或 The Immunoglobulin Facts Book 由Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc, Academic Press, 2001，ISBN 012441351 獲得。例如，種系輕鏈構(gòu)架可以選自：A11、A17、 △ 18^19^20^27^30、1^、1^11、1^12、1^2、1^5、1^15、1^6、1^8、012、02和08;并且種系重鏈構(gòu)架區(qū) 可選自：VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-20、VH3-72、VHI-46、VH3-9、VH3-66、VH3-74、VH4-31、 VHI-18、VHI-69、VI-13-7、VH3-ll、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-48、VH4-39、VH4-59 和VH5-5I。
[0056] 可以使用若干不同方法產(chǎn)生展示與本文公開的抗體化合物類似功能性質(zhì)的人改 造抗體。本文公開的具體抗體化合物可以用作模板或親本抗體化合物以制備額外的抗體化 合物。在一種方法中，將親本抗體化合物CDR移植到與親本抗體化合物構(gòu)架具有高度序列同 一性的人構(gòu)架中。新構(gòu)架的序列同一性一般會(huì)與親本抗體化合物中的相應(yīng)構(gòu)架的序列具有 至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%，或至少約99%的同一性。該移植可以導(dǎo)致與 親本抗體相比結(jié)合親合力的降低。如果這是事實(shí)，那么可以基于Queen等（1991) Proc . Natl. Acad. Sci. USA 88: 2869公開的具體標(biāo)準(zhǔn)在某些位置將構(gòu)架回復(fù)突變成親本構(gòu)架。 描述用于人源化小鼠抗體的方法的額外參考文獻(xiàn)包括美國專利號(hào)4，816，397; 5，225，539和 5,693,761;Levitt, J. Mol. Biol. 168:595-620 (1983)中描述的計(jì)算機(jī)程序ABMOD和 ENCAD;Winter及同事的方法（Jones等 Nature 321:522-525 (1986);Riechmann等 Nature, 332:323-327 (1988);and,等 Science 239:1534-1536 (1988)〇
[0057] 應(yīng)用本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用常規(guī)技術(shù)，例如定點(diǎn)誘變來取代本 發(fā)明公開的CDR和構(gòu)架序列內(nèi)的氨基酸并由此產(chǎn)生來源于本發(fā)明序列的其他可變區(qū)氨基酸 序列?？梢栽诰唧w取代位點(diǎn)上引入高達(dá)所有19個(gè)可變的天然存在的氨基酸。然后可以使用 本文公開的方法來篩選這些額外的可變區(qū)氨基酸序列以鑒定具有所示體內(nèi)功能的序列。這 樣，可以鑒定根據(jù)本發(fā)明適合于制備人改造抗體及其抗原結(jié)合部分的其他序列。優(yōu)選地，構(gòu) 架內(nèi)的氨基酸取代限制在本文公開的三個(gè)輕鏈和/或重鏈構(gòu)架區(qū)任何一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)的一 個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)位置中。優(yōu)選地，CDR內(nèi)的氨基酸取代限制在三個(gè)輕鏈和/或重鏈CDR任何一 個(gè)或更多個(gè)內(nèi)的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)位置中。本文中也涵蓋上述這些構(gòu)架區(qū)和CDR內(nèi)的多種改 變的組合。
[0058] 下文表1和2描述了本文公開的優(yōu)選人改造抗體的CDR的氨基酸序列和共有氨基酸 序列，以及本文公開的優(yōu)選人改造抗體或其抗原結(jié)合片段的HCVR和LCVR多肽的氨基酸序列 的SEQ ID N0。
[0059] 表 1
在上文表2中，乂:是!?或Y，X2是K或S，并且X3是E或R。
[0061]本發(fā)明的實(shí)施方案是多功能抗體，其包含： (a) 抗體，其結(jié)合MET的α鏈內(nèi)選自以下的氨基酸序列上的表位： i) YVDTYYOLKii CSEQ ID Ν?； 39), Η) iSCXlSVN'RCIirORHVFPI'INIiTADIQS (SEQ10 KO: 40), Hi) Λ !,GA KVLSSVKORr IKF (SEQ S D NO: 41), tv) VRRlXBTKfXiFM (SE〇 iD NO: 42); |1! (b) scFv多肽，其結(jié)合EGFR并包含： i) HCVR結(jié)構(gòu)域，所述HCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: I)、vixiSggntdyntpfx2g (seq id no: 9)(其中Xi為Y或w且X2Skstmparaldyydydfay (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和 ii) LCVR結(jié)構(gòu)域，所述LCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、XiYAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)(其中Xi為R或Y，X2為K或S，且X3為E或R)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3,其中多功能抗體 誘導(dǎo)細(xì)胞表面MET和EGFR的內(nèi)化和/或降解。
[0062]在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，多功能抗體結(jié)合MET的α鏈內(nèi)氨基酸序列i) VVDTYYDDQL (SEQ ID NO: 39)、ii) ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS (SEQ ID NO: 40)、 iii) ALGAKVLSSVKDRFINF (SEQ ID NO: 41)和/或iv) VRRLKETKDGFM (SEQ ID NO: 42)上 的表位。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，多功能抗體可以結(jié)合MET的α鏈內(nèi)選自以下的氨基酸 序列上的表位： \i DTYVDD (StQ m NO; 43), ?Π .HVFPHNifFADiQS UTNO： 44), 遍她 F :_EC|:r:D:翁 ?ν) Κ?ΤΠα..Κ:?『..Μ Π) NO: 46)。
[0063] 在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，多功能抗體可以結(jié)合特征在于包括氨基酸序列 DTYYDD (SEQ ID NO: 43)、HVFPHNHTADIQS (SEQ ID NO: 44)、FINF (SEQ ID NO: 45)和 KETKDGFM (SEQ ID NO: 46)的構(gòu)象表位。此外，在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，多功能抗體分 別誘導(dǎo)不依賴HGF和不依賴EGF的細(xì)胞表面MET和EGFR的內(nèi)化和/或降解。在本發(fā)明的其他實(shí) 施方案中，結(jié)合EGFR的scFv多肽包含： i) HCVR結(jié)構(gòu)域，所述HCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3，和ii) LCVR結(jié)構(gòu)域，所述LCVR結(jié)構(gòu)域包含分別 由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)和 QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。在本發(fā)明的其他 實(shí)施方案中，結(jié)合EGFR的scFv多肽包含:i )HCVR結(jié)構(gòu)域，所述HCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸 序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和ii) LCVR結(jié)構(gòu) 域，所述LCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)和 QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和 scFv-IXDR3，并且其中scFv多肽的C末端經(jīng)肽接頭融合至MET抗體重鏈的N末端。
[0064] 本發(fā)明的實(shí)施方案是多功能抗體，其包含： (a)抗體，所述抗體結(jié)合MET并包含： i) 重鏈，所述重鏈包含分別由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列組成的重鏈CDR HCDRl、 HCDR2 和 HCDR3;和 ii) 輕鏈，所述輕鏈包含分別由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列組成的輕鏈CDR LCDR1、LCDR2和 LCDR3;和 (b) scFv多肽，所述scFv多肽結(jié)合EGFR并包含： i) HCVR結(jié)構(gòu)域，所述HCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: i)、vixiSggntdyntpfx2g (seq id no: 9)(其中Xi為Y或w且X2Skstmparaldyydydfay (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和SCFV-HCDR3;和 ii) LCVR結(jié)構(gòu)域，所述LCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、XiYAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)(其中Xi為R或Y，X2為K或S，且X3為E或R)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。
[0065] 在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，結(jié)合EGFR的scFv多肽包含： i) HCVR結(jié)構(gòu)域，所述HCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和 ii) LCVR結(jié)構(gòu)域，所述LCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。
[0066] 在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，結(jié)合EGFR的scFv多肽包含HCVR結(jié)構(gòu)域(其包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列）和LCVR結(jié)構(gòu)域(其包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列）。在本發(fā)明 的其他實(shí)施方案中，結(jié)合EGFR的scFv多肽包含： i) HCVR結(jié)構(gòu)域，所述HCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和 ii) LCVR結(jié)構(gòu)域，所述LCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)和 QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3，并且其中scFv多肽的C末端經(jīng)肽接頭融合至MET抗體重鏈 的N末端。
[0067] 在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，多功能抗體包含： i) 包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重鏈;和 ii) 包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的輕鏈。
[0068] 本發(fā)明的實(shí)施方案是多功能抗體，其包含： (a) 抗體，所述抗體結(jié)合MET并包含： i) 重鏈，所述重鏈包含分別由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列組成的重鏈CDR HCDRl、 HCDR2 和 HCDR3;和 ii) 輕鏈，所述輕鏈包含分別由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列組成的輕鏈CDR LCDR1、LCDR2和 LCDR3;和 (b) scFv多肽，其結(jié)合EGFR并包含： i) HCVR結(jié)構(gòu)域，所述HCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: I)、vixiSggntdyntpfx2g (seq id no: 9)(其中Xi為Y或w且X2Skstmparaldyydydfay (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和 ii) LCVR結(jié)構(gòu)域，所述LCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、XiYAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)(其中Xi為R或Y，X2為K或S，且X3為E或R)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。
