一種檢測生物分子的裝置及方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物分子檢測領(lǐng)域，基于薄膜干涉和旋轉(zhuǎn)掃描成像技術(shù)提供了檢測生物分子的裝置及方法。本發(fā)明所述檢測生物分子的裝置結(jié)構(gòu)簡單，可操作性強。本發(fā)明所述檢測方法，無需對待測生物分子進行富集、挑選、染色，不需要應(yīng)用復(fù)雜的生物傳感器，而且能實現(xiàn)有效的噪聲抑制，具備同時檢測多種生物分子的高密度陣列傳感能力，同時具有檢測成本低、靈敏度高且檢測速度快等特點，適用于特定癌細胞的檢測、流感病毒的快速診斷、藥物分析、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。
【專利說明】
一種檢測生物分子的裝置及方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物分子檢測領(lǐng)域，具體涉及一種檢測生物分子的裝置及方法，尤其 是檢測腫瘤細胞的裝置和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤是機體在各種致瘤因素作用下，局部組織的細胞異常增生而形成的新生物， 常表現(xiàn)為局部腫塊。腫瘤細胞具有異常的形態(tài)、代謝和功能。根據(jù)新生物的細胞特性及對機 體的危害性程度，又將腫瘤分為良性腫瘤和惡性腫瘤兩大類，而癌癥即為惡性腫瘤的總稱。 隨著經(jīng)濟發(fā)展，人們對于生活質(zhì)量的追求越來越高，而癌癥一直是困擾人類的頑疾。國際癌 癥研究機構(gòu)去年出版的《世界癌癥報告》顯示，全球癌癥發(fā)病數(shù)從2008年的1270萬例上升到 2012年的1410萬例，全球癌癥死亡人數(shù)從2008年的760萬人上升到2012年的820萬人。我國 一項覆蓋了8500萬人的調(diào)查表明，目前我國癌癥發(fā)病率為285.91/10萬，死亡率為180.54/ 10萬。全國每年新發(fā)癌癥病例約為312萬例，平均每天8550人，每分鐘就有6人被診斷為癌 癥，每年因癌癥死亡的病例達270萬例。按照人均期望壽命計算，國人一生罹患癌癥的概率 為 22%〇
[0003] 值得注意的是，惡性腫瘤容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，腫瘤細胞從原發(fā)部位，經(jīng)淋巴道，血管或 體腔等途徑，到達其他部位繼續(xù)生長，這增加了對機體的損害。因此，如何快速高效地檢測 出患者全血樣本中的腫瘤細胞有非常重大的現(xiàn)實意義和巨大的市場需求。
[0004] 現(xiàn)有的腫瘤檢測技術(shù)主要基于腫瘤細胞本身存在或分泌的特異性物質(zhì)來完成。理 想的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)符合以下特征：必須由惡性腫瘤細胞產(chǎn)生，并可在血液、組織液、分泌液 或腫瘤組織中測出；不應(yīng)該存在于正常組織和良性疾病中；某一腫瘤的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)該在 該腫瘤的大多數(shù)患者中檢測出來；臨床上尚無明確腫瘤證據(jù)之前最好能測出；腫瘤標(biāo)志物 的量最好能反映腫瘤的大小;在一定程度上能有助于估計治療效果、預(yù)測腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn) 移。然而，實際上并不存在絕對理想的腫瘤標(biāo)志物。現(xiàn)今所知的腫瘤標(biāo)志物中，絕大多數(shù)不 但存在于惡性腫瘤中，而且也存在于良性腫瘤、胚胎組織，甚至正常組織中。因此，這些腫瘤 標(biāo)志物并非惡性腫瘤的特異性產(chǎn)物，但在惡性腫瘤患者中明顯增多。此外，用于標(biāo)記的熒光 劑與標(biāo)記物偶聯(lián)后形成穩(wěn)定的結(jié)合物，被標(biāo)記生物分子活性容易發(fā)生改變，且樣品表面容 易殘留有大量游離熒光分子，影響檢測靈敏度的提升。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測生物分子的裝置及方法，本發(fā)明所述 檢測裝置結(jié)構(gòu)簡單，所述檢測方法無需進行任何的細胞富集，高精度、高靈敏度地確定樣本 中生物分子。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。