[0069] 在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，結(jié)合EGFR的scFv多肽包含： i) HCVR結(jié)構(gòu)域，所述HCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIWSGGNTDYNTPFTG (SEQ ID NO: 7)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和 ii) LCVR結(jié)構(gòu)域，所述LCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、YYASRSIS (SEQ ID NO: 8)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的8。卩￥〇01?8。卩￥-LCDRl、scFv-LCDR2、scFv-LCDR3 〇
[0070] 在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，結(jié)合EGFR的scFv多肽包含： i) HCVR結(jié)構(gòu)域，所述HCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIWSGGNTDYNTPFTG (SEQ ID NO: 7)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和 ii) LCVR結(jié)構(gòu)域，所述LCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、YYASRSIS (SEQ ID NO: 8)和 QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的8。卩丫0)1?8。卩￥-LCDRl、scFv-LCDR2、scFv-LCDR3，并且其中scFv多肽的C末端經(jīng)肽接頭融合至MET抗體重鏈 的N末端。
[0071] 在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，多功能抗體包含： i) 包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重鏈;和 ii) 包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的輕鏈。
[0072] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案是多功能抗體，其包含： (a) 抗體，所述抗體結(jié)合MET并包含： i) 第一重鏈和第二重鏈，其中每一重鏈包含分別由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、 RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列組成的 重鏈CDR HCDRUHCDR2和HCDR3;和 ii) 第一輕鏈和第二輕鏈，其中每一輕鏈包含分別由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列組成的輕鏈 CDR LCDRl、LCDR2和LCDR3;和 (b) 第一scFv多肽和第二scFv多肽，其中每一scFv多肽結(jié)合人EGFR并且其中每一scFv 多肽包含： i) HCVR結(jié)構(gòu)域，所述HCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: i)、vixiSggntdyntpfx2g (SEQ id no: 9)(其中Xi為Y或w且X2Skstmparaldyydydfay (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和SCFV-HCDR3;和 ii) LCVR結(jié)構(gòu)域，所述LCVR結(jié)構(gòu)域包含由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)， X1YAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)(其中Xi為R或Y，X2為K或S，且X3為E或R)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3,并且其中第一scFv多 肽的C末端經(jīng)肽接頭融合至第一重鏈的N末端并且第二SCFv多肽的C末端經(jīng)肽接頭融合至第 二重鏈的N末端。
[0073] 在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，多功能抗體結(jié)合MET的α鏈內(nèi)選自以下的氨基酸序列 上的表位： ?) V VOITVDDQ], (S^Q ?Ο NO： 39? si) iSCOSV'NROTCQRi'iVFFHN'H'I'ADlQS (SEQ ID NO： 40), ?〇 AtGAKVLSsSVKBRFINf (SEQ ID M)： 41), ：|SI ?ν) VRRLICBTICrXiFy (SEQ ID NO: 42) 0
[0074] 在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，多功能抗體可以結(jié)合MET的α鏈內(nèi)氨基酸序列i) VVDTYYDDQL (SEQ ID NO: 39)、ii) ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS (SEQ ID NO: 40)、 iii) ALGAKVLSSVKDRFINF (SEQ ID NO: 41)和/或iv) VRRLKETKDGFM (SEQ ID NO: 42)上 的表位。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，多功能抗體可以結(jié)合特征在于包括氨基酸序列 DTYYDD (SEQ ID NO: 43)、HVFPHNHTADIQS (SEQ ID NO: 44)、FINF (SEQ ID NO: 45)和 KETKDGFM (SEQ ID NO: 46)的構(gòu)象表位。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，多功能抗體包含： i) 第一重鏈和第二重鏈，其中兩條重鏈均包含SEQ ID NO: 53的氨基酸序列;和 ii) 第一輕鏈和第二輕鏈，其中兩條輕鏈均包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列。
[0075]此外，在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，多功能抗體分別誘導(dǎo)不依賴HGF和不依賴EGF 的細(xì)胞表面MET和EGFR的內(nèi)化和/或降解。
[0076]本發(fā)明的另一實(shí)施方案是多功能抗體，其包含： (a) 抗體，所述抗體結(jié)合MET并包含： i) 第一重鏈和第二重鏈，其中每一重鏈包含分別由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、 RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列組成的 重鏈CDR HCDRUHCDR2和HCDR3;和 ii) 第一輕鏈和第二輕鏈，其中每一輕鏈包含分別由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列組成的輕鏈 CDR LCDRl、LCDR2和LCDR3;和 (b) 第一scFv多肽和第二scFv多肽，其中每一scFv多肽結(jié)合人EGFR并且其中每一scFv 多肽包含： i) HCVR結(jié)構(gòu)域，所述HCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: i)、vixiSggntdyntpfx2g (seq id no: 9)(其中Xi為Y或w且X2Skstmparaldyydydfay (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和SCFV-HCDR3;和 ii) LCVR結(jié)構(gòu)域，所述LCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)，X1YAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)(其中Xi為R或Y，X2為K或S，且X3為E或R)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3,并且其中第一 scFv多肽的C末端經(jīng)肽接頭融合至第一重鏈的N末端并且第二scFv多肽的C末端經(jīng)肽接頭融 合至第二重鏈的N末端。
[0077]在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，結(jié)合EGFR的每一第一和第二scFv多肽包含：i) HCVR 結(jié)構(gòu)域，所述HCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH ( SEQ ID NO: 1)、 VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和i i )LCVR結(jié)構(gòu)域，所述LCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨 基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)和 QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3?；蛘?，結(jié)合EGFR的每一 第一和第二scFv多肽包含：i)HCVR結(jié)構(gòu)域，所述HCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列 GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIWSGGNTDYNTPFTG(SEQ ID NO: 7)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和ii)LCVR結(jié)構(gòu)域，所 述LCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、YYASRSIS (SEQ ID NO: 8)和 QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3〇
[0078]本發(fā)明的另一實(shí)施方案是多功能抗體，其包含： (a) 抗體，所述抗體結(jié)合MET并包含： i) 第一重鏈和第二重鏈，其中兩條重鏈均包含SEQ ID NO: 53的氨基酸序列;和 ii) 第一輕鏈和第二輕鏈，其中兩條輕鏈均包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列;和 (b) 第一scFv多肽和第二scFv多肽，其中兩條scFv多肽均結(jié)合EGFR并且兩條scFv多肽 均包含： i) HCVR結(jié)構(gòu)域，所述HCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: i)、vixiSggntdyntpfx2g (seq id no: 9)(其中Xi為Y或w且X2Skstmparaldyydydfay (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和SCFV-HCDR3;和 ii) LCVR結(jié)構(gòu)域，所述LCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)，X1YAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)(其中Xi為R或Y，X2為K或S，且X3為E或R)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3,并且其中第一 scFv多肽的C末端經(jīng)肽接頭融合至第一重鏈的N末端并且第二scFv多肽的C末端經(jīng)肽接頭融 合至第二重鏈的N末端。
[0079]在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，第一和第二scFv多肽包含：i) HCVR結(jié)構(gòu)域，所述 HCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VRSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和 scFv-HCDR3 ;和i i ) LCVR結(jié)構(gòu)域，所述LCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)和 QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。或者，兩個(gè)scFv多肽包含：i)HCVR結(jié)構(gòu)域，所述 HCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIWSGGNTDYNTPFTG(SEQ ID NO: 7)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和 scFv-HCDR3;和ii)LCVR結(jié)構(gòu)域，所述LCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、YYASRSIS (SEQ ID NO: 8)和 QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。