[0007] -種生物光盤，依次由基底、透明介質(zhì)層和生物分子銜接層組成。
[0008] 其中，所述基底為硅片，所述透明介質(zhì)層為Si02薄膜或Si3N4薄膜。
[0009] 在一些實施方案中，所述生物分子經(jīng)抗原抗體反應(yīng)固定在生物光盤上。
[0010] 在一些實施方案中，所述生物光盤被分成96個超疏水性的區(qū)域。
[0011]本發(fā)明還提供了上述生物光盤的制備方法，基底蒸鍍透明介質(zhì)后活化修飾。
[0012] 在一些實施方案中，所述活化修飾為依次對蒸鍍透明介質(zhì)后的基底表面進行羥基 化、氨基硅烷化、醛基化、結(jié)合生物分子的抗體。
[0013] 在一些具體實施方案中，所述活化修飾具體包括以下步驟：
[0014] 1)、將蒸鍍透明介質(zhì)后的基底置于食人魚洗液中浸泡25min~35min;
[0015] 2)、3_氨丙基三乙氧基硅烷活化劑浸泡5~15min;
[0016] 3 )、含5 %戊二醛的磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡；
[0017] 4)、將生物分子的抗體結(jié)合在生物光盤表面。
[0018] 進一步的，在一些實施方案中，所述活化修飾還包括硼氫化鈉溶液(NaBH4)清洗的 步驟。
[0019] 在一些實施方案中，所述活化修飾還包括涂覆酪蛋白溶液后清洗的步驟。
[0020] 本發(fā)明還提供了所述生物光盤在檢測生物分子中的應(yīng)用。
[0021] 其中，所述生物分子為腫瘤細胞、病毒、蛋白或基因。
[0022] 在一些實施方案中，所述腫瘤細胞為前列腺癌細胞、肺癌細胞、鼻咽癌細胞、食管 癌細胞、胃癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞、宮頸癌細胞。
[0023] 在一些實施方案中，所述病毒可以為SAS病毒、禽流感病毒。
[0024] 本發(fā)明還提供了一種旋轉(zhuǎn)掃描系統(tǒng)，包括激光器、聚焦透鏡、所述的生物光盤、固 定生物光盤的機械轉(zhuǎn)臺、反射鏡、光電倍增管、電腦控制器;所述電腦控制器控制固定生物 光盤的機械轉(zhuǎn)臺以固定角速度旋轉(zhuǎn)，所述激光器發(fā)射的激光經(jīng)過聚焦透鏡聚焦到旋轉(zhuǎn)的生 物光盤上，經(jīng)過生物光盤表面和反射鏡反射后反射信號被所述光電倍增管收集反饋給所述 電腦控制器實時測量生物光盤表面的反射率。
[0025] 本發(fā)明還提供了一種檢測生物分子的方法，包括如下步驟：
[0026] I、采用所述的旋轉(zhuǎn)掃描系統(tǒng)對所述的生物光盤表面進行掃描，記錄生物光盤表面 的原始數(shù)據(jù)；
[0027] II、將待測樣本滴加到生物光盤的檢測區(qū)域，孵育20min，再次對生物光盤表面進 行掃描，記錄數(shù)據(jù)；
[0028] III、比較分析兩次掃描數(shù)據(jù)獲得生物光盤表面生物分子的厚度，根據(jù)已知樣本的 參考區(qū)間獲得待測樣本中生物分子的含量。
[0029] 其中，在一些實施方案中，所述掃描具體為所述固定生物光盤的機械轉(zhuǎn)臺以 500rpm速度旋轉(zhuǎn)，所述激光器發(fā)射488nm的激光以30度的角度經(jīng)過聚焦透鏡聚焦到旋轉(zhuǎn)的 生物光盤表面，電腦控制器控制旋轉(zhuǎn)掃描系統(tǒng)以20mi的精度掃描整張生物光盤。
[0030] 由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明基于薄膜干涉和旋轉(zhuǎn)掃描成像技術(shù)提供了一種高靈 敏度檢測生物分子的裝置及方法。本發(fā)明所述檢測生物分子的生物光盤依次由基底、透明 介質(zhì)層和生物分子銜接層組成，結(jié)構(gòu)簡單，可操作性強。本發(fā)明所述檢測方法在生物光盤表 面使用蛋白打印的方法將特定靶分子固定在光盤表面，當(dāng)樣本中的目標(biāo)分子與靶分子發(fā)生 特異性結(jié)合時，生物光盤表面的遠場反射光信號將受到一定的調(diào)制。