[0080]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供多功能四價(jià)抗體，其包含： (a)抗體，其包含兩條重鏈和兩條輕鏈并能夠結(jié)合MET的α鏈內(nèi)選自以下的氨基酸序列 上的表位： j) VVDITYDDQl. (SbQ iO NO' 3? ii) iSCGSVN RG'rCQRiiVFPHNIfi AOIQS (SBQ JD NO： 40), i?) ALOAKVLSSViCDRFiNF (SEQIO NO; 41). rv) VRRLXBTKOCirM ?SEQ JD NO:42j; .{u (b)兩個(gè)scFv多肽，其能夠結(jié)合EGFR，其包含SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19的重鏈 可變區(qū)和SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 20的輕鏈可變區(qū)，其中所述多功能抗體誘導(dǎo)細(xì)胞表 面MET和EGFR的內(nèi)化和/或降解。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，多功能抗體可以結(jié)合MET的α 鏈內(nèi)氨基酸序列i) VVDTYYDDQL (SEQ ID NO: 39)、ii) ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS (SEQ ID NO: 40)、iii) ALGAKVLSSVKDRFINF (SEQ ID NO: 41)和/或iv) VRRLKETKDGFM (SEQ ID NO: 42)上的表位。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，多功能抗體可以結(jié)合特征在于包 括氨基酸序列DTYYDD (SEQ ID NO: 43)、HVFPHNHTADIQS (SEQ ID NO: 44)、FINF (SEQ ID NO: 45)和KETKDGFM (SEQ ID NO: 46)的構(gòu)象表位。此外，在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，多 功能抗體分別誘導(dǎo)不依賴HGF和不依賴EGF的細(xì)胞表面MET和EGFR的內(nèi)化和/或降解。
[0081] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供多功能四價(jià)抗體，其包含：（a)各自能夠結(jié)合 EGFR的兩個(gè)相同的scFv多肽;和(b)抗體或其抗原結(jié)合片段，其特異地結(jié)合由如SEQ ID NO: 36中的氨基酸序列組成的MET-ECD，抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含： 分別由氨基酸序列SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和 QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)組成的輕鏈CDR LCDRULCDR2和LCDR3,和 分別由氨基酸序列GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)組成的重鏈CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3。
[0082] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供多功能四價(jià)抗體，其包含：（a)各自能夠結(jié)合 EGFR的兩個(gè)相同的scFv多肽;和(b)MET抗體，其包含兩條重鏈和兩條輕鏈并能夠結(jié)合MET， 其中能夠結(jié)合EGFR的兩個(gè)相同的scFv多肽通過肽接頭在所述全長抗體的各重鏈的C末端經(jīng) 過C末端融合MET抗體。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，SEQ ID NO: 21的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO: 22的輕鏈可變區(qū)（其均來源于在WO 2010/059654中詳細(xì)描述的抗MET克隆C8-H241)可 以用于形成特異地結(jié)合MET的MET抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
[0083] 通過基因合成和重組分子生物學(xué)技術(shù)，SEQ ID NO: 17的HCVR和SEQ ID NO: 18的 LCVR，或SEQ ID NO: 19的HCVR和SEQ ID NO: 20的LCVR通過公式(GxS)n，x =4，n=5的富含甘 氨酸的接頭連接以形成特異地結(jié)合EGFR的scFv。結(jié)合EGFR的scFv然后通過另一富含甘氨 酸的接頭附著到抗MET抗體C8-H241 (人IgG4亞型）的重鏈的N或C末端，產(chǎn)生多功能抗體 NH-YK(包含抗EGFR YKn-scFv和抗Met HC融合物（即，SEQ ID NO: 27))、NH-H9 (包含抗 EGFR H9n-scFv和抗Met HC 融合物（即，SEQ ID NO: 29))、YK (包含抗Met HC和抗EGFR YK-scFv融合物（即，SEQ ID NO: 31))和H9 (包含抗Met HC和抗EGFR H9-scFv融合物（即， SEQ ID NO: 52))〇
[0084]本發(fā)明的另一實(shí)施方案是結(jié)合MET和EGFR的多功能抗體，其包含：（a)兩條第一多 肽，其中所述兩條第一多肽均包含SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 52或 SEQ ID NO: 53的氨基酸序列；和（b)兩條第二 多肽，其中所述兩條第二多肽包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列。
[0085] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案是包含結(jié)合MET和EGFR的多功能抗體和藥學(xué)上可接受的載 體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物，所述多功能抗體包含：（a)兩條第一多肽，其中所述兩條 第一多肽均包含SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53的氨基酸序列；和(b)兩條第二多肽，其中所述兩 條第二多肽包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列。
[0086] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案是治療癌癥的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有 效量的結(jié)合MET和EGFR的多功能抗體，其包含：（a)兩條第一多肽，其中所述兩條第一多肽均 包含SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53的氨基酸序列；和(b)兩條第二多肽，其中所述兩條第二多肽 包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，癌癥是NSCLC、SCLC、胃癌、 結(jié)腸直腸癌、膽管癌、食道癌、黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、腎癌、肝癌、膀胱癌、子宮頸癌、或頭頸 癌。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述癌癥患者是人。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，患者腫 瘤的特征在于包含具有一個(gè)或多個(gè)KRAS突變的細(xì)胞。本發(fā)明的其他實(shí)施方案提供治療癌癥 (其中MET和/或EGFR由患者腫瘤以低、中等、或高水平表達(dá))和/或腫瘤或?qū)τ谝环N或多種抗 EGFR抗體(例如西妥昔單抗、帕尼單抗等)和/或EGFR的一種或多種小分子抑制劑(例如埃羅 替尼)具有抗性或已變得有抗性的腫瘤(包括但不限于攜帶KRAS突變的腫瘤）的方法，所述 方法包括向需要其的患者施用藥學(xué)上有效量的一種前述的多功能抗體、或其MET和EGFR結(jié) 合片段。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，治療癌癥的方法可以進(jìn)一步包括在向患者施用多功 能抗體或其MET和EGFR結(jié)合片段的步驟前，通過測量患者腫瘤表達(dá)的MET和EGFR的水平和/ 或評估患者的腫瘤是否包含具有一個(gè)或多個(gè)KRAS突變的細(xì)胞來鑒定需要癌癥治療的患者 的步驟，在所述癌癥中MET和/或EGFR由患者腫瘤以低、中等、或高水平表達(dá)和/或其中腫瘤 對于一種或多種抗EGFR抗體(例如西妥昔單抗、帕尼單抗等）和/或EGFR的一種或多種小分 子抑制劑(例如埃羅替尼)具有抗性或已變得有抗性，包括但不限于攜帶KRAS突變的腫瘤。
[0087] 下文表3描述了本發(fā)明的scFv和scFv融合物的氨基酸序列的SEQ ID N0。
當(dāng)在本文中用于參考scFv并包括上文表3時(shí)，下標(biāo)"η"表示抗EGFR YK scFv或抗EGFR H9 scFv融合MET抗體重鏈的N末端。
[0089] 本發(fā)明的其他實(shí)施方案是包含兩條相同的第一多肽和兩條相同的第二多肽的多 功能抗體，其中第一多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO: 27或SEQ ID NO: 29并且第二多肽的 氨基酸序列是SEQ ID NO: 33,其中所述多功能抗體結(jié)合EGFR和MET。此外，在本發(fā)明的多個(gè) 實(shí)施方案中，多功能抗體分別誘導(dǎo)不依賴HGF和不依賴EGF的細(xì)胞表面MET和EGFR的內(nèi)化和/ 或降解。
[0090] 標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)用于制備重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、選擇轉(zhuǎn)化體、產(chǎn)生 本發(fā)明多功能抗體的分離的宿主細(xì)胞系、培養(yǎng)這些宿主細(xì)胞并從培養(yǎng)基中回收抗體。
[0091] 本發(fā)明也涉及表達(dá)本發(fā)明的多功能抗體的宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域已知的多種宿主表達(dá) 系統(tǒng)可以用于表達(dá)本發(fā)明的抗體，其包括原核(細(xì)菌)和真核表達(dá)系統(tǒng)（如酵母、桿狀病毒、 植物、哺乳動(dòng)物和其他動(dòng)物細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，和雜交瘤細(xì)胞）。
[0092]可以通過在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)免疫球蛋白制備本發(fā)明的多功能抗體。為了在宿 主細(xì)胞中重組表達(dá)抗體，利用攜帶編碼多功能抗體的輕鏈和/或scFv-重鏈融合物的DNA片 段的一個(gè)或多個(gè)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染等宿主細(xì)胞?？梢詮脑谝粋€(gè)載體中它們可操 作地連接的不同啟動(dòng)子獨(dú)立表達(dá)重鏈和輕鏈，或，或者，可以從在兩個(gè)載體(一個(gè)表達(dá)重鏈， 一個(gè)表達(dá)輕鏈）中它們可操作地連接的不同啟動(dòng)子獨(dú)立表達(dá)重鏈和輕鏈。任選地，可以在不 同的宿主細(xì)胞中表達(dá)重鏈和輕鏈。優(yōu)選地，重組抗體可以分泌到培養(yǎng)基中，在所述培養(yǎng)基中 培養(yǎng)宿主細(xì)胞，從所述培養(yǎng)基中回收或純化抗體。
[0093]可以通過將編碼HCVR的DNA可操作地連接編碼重鏈恒定區(qū)的另一 DNA分子來將編 碼HCVR區(qū)的分離的DNA轉(zhuǎn)化成全長重鏈基因。人以及其他哺乳動(dòng)物重鏈恒定區(qū)基因的序列 為本領(lǐng)域所知。可以例如通過標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增獲得包括這些區(qū)域的DNA片段。重鏈恒定區(qū)可 以是任何類型（例如，IgG、IgA、IgE、IgM或IgD)、種類(例如，IgGi、IgG2、IgG3和IgG4)或亞類 恒定區(qū)和Kabat (上文）中描述的其任何同種異型變體。
[0094]可以通過將編碼LCVR的DNA可操作地連接編碼輕鏈恒定區(qū)的另一 DNA分子來將編 碼LCVR區(qū)的分離的DNA轉(zhuǎn)化成全長輕鏈基因（以及Fab輕鏈基因）。人以及其他哺乳動(dòng)物輕鏈 恒定區(qū)基因的序列為本領(lǐng)域所知?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增獲得包括這些區(qū)域的DNA片段。 輕鏈恒定區(qū)可以是κ或λ恒定區(qū)。
[0095] 除了抗體重鏈和/或輕鏈基因，本發(fā)明的重組表達(dá)載體攜帶在宿主細(xì)胞中控制抗 體鏈基因表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"旨在包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)控制元件 (例如，多腺苷酸化信號(hào)），需要時(shí)其控制抗體鏈基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯。表達(dá)載體的設(shè)計(jì)，包括 調(diào)節(jié)序列的選擇可以取決于這樣的因素，如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所希望的蛋白的表 達(dá)水平。用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平 的蛋白表達(dá)的病毒元件，諸如來源于巨細(xì)胞病毒(CMV)的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子、猿猴病毒40 (SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(AdMLP))和/或多瘤病毒。
[0096] 此外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以攜帶額外序列，諸如在宿主細(xì)胞中調(diào)節(jié)載體復(fù) 制的序列（例如，復(fù)制起點(diǎn)）和一個(gè)或多個(gè)可選標(biāo)志物基因。所述可選標(biāo)志物基因利于其中 已經(jīng)引入載體的宿主細(xì)胞的選擇。例如，通?？蛇x標(biāo)記物基因賦予其中已引入載體的宿主 細(xì)胞對藥物諸如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。優(yōu)選的可選標(biāo)志物基因包括二氫葉酸還 原酶(dhfr)基因（用于具有甲氨蝶呤選擇/擴(kuò)增的dhfr-宿主細(xì)胞中）、neo基因（用于G418選 擇），和在GS陰性細(xì)胞系(如NS0)中用于選擇/擴(kuò)增的谷氨酰胺合成酶(GS)。
[0097]為了表達(dá)輕鏈和/或重鏈，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖 轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染等將編碼重鏈和/或輕鏈的表達(dá)載體引入到宿主細(xì)胞中。盡管理論上可以 在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體，但是優(yōu)選真核細(xì)胞，并最優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主 細(xì)胞，因?yàn)樵摷?xì)胞更可能裝配和分泌正確折疊和免疫活性的抗體。用于表達(dá)本發(fā)明的重組 抗體的優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢(CH0細(xì)胞）[包括dhfr- CHO細(xì)胞，描述于 Urlaub和Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20，1980中，與DHFR可選標(biāo)記 物使用，例如如描述于Kaufman和Sharp，J. Mol. Biol. 159:601-21，1982中]，NSO骨髓 瘤細(xì)胞、COS細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞。當(dāng)將編碼抗體基因的重組表達(dá)載體引入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞 中時(shí)，通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞足以允許在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體，或更優(yōu)選地，將抗體分泌到其中 在本領(lǐng)域已知的適當(dāng)條件下生長宿主的培養(yǎng)基中一段時(shí)間來產(chǎn)生抗體?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的純 化方法從宿主細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中回收抗體。
[0098] 也可以通過常規(guī)技術(shù)使用宿主細(xì)胞來產(chǎn)生完整抗體的部分或片段，例如Fab片段 或scFv分子。例如，希望利用編碼本發(fā)明的輕鏈或重鏈的DNA轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。重組DNA技術(shù)也 可以用于去除對結(jié)合EGFR和MET非必需的編碼輕鏈和重鏈任一者或兩者的一些或所有DNA。 從該截短的DNA分子表達(dá)的分子也包括在本發(fā)明的抗體中。
[0099] 本發(fā)明提供包含本發(fā)明的核酸分子的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的宿主細(xì)胞包含 一個(gè)或多個(gè)這樣的載體或構(gòu)建體，其包含本發(fā)明的核酸分子。例如，本發(fā)明的宿主細(xì)胞是其 中已經(jīng)引入本發(fā)明的載體的細(xì)胞，所述載體包含編碼本發(fā)明的抗體的LCVR的多核苷酸和/ 或編碼本發(fā)明的HCVR的多核苷酸。本發(fā)明還提供其中已經(jīng)引入本發(fā)明的兩個(gè)載體的宿主細(xì) 胞;一個(gè)包含編碼本發(fā)明的抗體的LCVR的多核苷酸，一個(gè)包含編碼本發(fā)明的抗體中存在的 HCVR的多核苷酸，并且各自可操作地連接增強(qiáng)子/啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件(例如，來源于SV40、CMV、 腺病毒等，如CMV增強(qiáng)子/AdMLP啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件或SV40增強(qiáng)子/AdMLP啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件）以驅(qū) 動(dòng)基因的高水平轉(zhuǎn)錄。
[0100] 一旦表達(dá)，可以根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，包括硫酸銨沉淀、離子交換、親合力(例如 蛋白A)、反相、疏水性相互作用柱層析、羥磷灰石層析、凝膠電泳等純化本發(fā)明的完整抗體、 單條輕鏈和重鏈，或其他免疫球蛋白形式。對于藥物用途，優(yōu)選至少約90%、約92%、約94%或 約96%同質(zhì)性的實(shí)質(zhì)上純的免疫球蛋白，并且最優(yōu)選約98%-約99%或更高同質(zhì)性。一旦純化 (部分地或至期望的同質(zhì)性的），則無菌抗體可以隨后治療性使用，如本文所指示。
[0101]如本文所用的術(shù)語"分離的多核苷酸"應(yīng)表示基因組、cDNA、或合成來源或其一些 組合的多核苷酸，其由于其起源，所述分離的多核苷酸（1)不伴隨其中在自然界中發(fā)現(xiàn)所述 分離的多核苷酸的多核苷酸的全部或一部分，（2)與其在自然界中不相連的多核苷酸連接， 或(3)不作為更大序列的一部分存在于自然界中。
[0102] "分離的"多功能抗體是已經(jīng)從它的天然環(huán)境的組分中鑒定和分離和/或回收的抗 體。其天然環(huán)境的污染組分是會(huì)干擾抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，并且可以包括酶、激素 和其他蛋白質(zhì)性質(zhì)的或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體將被純化至（1)如 通過Lowry法所測定，大于95重量%抗體，并最優(yōu)選大約99重量％，（ 2)通過使用旋轉(zhuǎn)杯測序儀 足以獲得N末端或中間氨基酸序列的至少15個(gè)殘基的程度，或（3)在還原或非還原條件下 使用考馬斯亮藍(lán)、SimplyBlue ? SafeStain (Life Technologies)或，優(yōu)選銀染通過SDS-PAGE的同質(zhì)性。分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體，因?yàn)榭贵w的天然環(huán)境的至少一種 組分將不存在。
[0103]如本文所用，"實(shí)質(zhì)上純的"或"實(shí)質(zhì)上純化的"表示存在的主要種類的化合物或種 類（即，在摩爾基礎(chǔ)上，其比組合物中任何其他個(gè)體種類更豐富）。在某些實(shí)施方案中，實(shí)質(zhì) 上純化的組合物是這樣的組合物，其中所述種類占至少約50%(在摩爾基礎(chǔ)上）的所有存在 的大分子種類。在某些實(shí)施方案中，實(shí)質(zhì)上純的組合物將包含多于約80%、85%、90%、95%或 99%的組合物中存在的所有大分子種類。在某些實(shí)施方案中，種類純化至實(shí)質(zhì)的同質(zhì)性(污 染物種類在組合物中通過常規(guī)檢測方法無法檢測到），其中組合物基本上由單一大分子種 類組成。
[0104]在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的多核苷酸，其編碼選自SEQ ID NOs: 27、29 和33的氨基酸序列。
[0105] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含多核苷酸的重組表達(dá)載體，所述多核苷酸編 碼選自SEQ ID NOs: 27、29和33的氨基酸序列。
[0106] 本發(fā)明也提供任一前述的抗MET/EGFR多功能抗體、或其MET和EGFR結(jié)合片段，其用 于治療。
[0107] 本發(fā)明也提供任一前述的抗MET/EGFR多功能抗體、或其MET和EGFR結(jié)合片段，其用 于治療癌癥。
[0108] 本發(fā)明也提供任一前述的抗MET/EGFR多功能抗體、或其MET和EGFR結(jié)合片段，其用 于治療其中表達(dá)MET和EGFR的癌癥。
[0109] 本發(fā)明也提供任一前述的抗MET/EGFR多功能抗體，或其MET和EGFR結(jié)合片段，其用 于治療NSCLC、SCLC、胃癌、結(jié)腸直腸癌、膽管癌、食道癌、黑素瘤包括但不限于葡萄膜黑素 瘤、腎癌、肝癌、膀胱癌、子宮頸癌、或頭頸癌。
[0110]本發(fā)明也提供治療癌癥的方法，其包括向需要治療的人患者施用有效量的任一前 述的多功能抗體、或其MET和EGFR結(jié)合片段。
[0111] 術(shù)語"治療"（或"治療"或"治療"）指減緩、中斷、阻止、控制、終止、減少或反轉(zhuǎn)癥 狀、病癥、狀況或疾病的進(jìn)程或嚴(yán)重性，但并不必須涉及所有疾病相關(guān)癥狀、狀況或病癥的 總體消除。
[0112] 術(shù)語"癌癥"（或"癌癥"）指增生性疾病，諸如肺癌、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、小細(xì)胞 肺癌(SCLC )、頭頸癌、直腸癌、肛門區(qū)癌、胃癌、胃癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌(CRC )、食道癌、黑 素瘤包括但不限于葡萄膜黑素瘤、肝癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎 盂癌，包括任何上述癌癥的難治性形式，或一種或多種上述癌癥的組合。
[0113] 如本文所用的短語"有效量"指達(dá)到希望的治療結(jié)果所必需的量(劑量和時(shí)期和施 用手段）。多功能抗體的有效量可以根據(jù)這樣的因素，諸如疾病狀態(tài)、年齡、性別，和個(gè)體體 重，以及抗體的能力，或其MET和EGFR結(jié)合片段而變化，以在個(gè)體中引發(fā)所希望的響應(yīng)。有效 量也是這樣的量，其中抗體、或其MET和EGFR結(jié)合片段的治療有益效果超過其任何有害效 果。
[0114] 有效量是活性劑的至少最小量，但低于總體有害量，其為向主體傳遞治療益處所 必需。換言之，本發(fā)明的抗體的有效量或治療有效量是這樣的量，其在哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人中 減少癌細(xì)胞的數(shù)量;減小腫瘤大小;抑制（即，減緩至一定程度或終止)癌細(xì)胞浸潤到外周組 織器官中；抑制（即，減緩至一定程度或終止)腫瘤轉(zhuǎn)移;抑制腫瘤生長至一定程度;和/或緩 解與癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀至一定程度?？梢砸詥未蝿┝炕蚨啻蝿┝渴┯糜行Я康谋?發(fā)明的抗MET/EGFR多功能抗體。此外，可以以多次劑量的量施用有效量的本發(fā)明的抗MET/ EGFR多功能抗體，所述多次劑量如果不是多于一次施用，那么將會(huì)低于有效量。
[0115] 如醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所熟知，用于任一主體的劑量取決于許多因素，包括患者的大小、體表 面積、年齡、待施用的具體化合物、性別、施用時(shí)間和途徑、一般健康，和同時(shí)施用的其他藥 物。劑量根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重性可以進(jìn)一步變化。典型劑量可以是例如以下范圍，約I mg -約100 mg;優(yōu)選約2 mg -約100 mg;更優(yōu)選約5 mg -約100 mg;甚至更優(yōu)選約5 mg -約50 mg，甚至更優(yōu)選約5 mg -約25 mg;甚至更優(yōu)選約5 mg -約20 mg;甚至更優(yōu)選 約5 mg -約15 mg;然而，考慮低于或高于該示例性范圍的劑量，尤其考慮上述因素時(shí)。每 日腸胃外劑量方案可以從約10 yg/kg-約10 mg/kg。可以通過周期評估監(jiān)測進(jìn)程，并因此調(diào) 節(jié)劑量。
[0116] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可以經(jīng)靜脈內(nèi)施用單次劑量的本發(fā)明的多功能抗體 用于在成年患者中治療癌癥。用于靜脈內(nèi)施用的典型的單次劑量可以是例如，約IOOmg-約 1250mg的范圍內(nèi)；優(yōu)選，約200 mg -約1250 mg;更優(yōu)選，約500 mg -約1250 mg;甚至 更優(yōu)選，約750 mg -約1250 mg，甚至更優(yōu)選，約800 mg -約1250 mg;甚至更優(yōu)選，或 最優(yōu)選約800 mg -約1000 mg;然而，考慮低于或高于該示例性范圍的劑量，尤其考慮上 述因素時(shí)?；蛘?，用于靜脈內(nèi)施用本發(fā)明的多功能抗體的典型的單次劑量可以是例如，約10 mg/kg -約20 mg/kg體重，更優(yōu)選約12 mg/kg -約15 mg/kg，或甚至更優(yōu)選約12 mg/ kg -約13 mg/kg。例如，可以每周一次，每兩周一次，每三周一次，或每月一次靜脈內(nèi)施用 該劑量。可以通過周期評估監(jiān)測進(jìn)程，并因此調(diào)節(jié)劑量。