通過檢測生物層在識 別前、后的反射光強度變化量，可實現(xiàn)對生物分子的識別和定量檢測。本發(fā)明所述檢測方法 通過光學(xué)的方法探測生物樣本中的微量目標(biāo)分子，無需對待測生物分子進行富集、挑選、染 色，不需要應(yīng)用復(fù)雜的生物傳感器，而且能實現(xiàn)有效的噪聲抑制。另外將血液樣本的生物信 息集成到光盤上，增加了檢測通量，具備同時檢測多種生物分子的高密度陣列傳感能力。同 時具有檢測成本低、靈敏度高且檢測速度快、不接觸、無損探測等特點，適用于特定癌細胞 的檢測、流感病毒的快速診斷、藥物分析、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域，以及炸藥和生化毒劑的預(yù)警，食 品衛(wèi)生檢驗醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中各種無機物、有機物、蛋白質(zhì)、酶、核酸的分析化驗等。
【附圖說明】
[0031] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0032] 圖1旋轉(zhuǎn)掃描系統(tǒng)的示意圖；
[0033]圖2生物光盤的檢測原理圖；
[0034] 圖3實施例1檢測結(jié)果圖，其中圖（a)表示生物光盤一個單元內(nèi)各個點干涉的光強 數(shù)值，（b)表示每一行各點光學(xué)反射強度變化分布，（c)表示整個單元內(nèi)特異性抗原分子含 量和相對信號變化的關(guān)系；（c)圖縱軸表不檢測到反射光強的變化，橫軸表不目標(biāo)分子的含 量，使用標(biāo)準(zhǔn)濃度的樣本對檢測精度的標(biāo)定。
【具體實施方式】
[0035] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的 實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0036]為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0037] 本發(fā)明一個目的是提供一種用于檢測生物分子的裝置即一種生物光盤。所述生物 光盤依次由基底、透明介質(zhì)層和生物分子銜接層組成。
[0038] 由于光的干涉原理，基底的透明介質(zhì)層表面的反射光與從基底的反射光會發(fā)生干 涉相消。本發(fā)明所述生物光盤通過所述生物分子銜接層與待測樣本中的生物分子結(jié)合，使 生物分子固定在生物光盤上，由于生物分子的引入，兩束光將會引入額外的位相差，從而使 得反射率發(fā)生一定程度的變化，通過掃描生物光盤上反射率的變化，檢測待測樣本中的生 物分子。
[0039] 本發(fā)明所述生物光盤中所述基底為檢測裝置基礎(chǔ)的最下部分，具有支撐作用。在 一些實施方案中，所述基底為硅片。本發(fā)明對所述生物光盤中所述基底的形狀不作限制，優(yōu) 選為普通光盤類似的圓盤形狀。
[0040] 本發(fā)明對所述生物光盤中所述透明介質(zhì)層不作限制，只要可以發(fā)生光的反射即 可。在一些實施方案中，所述透明介質(zhì)層為Si〇2薄膜或Si3N4薄膜。
[0041] 檢測的生物分子不同，其固定在生物光盤的方式不同。如通過生物分子上的氨基 和光盤表面活化的醛基發(fā)生反應(yīng)固定在生物光盤的生物分子銜接層上。在一些實施方案 中，本發(fā)明所述的生物光盤所述生物分子經(jīng)抗原抗體反應(yīng)固定在生物光盤的生物分子銜接 層上。
[0042] 為了在同一個生物光盤上進行多個樣本的檢測，生物光盤可以被分成多個不同的 超疏水性的區(qū)域，如96個、48個、24個、12個等等。在一些實施方案中，本發(fā)明所述的生物光 盤被分成96個超疏水性的區(qū)域，一次性可以檢測96個不同的樣本。
[0043] 本發(fā)明還提供了所述生物光盤的制備方法，基底蒸鍍透明介質(zhì)后活化修飾后生成 所述生物分子銜接層。
[0044]其中，所述蒸鍍透明介質(zhì)的具體操作采用等離子體增強化學(xué)氣相沉積法(PECVD) 進行。
[0045] 本發(fā)明所述生物光盤的制備方法在蒸鍍透明介質(zhì)后對生物光盤的透明介質(zhì)表面 進行活化修飾，使得其表面生成一層生物分子銜接層進而結(jié)合待測樣本中的生物分子。