[0117] 這些提示量的抗體進(jìn)行了大量的治療判斷。選擇合適劑量和方案中的關(guān)鍵因素是 所獲得的結(jié)果。在該上下文中的考慮因素包括所治療的具體病癥、個(gè)體患者的臨床狀況、病 癥起因、抗體的遞送位點(diǎn)、抗體的具體類型、施用方法、施用方案，和醫(yī)學(xué)技術(shù)人員已知的其 他因素。
[0118] 本發(fā)明的抗MET/EGFR多功能抗體在人醫(yī)學(xué)中用作藥物，其通過多種途徑施用。因 此，本發(fā)明還提供包含任一上述多功能抗體，或其MET和EGFR結(jié)合片段，和藥學(xué)上可接受的 載體，稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。最優(yōu)選地，該組合物用于腸胃外施用。如本文所用的 術(shù)語腸胃外包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、直腸、陰道，或腹膜內(nèi)施用。優(yōu)選通過靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi) 或皮下施用的腸胃外遞送。最優(yōu)選靜脈內(nèi)施用。用于該施用的合適的媒介物為本領(lǐng)域所熟 知。
[0119] 藥物組合物在所提供的容器，包括例如密封瓶、注射器或其他遞送裝置，例如筆 (pen)中，在制造和儲(chǔ)存條件下通常必須是無菌且穩(wěn)定的。因此，藥物組合物在制備制劑后 必須無菌過濾，或以其他方式在無微生物污染下制備。
[0120] 本發(fā)明的抗體可以單獨(dú)或與藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑一起以單次或多次 劑量向人主體施用。可以將該藥物組合物設(shè)計(jì)適用于所選的施用模式，并且適當(dāng)使用藥學(xué) 上可接受的稀釋劑、載體和/或賦形劑，諸如分散劑、緩沖液、表面活性劑、防腐劑、增溶劑、 等滲劑，包括但不限于氯化鈉、穩(wěn)定劑等。可以根據(jù)例如Remington, The Science and Practice of Pharmacy,第19版，Gennaro，編輯，Mack Publishing Co. , Easton, PA (1995)(其提供技術(shù)人員一般已知的配制技術(shù)的摘要）中公開的常規(guī)技術(shù)設(shè)計(jì)該組合物。用 于藥物組合物的合適載體包括任何材料，當(dāng)與本發(fā)明的抗體組合時(shí)，其保留分子活性并不 與主體免疫系統(tǒng)反應(yīng)。
[0121] 以下非限制性實(shí)施例闡明了本發(fā)明多功能抗體的多種性質(zhì)。 實(shí)施例
[0122] 參考實(shí)施例1 1.1.表達(dá)和純化多功能抗體NH-YK 可以基本如下表達(dá)和純化多功能抗體NH-YK。使用含有SEQ ID NO: 28 (編碼具有SEQ ID NO: 27的氨基酸序列的第一多肽）和SEQ ID NO: 34 (編碼SEQ ID NO: 33的輕鏈氨基 酸序列）的DNA的谷氨酰胺合成酶(GS)表達(dá)載體通過電穿孔來轉(zhuǎn)染中國倉鼠細(xì)胞系CH0K1SV (Lonza Biologies PLC，Slough, United Kingdom)。表達(dá)載體編碼SV早期（猿猴病毒40E) 啟動(dòng)子和GS的基因。GS的表達(dá)允許谷氨酰胺(CH0K1SV細(xì)胞需要的一種氨基酸）的生物化學(xué) 合成。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞用50μΜ L-甲硫氨酸磺基肟(MSX)進(jìn)行大量選擇。利用MSX對GS的抑制 來增加選擇的嚴(yán)格性。將整合表達(dá)載體cDNA入宿主細(xì)胞基因組的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)內(nèi)的細(xì)胞對 CH0K1SV野生型細(xì)胞選擇，其表達(dá)內(nèi)源水平的GS。以低密度鋪板轉(zhuǎn)染的庫(pool)以允許穩(wěn)定 表達(dá)細(xì)胞的接近克隆的生長暈（close-to-clonal outgrowth)?？梢院Y選主孔的多功能抗 體表達(dá)，然后根據(jù)需要在無血清懸浮培養(yǎng)物中按比例放大?；蛘?，批量選擇的轉(zhuǎn)染子可以進(jìn) 行單細(xì)胞克隆程序，如熒光激活細(xì)胞分選(FACS)或有限稀釋并篩選多功能抗體表達(dá)。一旦 鑒定到合適的細(xì)胞系，那么根據(jù)需要在無血清懸浮培養(yǎng)物中將其按比例放大。將多功能抗 體已經(jīng)分泌其中的澄清培養(yǎng)基應(yīng)用到蛋白A親和柱上，其已經(jīng)利用相容緩沖液，諸如磷酸緩 沖鹽溶液(pH 7.4)或Tris緩沖液(pH 7.4)進(jìn)行了平衡。洗滌該柱以去除非特異性結(jié)合的 組分。例如通過pH梯度(諸如0.1 M磷酸鈉緩沖液pH 6.8-0.1 M檸檬酸鈉緩沖液pH 2.5-3.0)洗脫結(jié)合的多功能抗體。諸如通過280 nm處切割(cutting)的吸光度、SDS-PAGE或分析 大小排阻檢測和/或收集多功能抗體級(jí)分。通過常見技術(shù)包括尺寸排阻、疏水相互作用、離 子交換或羥基磷灰石層析可以將可溶的聚集體或多聚體有效去除?？梢允褂贸Ｒ娂夹g(shù)將多 功能抗體濃縮和/或無菌過濾。這些層析步驟后多功能抗體的純度高于90%，優(yōu)選高于98%。 可以在-70 °C立即冰凍多功能抗體或儲(chǔ)存在4 °C數(shù)月。
[0123] 1.2.表達(dá)和純化多功能抗體NH-H9 可以基本如參考實(shí)施例1.1中上述表達(dá)和純化多功能抗體NH-H9,例外是使用含有SEQ ID NO: 30 (編碼具有SEQ ID NO: 29的氨基酸序列的第一多肽）和SEQ ID NO: 34 (編碼 SEQ ID NO: 33的輕鏈氨基酸序列）的DNA的谷氨酰胺合成酶(GS)表達(dá)載體通過電穿孔來轉(zhuǎn) 染中國倉鼠細(xì)胞系CH0K1SV (Lonza Biologies PLC, Slough, United Kingdom)。
[0124] 1.3.表達(dá)和純化多功能抗體H9 可以基本如參考實(shí)施例1.1中上述表達(dá)和純化多功能抗體H9,例外是使用含有編碼具 有SEQ ID NO: 52的氨基酸序列的第一多肽的DNA和SEQ ID NO: 34的DNA(編碼SEQ ID NO: 33的輕鏈氨基酸序列）的谷氨酰胺合成酶(GS)表達(dá)載體通過電穿孔來轉(zhuǎn)染中國倉鼠細(xì)胞系 CHOKISV (Lonza Biologies PLC, Slough, United Kingdom)〇
[0125] 1.4.表達(dá)和純化多功能抗體YK 可以基本如參考實(shí)施例1.1中上述表達(dá)和純化多功能抗體H9,例外是使用含有編碼具 有SEQ ID NO: 31的氨基酸序列的第一多肽的DNA和SEQ ID NO: 34的DNA(編碼SEQ ID NO: 33的輕鏈氨基酸序列）的谷氨酰胺合成酶(GS)表達(dá)載體通過電穿孔來轉(zhuǎn)染中國倉鼠細(xì)胞系 CHOKISV (Lonza Biologies PLC, Slough, United Kingdom)〇
[0126] 實(shí)施例1:多功能抗體與MET和EGFR的結(jié)合分析 可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，使用表面等離子體共振生物傳感器，諸如BIAcore ? 2000、BIAcore? 3000或BIAcore? TlOO (Biacore Life Sciences Division, GE Healthcare, Piscataway，NJ)來測量抗體，諸如本文公開的抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)和親合力。 除非另有說明，可以從BIAcore ? AB (Upsala, Sweden)購買所有試劑和材料，并且可以在 25°C下進(jìn)行測量。簡言之，可以將樣品溶解在HBS-EP緩沖液中（150 mM氯化鈉，3 mM EDTA， 0.005% (w/v)表面活性劑P-20,和10 mM N-2-羥乙基-哌嗪-N'-2-乙磺酸（HEPES)，pH 7.4)?？梢允褂迷谒兴膶恿鲃?dòng)室(Fe)上含有固定蛋白A(其可以使用標(biāo)準(zhǔn)的NHS-EDC胺偶 聯(lián)產(chǎn)生）的CM5芯片來采用捕獲方法學(xué)。開始可以通過稀釋到運(yùn)行緩沖液中以I meg/mL制備 抗體樣品，然后可以以流速10 Ul/分鐘測試其捕獲30秒?；谒东@的量，因而可以調(diào)整抗 體濃度以靶定約70 RU-90 RU的捕獲量。可以通過稀釋到運(yùn)行緩沖液中以100、50、25、12.5、 6·25、3· 13、1 ·56、0·78、0·39和0 (空白）nM的終濃度來制備MET-ECD或人EGFR-ECD。每個(gè)分 析周期可以由以下組成：（1)在分隔開的流動(dòng)室(Fc2、Fc3和Fc4)上捕獲抗體樣品，（2)在所 有Fe以50 mcL/分鐘注射250 mcL (300-sec)的MET-ECD或EGFR-ECD，（3)返回緩沖液流20分 鐘以監(jiān)測解離相，（4)利用25 mcL (30-sec)注射甘氨酸，pH 1.5再生芯片表面，（5)利用25 mcL (30-sec)注射HBS-EP+緩沖液（即，具有0.05% (w/v)而非0.005%的表面活性劑P-20的 HBS-EP緩沖液)平衡芯片表面?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)雙參考處理數(shù)據(jù)并使用Biacore TlOO評估軟 件，2.0版本或Biacore T200評估軟件，1.0版本擬合成1:1結(jié)合模型，來測定結(jié)合速率(k〇n， ifY1單位）、解離速率(Wf，S+1單位)和Rmax (RU單位）?？梢詮年P(guān)系Kd= koff/U+算平衡 解離常數(shù)(Kd)。
[0127] 基本如上所述測試本發(fā)明的四個(gè)抗MET/EGFR多功能抗體以測定其與MET-ECD和 EGFR-ECD的結(jié)合動(dòng)力學(xué)和結(jié)合親合力并在下文表4和5中概述結(jié)果?？贵wNH-YK、NH-H9、H9和 YK以高結(jié)合親合力(Kd )結(jié)合MET-E⑶(表4)和EGFR-E⑶（表5)。
[0128] 表4:多功能抗體與MET-E⑶的結(jié)合動(dòng)力學(xué)和親合力
[0130] 實(shí)施例2: NH-YK與細(xì)胞表面MET和EGFR兩者的結(jié)合 NSCLC細(xì)胞系H441 (ATCC, Manassas, VA;目錄號(hào)HTB-174)在表面上表達(dá)MET和EGFR 兩者?？梢詫441細(xì)胞（6 X IO6)鋪板到100 mm聚-D-賴氨酸包被的組織培養(yǎng)皿上并在37 。(：，5% CO2下孵育2天。然后在4°C，利用100 nM對照IgG4、100 nM西妥昔單抗和100 nM抗 MET抗體的組合，或100 nM NH-YK處理細(xì)胞20分鐘。可以利用冰冷的DPBS洗滌細(xì)胞并使用具 有HALT蛋白酶和磷酸酶抑制劑(Thermo Scientific, Rockford, IL)的CHAPS裂解緩沖液 進(jìn)行裂解。可以使用抗MET瓊脂糖(agarose)或抗EGFR瓊脂糖（sepharose)在600 yg各細(xì)胞 裂解物樣品上進(jìn)行免疫沉淀（IP)并在4 °C下進(jìn)行孵育?？梢韵礈鞓渲臉渲舷礈焖Y(jié) 合的蛋白，然后裝載到4-20% SDS-PAGE上并印跡到硝酸纖維素膜上用于Western印跡?？梢?探測膜的總MET或總EGFR。
[0131] 基本如上所述進(jìn)行的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證明在利用抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK處理 后，而不是利用抗MET抗體、西妥昔單抗，或甚至抗MET抗體和西妥昔單抗的組合處理后MET 和EGFR共免疫沉淀。這些數(shù)據(jù)表明NH-YK可以結(jié)合MET和EGFR(數(shù)據(jù)未顯示）。
[0132] 實(shí)施例3:多功能抗體NH-YK和NH-H9顯示與細(xì)胞表面MET的增強(qiáng)的抗體親抗原性結(jié) 合 NSCLC癌細(xì)胞系HCC827具有高水平的MET表達(dá)。簡言之，可以使用無酶的解離緩沖液從 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中取出HCC827細(xì)胞并以大約5 X IO5細(xì)胞/孔將其添加到96孔板中。然后在4°C 下，利用未標(biāo)記抗體（以500 nM開始）與5 nM Alexa488-標(biāo)記的抗MET抗體的組合劑量滴定 處理細(xì)胞1小時(shí)，以測定未標(biāo)記抗體與標(biāo)記的抗MET抗體競爭結(jié)合細(xì)胞表面MET的能力。最 終，可以通過FACS檢測標(biāo)記的抗MET抗體的結(jié)合。
[0133] 如通過基本如本實(shí)施例中所述進(jìn)行的測定所證明，抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK 和NH-H9比其親本抗MET抗體具有明確較高的抗體親抗原性結(jié)合(表6 )。
[0134] 表6:抗MET/EGFR多功能抗體具有與HCC827細(xì)胞增加的抗體親抗原性結(jié)合
MFI =通過與Alexa 488-標(biāo)記的抗MET Ab競爭表明的平均熒光強(qiáng)度。
[0135] 實(shí)施例4:抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK和NH-H9對于內(nèi)化和降解細(xì)胞表面EGFR比 西妥昔單抗顯示更好的活性 A部分:NSCLC細(xì)胞系H441在其細(xì)胞表面上表達(dá)中等水平的MET和EGFR?？梢詼y試抗MET/ EGFR多功能抗體其耗盡來自H441細(xì)胞的細(xì)胞表面MET和EGFR的能力。簡言之，可以將2 mL培 養(yǎng)基中的1.5 X IO5個(gè)細(xì)胞每孔鋪板到6孔板中并在37°C，5% C〇2下孵育過夜。可以以50 nM 向H441細(xì)胞中加入抗體NH-YK、NH-H9或?qū)φ湛贵w。過夜處理后，可以利用無酶的解離緩沖液 從孔中取出細(xì)胞、洗滌，然后利用標(biāo)記的EGFR或MET抗體(其識(shí)別來自多功能抗體或?qū)φ湛?體處理的不同表位)染色1小時(shí)。洗滌細(xì)胞并通過FACS測量標(biāo)記的抗體染色。
[0136] 為了評估抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK和NH-H9在體內(nèi)促進(jìn)MET和EGFR降解的能 力，基本如該實(shí)施例的A部分中所述進(jìn)行測定。來自這些研究的結(jié)果證明，與其親本抗MET抗 體類似，抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK和NH-H9能夠耗盡來自H441細(xì)胞的細(xì)胞表面MET。令人 驚奇的是，盡管抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK和NH-H9觸發(fā)了顯著的EGFR降解，然而西妥昔 單抗或抗MET抗體和西妥昔單抗的組合卻不會(huì)觸發(fā)(表7)。
[0137] B部分:NSCLC細(xì)胞系H1993表達(dá)高水平的MET和中等水平的EGFR;胃癌細(xì)胞系MKN45 表達(dá)高水平的MET和低水平的EGFR;NSCLC細(xì)胞系H441在其細(xì)胞表面上表達(dá)中等水平的MET 和EGFR。簡言之，可以將2 mL培養(yǎng)基中的5 X IO5個(gè)細(xì)胞每孔鋪板到6孔板中并在37°C，5% CO2下孵育過夜?？梢砸?00 nM向細(xì)胞中加入抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK、NH-H9或?qū)φ湛?體。過夜處理后，可以裂解細(xì)胞，可以將15 Hg各樣品在4-12% BisTris凝膠上跑膠，然后印 跡至IjPVDF膜上?？梢酝ㄟ^western印跡探測膜的總EGFR、總MET和GAPDH。
[0138] 為了評估抗腿1'/^6?1?多功能抗體順-￥1(和順-!19在體外促進(jìn)腿1^陽6?1?降解的能 力，基本如該實(shí)施例的B部分中所述進(jìn)行測定。來自這些研究的結(jié)果證明，與親本抗MET抗體 類似，抗體NH-YK和NH-H9降解來自H1993、MKN45和H441細(xì)胞的MET。然而，令人驚奇的是，抗 MET/EGFR多功能抗體NH-YK和NH-H9觸發(fā)了顯著的EGFR降解，然而西妥昔單抗或親本抗MET 抗體和西妥昔單抗的組合卻不會(huì)觸發(fā)(圖1)。
[0139] 表7.抗MET/EGFR多功能抗體對H441細(xì)胞上的EGFR具有增加的內(nèi)化活性
MFI =平均熒光強(qiáng)度;AVG =平均數(shù);Std. Err =標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0140] 實(shí)施例5:抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK和NH-H9阻斷MET和EGFR激活 A部分：已經(jīng)顯示在存在HGF的情況下NSCLC癌細(xì)胞系H596對EGFR抑制劑的生長抑制作 用具有抗性。因此，該細(xì)胞系可以用于測定在存在HGF的情況下抗體是否可以抑制H596的增 殖。簡言之，可以將100 yL培養(yǎng)基中的3 X IO3個(gè)細(xì)胞/孔鋪板到96孔板中并在37°C，5% CO2 下孵育過夜?？梢詮?00 nM(最終)開始在無血清培養(yǎng)基中以1:3稀釋抗MET/EGFR多功能抗 體NH-YK和NH-H9或?qū)φ湛贵w并將其與50 yL中的50 ng/mL HGF(最終）組合以4x濃度加入 到H596細(xì)胞中。在細(xì)胞額外生長6天結(jié)束時(shí)，可以將平板平衡到室溫30分鐘并且可以加入 100 yL/孔的CellTiter-Glo ? 試劑（Promega Corp.，F(xiàn)itchburg, WI )?？梢酝ㄟ^測量發(fā) 光來測定細(xì)胞活力。
[0141] 基本如該實(shí)施例所述進(jìn)行的測定證明抗MET/EGFR多功能抗體順-￥1(和順-!19比西 妥昔單抗或親本抗MET抗體和西妥昔單抗的組合更好地抑制HGF刺激的H596的體外增殖。
[0142] 表8:抗MET/EGFR多功能抗體在存在HGF的情況下在抑制H596增殖中顯示比單個(gè)抗 體的組合持高的活件
縮寫:AVG =細(xì)胞活力的平均％; Std .Err =標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0143] B部分：其他腫瘤細(xì)胞系也可以用于測定抗MET/EGFR多功能抗體在體外測定中抑 制腫瘤細(xì)胞的增殖中是否具有比兩個(gè)單獨(dú)抗體的組合較高的活性。例如，盡管具有中等水 平的MET表達(dá)，但是已經(jīng)顯示結(jié)腸癌細(xì)胞系GEO受EGFR配體自分泌激活的驅(qū)動(dòng)。肺癌細(xì)胞系 H1666具有EGFR基因擴(kuò)增并且已經(jīng)顯示其增殖受EGFR激活的驅(qū)動(dòng)。NSCLC細(xì)胞系H1993和 EBC-I均表達(dá)高水平的MET(由于MET基因擴(kuò)增），和中等水平的EGFR。
[0144] 基本如該實(shí)施例所述進(jìn)行的測定證明抗MET/EGFR多功能抗體順-￥1(和順-!19比西 妥昔單抗更好地抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系GEO的體外增殖，并且令人驚奇的是，甚至比其親本抗 MET抗體和西妥昔單抗的組合更有效(表9)。
[0145] 表9:抗MET/EGFR多功能抗體在抑制GEO增殖中顯示比單個(gè)抗體的組合較高的活性
縮寫:AVG =細(xì)胞活力的平均％; Std .Err =標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0146] 類似地，表10中顯示的結(jié)果證明抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK、NH-H9和H9各自比 西妥昔單抗更好地抑制H1666增殖，并且比親本抗MET抗體和西妥昔單抗的組合更有效。
[0147] 表10:抗MET/EGFR多功能抗體在抑制H1666增殖中顯示比單個(gè)抗體的組合較高的 活性
縮寫:AVG =細(xì)胞活力的平均％; Std .Err =標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0148] 類似地，表11中顯示的結(jié)果證明抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK和NH-H9各自與其親 本抗MET抗體和西妥昔單抗的組合一樣好地抑制H1993(表11)和EBC-I (表12)增殖，或比其 親本抗MET抗體和西妥昔單抗的組合更好地抑制H1993(表11)和EBC-I (表12)增殖。
[0149] 表11:抗MET/EGFR多功能抗體在抑制H1993增殖中顯示比單個(gè)抗體的組合較高的 活性
縮寫:AVG =細(xì)胞活力的平均％; Std .Err =標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0150]表12:抗MET/EGFR多功能抗體在抑制EBC-I增殖中顯示比單個(gè)抗體的組合較高的 活性
縮寫:AVG =細(xì)胞活力的平均％; Std .Err =標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0151 ] 實(shí)施例6:抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK和NH-H9誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 胃癌細(xì)胞系MKN45可以用于測定抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。簡言之，可以將80 yL培養(yǎng)基中 的3 X IO3細(xì)胞/孔鋪板到96孔板中并在37°C，5%⑶2下孵育過夜?？梢栽诩?xì)胞培養(yǎng)基中稀 釋CellEvent TM 試劑（Life Technologies, Carlsbad, CA)并以每孔 10 yL進(jìn)行添加。為了 100 nM的終濃度，以10 uL的IOx濃度向MKN45細(xì)胞中加入NH-YK、NH-H9或?qū)φ湛贵w。在37°C， 5% C〇2下，可以通過INCUCYTE? Kinetic Imaging System (Essen Bioscience, Ann Arbor，MI)以3小時(shí)的間隔實(shí)時(shí)測量胱天蛋白酶-3/7陽性細(xì)胞，持續(xù)總計(jì)120小時(shí)。
[0152] 如通過基本如該實(shí)施例中所述進(jìn)行的測定所測定，抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK 和NH-H9各自在MKM5中比親本MET Ab和西妥昔單抗的組合誘導(dǎo)更多的體外細(xì)胞凋亡（表 13)。此外，在基本如該實(shí)施例中所述進(jìn)行的測定中，NH-YK比單臂f5D5和埃羅替尼的組合誘 導(dǎo)更高程度的MKN45細(xì)胞凋亡(數(shù)據(jù)未顯示）。
[0153] 表13:MKN45細(xì)胞凋亡測定
縮寫:AVG =細(xì)胞凋亡的平均%增加； Std. Err =標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0154] 實(shí)施例7:抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK在存在HGF的情況下恢復(fù)腫瘤細(xì)胞的埃羅 替尼敏感性 NSCLC癌細(xì)胞系HCC827具有EGFR基因擴(kuò)增和高的MET表達(dá)。HCC827細(xì)胞對埃羅替尼處理 敏感，但是在存在HGF的情況下對埃羅替尼處理變得有抗性。簡言之，可以將100 uL培養(yǎng)基 中的3 X IO3細(xì)胞/孔鋪板到96孔板中并在37°C，5% CO2下孵育過夜。為了50 nM抗體、50 ng/mL HGF和1 μΜ埃羅替尼的終濃度，可以向細(xì)胞中加入NH-YK或?qū)φ湛贵w(hIgG4)l小時(shí)， 隨后加入埃羅替尼和/或HGF。細(xì)胞在37°C，95%相對濕度和5% (v/v) CO2下額外生長3天結(jié) 束時(shí)，可以將平板平衡至室溫30分鐘并加入100 uL/孔CellTiter-Glo ?試劑（Promega Corp.)?？梢栽诙ㄜ壵袷幤魃险袷幤桨?分鐘以混合內(nèi)容物，然后將其在室溫下孵育10分鐘 以穩(wěn)定發(fā)光信號(hào)?？梢酝ㄟ^測量發(fā)光來測定細(xì)胞活力。
[0155]如通過進(jìn)行基本如該實(shí)施例所述的測定所測定，抗體NH-YK在存在HGF的情況下能 夠比親本抗MET抗體與西妥昔單抗的組合更好地恢復(fù)體外HCC827細(xì)胞的埃羅替尼敏感性 (表 14)〇
[0156] 表14:抗MET/EGFR多功能抗體順-￥1(在存在邪?的情況下在恢復(fù)!10：827對埃羅替尼 的敏感性中具有比單個(gè)抗體的組合較高的活性
縮寫:AVG =細(xì)胞活力的平均％; Std .Err =標(biāo)準(zhǔn)誤差;H = HGF。
[0157] 實(shí)施例8:抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK恢復(fù)利用HGF和EGF處理的HT-29細(xì)胞的B-Raf抑制劑PLX4032敏感性 結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29具有B-Raf突變并對B-Raf抑制劑PLX4032敏感。HT-29細(xì)胞在HGF和 EGF刺激后變得對PLX4032或泛(pan)-Raf抑制劑處理有抗性?？梢詼y試抗MET/EGFR多功能 抗體其恢復(fù)利用HGF和EGF處理的HT-29細(xì)胞的PLX4032抑制劑敏感性的能力。簡言之，可以 將100 UL培養(yǎng)基中的3 X IO3細(xì)胞/孔鋪板到96孔板中并在37°C，5% CO2下孵育過夜。在無 血清培養(yǎng)基中稀釋抗體順-￥1(、？1^4032、邪？46?、陽性對照和陰性對照并將其以知濃度加 入到50 nL中的HT-29細(xì)胞中。試劑的終濃度可以是:抗體為50 nM，HGF和EGF為50 ng/mL， PLX4032從1 μΜ開始1:5的稀釋。在細(xì)胞生長額外5天結(jié)束時(shí)，可以將平板平衡到室溫30分鐘 并且可以加入100 yL/孔的CellTiter-Glo ?試劑(Promega Corp.)。可以通過測量發(fā)光來 測定細(xì)胞活力。
[0158] 如通過進(jìn)行基本如該實(shí)施例所述的測定所測定，抗體NH-YK能夠恢復(fù)利用HGF和 EGF處理的ΗΤ-29細(xì)胞的PLX4032敏感性(表15)。此外，抗體NH-YK在恢復(fù)FaDu細(xì)胞中的拉帕 替尼（即，EGFR/HER-2抑制劑)敏感性中優(yōu)于親本抗MET抗體和西妥昔單抗的組合(表16)。
[0159] 表15:抗體NH-YK在存在HGF和EGF的情況下在恢復(fù)HT-29對B-Raf抑制劑PLX4032的 敏感性中具有比單個(gè)抗體的組合較高的活性
縮寫:PLX = PLX4032;AVG =細(xì)胞活力的平均％; Std.Err =標(biāo)準(zhǔn)誤差；H = HGF (50 ng/mL); E = EGF (50 ng/mL) 所有抗體均為50 nM。