[0046] 在一些實施方案中，所述活化修飾為依次對蒸鍍透明介質(zhì)后的基底表面進行羥基 化、氨基硅烷化、醛基化、結(jié)合生物分子的抗體。
[0047] 進一步的，在一些實施方案中，所述活化修飾具體包括以下步驟：
[0048] a、將蒸鍍透明介質(zhì)后的基底置于食人魚洗液中浸泡25min~35min;
[0049] b、3-氨丙基三乙氧基硅烷活化劑浸泡5~15min;
[0050] c、含5 %戊二醛的磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡；
[0051 ] d、將生物分子的抗體結(jié)合在生物光盤表面。
[0052]食人魚洗液(piranha溶液)是熱的濃硫酸和雙氧水混合物，用于除去材料表面所 有的有機物，同時可以使材料的表面發(fā)生羥基化。本發(fā)明所述活化修飾步驟a將蒸鍍透明介 質(zhì)后的基底用食人魚洗液浸泡后可以使蒸鍍透明介質(zhì)后的基底表面羥基化。進一步的，本 發(fā)明所述活化修飾步驟a還包括水洗后氮氣吹干的步驟。優(yōu)選的，所述水洗為去離子水洗。 [0053]值得注意的是，食人魚洗液中雙氧水和濃硫酸的體積比為1:3，具體的配制過程是 將雙氧水溶液非常緩慢的加入濃硫酸中，加入順序絕對不能顛倒。且該過程劇烈放熱，一定 要等溶液完全冷卻后才可以加熱。
[0054]本發(fā)明所述活化修飾步驟b采用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)活化劑浸泡5~ 15min，基底表面的羥基會和APTES活化劑的羥基發(fā)生縮合反應(yīng)，此時APTES的氨基將處于末 端，使基底表面氨基硅烷化。其中3-氨丙基三乙氧基硅烷活化劑的配制方法為將無水乙醇 與3-氨丙基三乙氧基硅烷以1:19的體積比配成混合溶液。
[0055] 在一些實施方案中，本發(fā)明所述活化修飾步驟b還包括用丙酮和水清洗的步驟。優(yōu) 選的，所述水洗為去離子水洗。
[0056] 進一步的，本發(fā)明所述活化修飾步驟c用含5%戊二醛的磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡 后，基底表面的APTES中的氨基將會和戊二醛上的醛基發(fā)生縮合反應(yīng)，而戊二醛的另外一個 醛基則置于末端，使基底表面醛基化。
[0057]在一些實施方案中，本發(fā)明所述活化修飾步驟c還包括水洗后氮氣吹干的步驟。優(yōu) 選的，所述水洗為去離子水洗。
[0058]在這過程中用于和抗體表面的氨基結(jié)合。
[0059] 本發(fā)明所述活化修飾步驟d將生物分子的抗體結(jié)合在生物光盤表面?？贵w表面的 氨基與基底表面醛基化后戊二醛的一個醛基發(fā)生反應(yīng)形成席夫堿，通過伯胺中的碳氮雙 鍵，抗體被牢牢固定在生物光盤表面。
[0060] 進一步的，本發(fā)明所述活化修飾步驟d還包括硼氫化鈉溶液(NaBH4)清洗的步驟。 硼氫化鈉溶液清洗，可以將原先的碳氮雙鍵反應(yīng)成碳氮單鍵，進一步將抗體穩(wěn)定附著于生 物光盤表面。硼氫化鈉溶液還有助于減小殘余羰基向羥基的轉(zhuǎn)化，從而起到封閉基底的作 用。
[0061] 在一些實施方案中，本發(fā)明所述活化修飾步驟d還包括涂覆酪蛋白溶液后清洗的 步驟。所述酪蛋白溶液由磷酸鹽緩沖液緩沖液與1 %的酪蛋白以20:1的體積比配成，pH 8.0。進一步酪蛋白溶液可以封閉基底與其他生物分子反應(yīng)。隨后使用50mmol/L的檸檬酸溶 液(pH6.0)、PBST溶液(含0.05 %的Tween 20的PBS溶液）以及水清洗，并以800rpm~1200rpm 離心甩干。
[0062] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，如無特殊說明本發(fā)明所述的水洗均優(yōu)選為去離子水 洗。
[0063] 本發(fā)明還提供了上述生物光盤在檢測生物分子中的應(yīng)用。
[0064] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，上述應(yīng)用中所述生物分子可以為腫瘤細胞、病毒、蛋白 或基因。