[0160] 表16:抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK和NH-H9在存在HGF的情況下在恢復(fù)FaDu對拉 帕替尼的敏感性中具有比單個(gè)抗體的組合較高的活性
[0161 ] 實(shí)施例9:小鼠異種移植模型中的MET和EGFR降解 可以根據(jù)本領(lǐng)域所熟知的方法，在攜帶H441 (NSCLC)和MKN45(胃癌）異種移植腫瘤的 小鼠中評估抗MET/EGFR多功能抗體在體內(nèi)促進(jìn)MET和EGFR降解的能力。
[0162] 在H441異種移植物中給藥后48小時(shí)施用兩個(gè)不同劑量水平（10和27mg/kg)的抗體 NH-YK誘導(dǎo)與親本抗MET抗體和西妥昔單抗（均以20 mg/kg給藥）的組合相當(dāng)水平的MET降 解。相反，當(dāng)與相同異種移植模型中的PBS處理的對照動(dòng)物相比時(shí)，親本抗MET抗體和西妥昔 單抗(均以20 mg/kg給藥）的組合不能誘導(dǎo)EGFR降解。令人驚奇的是，當(dāng)與PBS處理的或親本 抗MET抗體和西妥昔單抗(均以20 mg/kg給藥)處理的小鼠相比時(shí)，施用抗體NH-YK觸發(fā)顯著 的EGFR降解。類似地，在攜帶MKN45胃異種移植物的動(dòng)物中，當(dāng)與親本抗MET抗體和西妥昔單 抗(均以20 mg/kg給藥）的組合相比時(shí)，抗體NH-YK促進(jìn)MET的同等降解，但是令人驚奇地顯 著更高的EGFR降解。
[0163] 實(shí)施例10:在NSCLC (!11993、!144148(：-1)和胃癌的小鼠異種移植模型中抑制腫瘤 生長 可以通過商業(yè)途徑獲得，包括從Harlan Laboratories (Indianapolis, IN)獲得年齡 6-7周的雌性無胸腺裸鼠。允許小鼠適應(yīng)一周并以正常低脂肪(4.5%)飲食隨意飼喂，其可以 在研究期間持續(xù)進(jìn)行?？梢詮腁TCC購買獲得腫瘤細(xì)胞并可以在細(xì)胞培養(yǎng)基，如具有L-谷氨 酰胺、25 mM HEPES的補(bǔ)充有 10% FBS和I mM丙酮酸鈉的RPMI 1640 (Life Technologies) 中進(jìn)行培養(yǎng)。可以利用無血清培養(yǎng)基剝離洗滌細(xì)胞，然后在無血清RPMI 1640中以50 x IO6細(xì)胞/mL的終濃度進(jìn)行重懸浮?？梢栽谥黧w小鼠的后脅腹經(jīng)皮下注射無血清生長培養(yǎng) 基和Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA)的1:1混合物中的大約 5 X IO6 腫瘤 細(xì)胞。每周兩次進(jìn)行腫瘤和體重測量。在處理前，可以使用隨機(jī)算法基于腫瘤大小將小鼠隨 機(jī)化?？梢援?dāng)平均腫瘤體積達(dá)到100 mm3時(shí)開始處理。將隨機(jī)化的小鼠分到不同組中并且每 周一次通過尾靜脈注射以抗體進(jìn)行給藥。
[0164] 在給藥前，在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中制備所有測試或?qū)φ湛贵w?？梢酝ㄟ^卡尺測 量測定腫瘤大小?？梢詮墓紸2 X B X 0.536估計(jì)腫瘤體積(mm3)，其中A是較小的垂直直 徑，B是較大的垂直直徑?？梢詫⒛[瘤體積數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成對數(shù)標(biāo)尺(log scale)以等于跨時(shí)間 和處理組的變量。可以使用SAS PROC MIXED軟件（SAS Institutes Inc, Cary, NC)，利用 雙向重復(fù)測量ANOVA通過時(shí)間和處理分析對數(shù)體積數(shù)據(jù)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上將處理組與規(guī)定 的對照組進(jìn)行比較。
[0165] A部分:如該實(shí)施例中上述產(chǎn)生攜帶H1993 NSCLC異種移植物的免疫缺陷小鼠并利 用媒介物對照、抗體NH-YK或親本MET抗體加西妥昔單抗的組合每周一次進(jìn)行處理，持續(xù)連 續(xù)5周。親本MET抗體和西妥昔單抗(均以20 mg/kg給藥）的組合導(dǎo)致平均處理腫瘤體積除以 平均媒介物對照腫瘤體積(T/C%)值的百分比為86.1%，而等摩爾劑量的抗體NH-YK (27 mg/ kg)導(dǎo)致腫瘤體積顯著更高的降低(T/C%為28.5%，p〈0.001)(圖2)。當(dāng)在H441異種移植物 中測試時(shí)，與媒介物對照或親本MET抗體和西妥昔單抗的組合相比時(shí)，抗體NH-YK也顯示較 高的功效（圖3)。
[0166] B部分：在EBC-I NSCLC異種移植模型中，利用抗體NH-YK的處理（10 mpk)導(dǎo)致 32·9%的T/C%(p〈0·001)(圖4)。
[0167] C部分：胃癌細(xì)胞系MKN45具有高水平的MET基因擴(kuò)增并且對MET抑制劑高度敏感。 在MKN45胃異種移植模型中，抗體NH-YK顯示與親本MET抗體和西妥昔單抗的組合相當(dāng)?shù)目?腫瘤功效(分別為T/C% = 17.4%, p〈 0.001和 18.6%, p〈 0.001)(圖5)。
[0168] D部分:在H1993 NSCLC異種移植模型中，利用媒介物對照、抗MET/EGFR多功能抗體 H9(4和27 mg/kg)、單獨(dú)抗MET(3和20 mg/kg)、西妥昔單抗（3和20 mg/kg)或抗MET加西妥 昔單抗的組合(3 mg/kg和20 mg/kg的每種抗體)每周一次處理攜帶異種移植物的免疫缺陷 小鼠，持續(xù)連續(xù)5周。27 mg/kg的抗MET/EGFR多功能抗體H9導(dǎo)致比任何其他處理顯著更高的 抗腫瘤功效(P〈〇. 001)(圖6)。
[0169] 當(dāng)在H441異種移植物中測試時(shí)，當(dāng)與單個(gè)處理或親本MET抗體和西妥昔單抗的組 合相比時(shí)，抗體H9也顯示較高的功效（圖7 )。
[0170] 實(shí)施例11:在結(jié)腸直腸癌患者來源的異種移植(PDX)模型中抑制腫瘤生長 可以獲得患者來源的結(jié)腸直腸癌樣品并且可以將來源于單個(gè)患者的腫瘤片段植入單 只缺乏免疫的小鼠中并允許其生長直至達(dá)到大概100-200 mm3的體積?？梢悦恐芤淮问┯?以27 mg/kg的抗體NH-YK或媒介物對照，持續(xù)連續(xù)3-4周?？梢悦恐軆纱瓮ㄟ^電子卡尺測量 腫瘤。也可以定期評估體重?？梢岳靡悦恐芤淮蔚陌才磐ㄟ^腹膜內(nèi)（i.p.)注射施用的磷 酸緩沖鹽溶液(PBS)來處理媒介物對照組，進(jìn)行4個(gè)周期。可以使用公式計(jì)算腫瘤體積:A 2 X B X 0.536,其中A是較小的垂直直徑，B是較大的垂直直徑。
[0171] 基本如該實(shí)施例11中上述將來自兩個(gè)患者的結(jié)腸直腸癌樣品單獨(dú)植入到兩只不 同的缺乏免疫的小鼠中。如表17和18中所示，當(dāng)與攜帶rox腫瘤的媒介物處理的動(dòng)物進(jìn)行比 較時(shí)，每周施用抗體NH-YK顯著減少rox腫瘤各自的體積。
[0172] 表17
[0174] 實(shí)施例12:在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（SCCHN)患者來源的異種移植(PDX)模型中抑制腫 瘤生長 可以獲得患者來源的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(SCCHN)樣品并且可以將來源于單個(gè)患者的腫 瘤片段植入單只缺乏免疫的小鼠中并允許其生長直至達(dá)到大概100-200 mm3的體積?？梢?每周兩次施用以27 mg/kg的抗體NH-YK或媒介物對照，持續(xù)連續(xù)4周。可以每周兩次通過電 子卡尺測量腫瘤。也可以定期評估體重?？梢匀缦绿幚砻浇槲飳φ战M:利用以每周一次的安 排通過腹膜內(nèi)注射施用的PBS，進(jìn)行4個(gè)周期，和以每周一次的安排通過口服飼喂(p.o.)施 用的20% PEG 400/80% [蒸餾去離子水中的20% captisol]，進(jìn)行28個(gè)周期?？梢允褂霉?計(jì)算腫瘤體積:腫瘤體積(mm3)=寬度2 X長度X 0.52。
[0175] 基本如該實(shí)施例12中上述將來自兩個(gè)患者的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌樣品單獨(dú)植入到 兩只不同的缺乏免疫的小鼠中。如表19中所示，當(dāng)與攜帶rox腫瘤的媒介物處理的動(dòng)物進(jìn)行 比較時(shí)，每周兩次施用抗體NH-YK顯著減少rox腫瘤的體積。
[0176] 表19
均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。
[0177] 實(shí)施例13:在埃羅替尼抗性NSCLC (埃羅替尼抗性HCC-827)的小鼠異種移植模 型中抑制腫瘤生長 可以通過商業(yè)途徑獲得，包括從Harlan Laboratories獲得年齡6-7周的雌性無胸腺裸 鼠。允許小鼠適應(yīng)一周并以正常低脂肪(4.5%)飲食隨意飼喂，其可以在研究期間持續(xù)進(jìn)行。 可以從ATCC購買獲得HCC-827腫瘤細(xì)胞并可以在細(xì)胞培養(yǎng)基諸如具有L-谷氨酰胺、25 mM HEPES的補(bǔ)充有10% FBS和I mM丙酮酸鈉的RPMI 1640中進(jìn)行培養(yǎng)?？梢岳脽o血清培養(yǎng)基 剝離洗滌細(xì)胞，然后在無血清RPMI 1640中以50 X IO6細(xì)胞/mL的終濃度進(jìn)行重懸浮?？?以在雌性無胸腺裸鼠的后脅腹經(jīng)皮下植入無血清生長培養(yǎng)基和Matrigel的1:1混合物中的 大約5 X IO6活的腫瘤細(xì)胞。一旦腫瘤建立，那么利用25 mg/kg埃羅替尼的每日劑量處 理小鼠，直至即使在存在埃羅替尼的情況下抗性腫瘤也開始重新生長。一旦抗性腫瘤達(dá)到 大概1000 mm3的平均體積，可以將它們切除，分成50 mm3的片段并重新植入到主體雌性無胸 腺裸鼠中。為了監(jiān)測重新生長，可以每周兩次進(jìn)行腫瘤和體重的測量。一旦平均腫瘤體積達(dá) 到100 mm3,使用隨機(jī)算法將動(dòng)物隨機(jī)化并分到處理組中。在PBS中稀釋抗體并通過尾靜脈 注射每周一次施用。為了保證腫瘤是埃羅替尼抗性的，對照組中的動(dòng)物接受PBS媒介物和25 mg/kg埃羅替尼。通過電子卡尺測定并可以從公式A2 X B X 0.536估計(jì)腫瘤體積(mm3)，其 中A是較小的垂直直徑，B是較大的垂直直徑。
[0178] 如該實(shí)施例中上述產(chǎn)生攜帶埃羅替尼抗性的HCC-827 NSCLC異種移植物的免疫缺 陷小鼠并利用以下進(jìn)行處理：（A)媒介物加25 mg/kg埃羅替尼（即，對照組），（B) 25 mg/ kg埃羅替尼和27 mg/kg抗體NH-YK的組合，（C)25 mg/kg埃羅替尼和20 mg/kg西妥昔單 抗的組合，（D)以20 mg/kg給藥的親本MET抗體和25 mg/kg埃羅替尼的組合，或（E)以20 mg/kg給藥的親本MET抗體、以20 mg/kg給藥的西妥昔單抗和25 mg/kg埃羅替尼的組合。與 所有其他處理組相比，在相同或更長的時(shí)期后，抗體NH-YK和埃羅替尼的組合（即，處理組 (B))導(dǎo)致絕對腫瘤體積的顯著減少（表20)。因此，利用抗體NH-YK和埃羅替尼的組合處理 后，特別是當(dāng)與利用組合有PBS媒介物、西妥昔單抗或親本MET抗體的埃羅替尼處理的動(dòng)物 相比時(shí)，攜帶埃羅替尼抗性的腫瘤的小鼠中的腫瘤生長被顯著減小。當(dāng)與埃羅替尼、西妥昔 單抗和親本MET抗體的組合(E)相比時(shí)，抗體NH-YK和埃羅替尼(B)的組合也顯示較高的抗腫 瘤功效。
[0179] 表20
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 多功能抗體，其包含 (a) 抗體，所述抗體結(jié)合MET并包含： i) 重鏈，所述重鏈包含分別由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列組成的重鏈CDR HCDR1、 HCDR2 和 HCDR3;和 ii) 輕鏈，所述輕鏈包含分別由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列組成的輕鏈CDR LCDR1、LCDR2和 LCDR3;和 (b) scFv多肽，所述scFv多肽結(jié)合EGFR并包含： i) HCVR結(jié)構(gòu)域，所述HCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIXiSGGNTDYNTPFX2G (SEQ ID NO: 9)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3，其中Xi為Y或W且X2為K或T;和 ii) LCVR結(jié)構(gòu)域，所述LCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、XiYAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDR1、scFv-LCDR2 和 scFv-LCDR3，其中 Xi 為 R或 Y，X2 為K或 S，且X3 為E或 R。2. 權(quán)利要求1的多功能抗體，其中結(jié)合EGFR的scFv包含： i) HCVR結(jié)構(gòu)域，所述HCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和 ii) LCVR結(jié)構(gòu)域，所述LCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDR1、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。3. 權(quán)利要求1或2的多功能抗體，其中所述scFv多肽包含： (a) 包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的HCVR結(jié)構(gòu)域;和 (b) 包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LCVR結(jié)構(gòu)域。4. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的多功能抗體，其中所述重鏈包含SEQ ID NO: 53的氨基酸序 列并且所述輕鏈包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列。5. 權(quán)利要求1 - 3中任一項(xiàng)的多功能抗體，其中所述s c F v多肽的C末端經(jīng)肽接頭融合至 MET抗體重鏈的N末端。6. 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的多功能抗體，其包含SEQ ID NO: 25的氨基酸序列。7. 權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的多功能抗體，其中所述重鏈包含SEQ ID NO: 27的氨基酸序 列并且所述輕鏈包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列。8. 權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的多功能抗體，其中結(jié)合MET的抗體包含： (a) 第一重鏈和第二重鏈，其中每一重鏈包含分別由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、 RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列組成的 重鏈CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3;和 (b) 第一輕鏈和第二輕鏈，其中每一輕鏈包含分別由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列組成的輕鏈 CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3。9. 權(quán)利要求8的多功能抗體，其中所述第一 scFv多肽和第二scFv多肽各自包含： i) HCVR結(jié)構(gòu)域，所述HCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和 ii) LCVR結(jié)構(gòu)域，所述LCVR結(jié)構(gòu)域包含由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、 RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、 scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。10. 權(quán)利要求9的多功能抗體，其中所述第一 scFv多肽和第二scFv多肽各自包含： (a) 包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的HCVR結(jié)構(gòu)域;和 (b) 包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LCVR結(jié)構(gòu)域。11. 權(quán)利要求10的多功能抗體，其中所述第一和第二scFv多肽各自包含SEQ ID NO: 23 的氨基酸序列。12. 權(quán)利要求11的多功能抗體，其中結(jié)合MET的抗體包含： i) 第一重鏈和第二重鏈，其中每一重鏈包含SEQ ID NO: 53的氨基酸序列;和 ii) 第一輕鏈和第二輕鏈，其中每一輕鏈包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列。13. 權(quán)利要求12的多功能抗體，其中第一 scFv多肽的C末端經(jīng)肽接頭融合至第一重鏈的 N末端并且第二scFv多肽的C末端經(jīng)肽接頭融合至第二重鏈的N末端。14. 權(quán)利要求13的多功能抗體，其包含兩條第一多肽和兩條第二多肽，其中兩條第一多 肽的氨基酸序列是SEQ ID NO: 27和兩條第二多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO: 33。15. 權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的多功能抗體，其中所述多功能抗體誘導(dǎo)細(xì)胞表面MET和 EGFR的內(nèi)化和/或降解。16. 權(quán)利要求1的多功能抗體，其中結(jié)合EGFR的scFv包含： i) HCVR結(jié)構(gòu)域，所述HCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIWSGGNTDYNTPFTG (SEQ ID NO: 7)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和 ii) LCVR結(jié)構(gòu)域，所述LCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、YYASRSIS (SEQ ID NO: 8)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的8。卩￥〇01?8。卩￥-LCDR1、scFv-LCDR2、scFv-LCDR3 〇17. 權(quán)利要求16的多功能抗體，其中所述scFv多肽包含： (a) 包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的HCVR結(jié)構(gòu)域;和 (b) 包含SEQ ID N0:20的氨基酸序列的LCVR結(jié)構(gòu)域。18. 權(quán)利要求16-17中任一項(xiàng)的多功能抗體，其中結(jié)合MET的抗體包含： i) 包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重鏈;和 ii) 包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的輕鏈。19. 權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)的多功能抗體，其中所述scFv多肽的C末端經(jīng)肽接頭融合 至MET抗體重鏈的N末端。20. 權(quán)利要求16-19中任一項(xiàng)的多功能抗體，其包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列。21. 權(quán)利要求16-20中任一項(xiàng)的多功能抗體，其包含 i) SEQ ID NO:29的氨基酸序列；和 ii)SEQIDN0:33的氨基酸序列。22. 權(quán)利要求21的多功能抗體，其中結(jié)合MET的抗體包含： (a) 第一重鏈和第二重鏈，其中兩條重鏈均包含分別由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: I2)和ARANWLDY (SEQ ID NO: I3)的氨基酸序列組 成的重鏈CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3;和 (b) 第一輕鏈和第二輕鏈，其中兩條輕鏈均包含分別由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列組成的輕鏈 CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3。23. 權(quán)利要求22的多功能抗體，其中所述第一 scFv多肽和第二scFv多肽各自包含： i) HCVR結(jié)構(gòu)域，所述HCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIWSGGNTDYNTPFTG (SEQ ID NO: 7)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和 ii) LCVR結(jié)構(gòu)域，所述LCVR結(jié)構(gòu)域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、YYASRSIS (SEQ ID NO: 8)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的8。卩￥〇01?8。卩￥-LCDR1、scFv-LCDR2、scFv-LCDR3 〇24. 權(quán)利要求23的多功能抗體，其中所述第一 scFv多肽和第二scFv多肽各自包含： i) 包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的HCVR結(jié)構(gòu)域;和 ii) 包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LCVR結(jié)構(gòu)域。25. 權(quán)利要求24的多功能抗體，其中所述第一和第二scFv多肽各自包含SEQ ID NO: 24 的氨基酸序列。26. 權(quán)利要求25的多功能抗體，其中結(jié)合MET的抗體包含： i) 第一重鏈和第二重鏈，其中兩條重鏈均包含SEQ ID NO: 53的氨基酸序列;和 ii) 第一輕鏈和第二輕鏈，其中兩條輕鏈均包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列。27. 權(quán)利要求26的多功能抗體，其中第一 scFv多肽的C末端經(jīng)肽接頭融合至第一重鏈的 N末端并且第二scFv多肽的C末端經(jīng)肽接頭融合至第二重鏈的N末端。28. 權(quán)利要求27的多功能抗體，其包含兩條第一多肽和兩條第二多肽，其中兩條第一多 肽的氨基酸序列是SEQ ID NO: 29和兩條第二多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO: 33。29. 藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)的多功能抗體，或其MET和EGFR結(jié)合片 段，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、或賦形劑。30. 權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)的多功能抗體、或其MET和EGFR結(jié)合片段，其用于治療。31. 權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)的多功能抗體、或其MET和EGFR結(jié)合片段，其用于治療癌癥。 3 2.權(quán)利要求1 - 2 8中任一項(xiàng)的多功能抗體、或其Μ E T和E G F R結(jié)合片段，其用于治療 NSCLC、SCLC、胃癌、結(jié)腸直腸癌、膽管癌、食道癌、黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、腎癌、肝癌、膀胱 癌、子宮頸癌、或頭頸癌。 3 3.權(quán)利要求1 - 2 8中任一項(xiàng)的多功能抗體、或其Μ E T和E G F R結(jié)合片段，其用于治療 NSCLC、SCLC、胃癌、結(jié)腸直腸癌、膽管癌、食道癌、黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、腎癌、肝癌、膀胱 癌、子宮頸癌、或頭頸癌，其中所述癌癥的特征在于包含具有一個(gè)或多個(gè)KRAS突變的細(xì)胞。34.治療癌癥的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)的 多功能抗體、或其MET和EGFR結(jié)合片段。35. 權(quán)利要求34的方法，其中所述癌癥是人中的NSCLC、SCLC、胃癌、結(jié)腸直腸癌、膽管 癌、食道癌、黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、腎癌、肝癌、膀胱癌、子宮頸癌、或頭頸癌。36. 權(quán)利要求34或35的方法，其中所述腫瘤的特征在于包含具有一個(gè)或多個(gè)KRAS突變 的細(xì)胞。 37. DNA分子，其包含編碼具有SEQ ID NO: 27的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。 38. DNA分子，其包含編碼具有SEQ ID NO: 23的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。 39. DNA分子，其包含： (a) 編碼具有SEQ ID NO: 27的氨基酸序列的多肽的多核苷酸;和 (b) 編碼具有SEQ ID NO: 33的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。40. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求37-39中任一項(xiàng)的DNA分子，所述細(xì)胞能夠表達(dá)包 含具有SEQ ID NO: 27的氨基酸序列的第一多肽和具有SEQ ID NO: 33的氨基酸序列的第 二多肽的多功能抗體。41. 權(quán)利要求40的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CH0。42. 用于產(chǎn)生多功能抗體的方法，所述多功能抗體包含其氨基酸序列是SEQ ID NO: 27 的第一多肽和其氨基酸序列是SEQ ID NO: 33的第二多肽，所述方法包括：（1)在使得所述 多功能抗體表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求40或41的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，和(2)回收表達(dá)的多功能 抗體。43. 結(jié)合MET和EGFR的多功能抗體，其通過權(quán)利要求42的方法產(chǎn)生。
【文檔編號(hào)】C07K16/46GK105829345SQ201480070368
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2014年12月17日
【發(fā)明人】H.阿爾達(dá)斯, B.艾倫, 劉玲, 唐鷹, S-H.R.張, P.P.亞基, 呂繼蓉
【申請人】伊萊利利公司