[0065] 其中，所述腫瘤細胞可以為前列腺癌細胞、肺癌細胞、鼻咽癌細胞、食管癌細胞、胃 癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞、宮頸癌細胞。所述病毒可以為SAS病毒、禽流感 病毒。
[0066] 本發(fā)明還提供了一種包含本發(fā)明所述生物光盤的用于檢測生物分子的裝置即一 種旋轉(zhuǎn)掃描系統(tǒng)。
[0067] 本發(fā)明所述旋轉(zhuǎn)掃描系統(tǒng)包括激光器、聚焦透鏡、本發(fā)明所述的生物光盤、固定生 物光盤的機械轉(zhuǎn)臺、反射鏡、光電倍增管、電腦控制器;所述電腦控制器控制固定生物光盤 的機械轉(zhuǎn)臺以固定角速度旋轉(zhuǎn)，所述激光器發(fā)射的激光經(jīng)過聚焦透鏡聚焦到旋轉(zhuǎn)的生物光 盤上，經(jīng)過生物光盤表面和反射鏡反射后反射信號被所述光電倍增管收集反饋給所述電腦 控制器實時測量生物光盤表面的反射率。具體如圖1所示。
[0068] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，如無特征說明，本發(fā)明所述旋轉(zhuǎn)掃描系統(tǒng)中除所述生 物光盤外各部分均為光學(xué)檢測的常規(guī)部件。如旋轉(zhuǎn)掃描系統(tǒng)中的激光器，本發(fā)明對其品牌、 型號等均沒有限制，只要可以激發(fā)特定的激光即得。
[0069] 本發(fā)明還提供了一種利用本發(fā)明所述生物光盤和旋轉(zhuǎn)掃描系統(tǒng)檢測生物分子的 方法。
[0070] -種檢測生物分子的方法，包括如下步驟：
[0071] I、采用上述的旋轉(zhuǎn)掃描系統(tǒng)對上述的生物光盤表面進行掃描，記錄生物光盤表面 的原始數(shù)據(jù)；
[0072] II、將待測樣本滴加到生物光盤的檢測區(qū)域，孵育20min，再次對生物光盤表面進 行掃描，記錄數(shù)據(jù)；
[0073] III、比較分析兩次掃描數(shù)據(jù)獲得生物光盤表面生物分子的厚度，根據(jù)已知樣本的 參考區(qū)間獲得待測樣本中生物分子的含量。
[0074]本發(fā)明所述檢測生物分子的方法，基于薄膜干涉的原理，利用上述旋轉(zhuǎn)掃描系統(tǒng) 對待測樣本中的生物分子進行檢測。由于光的干涉原理，生物光盤透明介質(zhì)層表面的反射 光與從基底的反射光將以一定的相位差S發(fā)生疊加。相位差S隨透明介質(zhì)層的厚度變化。當(dāng) 光線垂直入射，透明介質(zhì)層厚度為或時，兩個光束會發(fā)生干涉相消。在本發(fā)明所述檢測方法 中，待測樣本滴加到生物光盤表面，待測樣本中的生物分子固定在活化修飾后的透明介質(zhì) 層上。如圖2所示。由于生物分子層的引入，兩束光將會引入額外的位相差，從而使得反射率 發(fā)生一定程度的變化。假定入射光的波長為A，入射角為，生物層的厚度為d(d遠小于波長）， 分別是生物分子層和透明介質(zhì)層表面的反射系數(shù)，分別是生物分子層的折射角和入射角。 加入生物分子層后，總的反射系數(shù)變?yōu)椋?br>[0076]考慮s偏振光的情況，上式可以簡化為：
[0078]反射率的變化量可以表示為：
[0080] 當(dāng)激光在生物光盤上掃描時，由于生物分子層高度不同，光電倍增管中得到的反 射率也會隨之發(fā)生改變。在給定生物分子層時，干涉強度的變化量只與基底的反射系數(shù)有 關(guān)。因此可以求解上述方程式的最大值，并給出此時基底的反射系數(shù)。
[0081] 進一步可以改變蒸鍍的材料，以及入射光的角度盡可能的增大干涉強度的變化 量。同時，為了提高目標(biāo)的檢測效率，減小機械運動(震動）的干擾，可以將工作點選取在初 始相位差為，此時干涉強度（即反射率)會隨著生物分子層高度變化而線性變化。通過旋轉(zhuǎn) 轉(zhuǎn)盤掃描系統(tǒng)，可以得到整個生物光盤上反射率的變化，繼而推演到生物分子層的高度。 [00 82]在一些實施方案中，所述掃描具體為所述固定生物光盤的機械轉(zhuǎn)臺以500rpm速度 旋轉(zhuǎn)，所述激光器發(fā)射488nm的激光以30度的角度經(jīng)過聚焦透鏡聚焦到旋轉(zhuǎn)的生物光盤表 面，電腦控制器控制旋轉(zhuǎn)掃描系統(tǒng)以20mi的精度掃描整張生物光盤。
[0083] 488nm的激光（s偏振）以30度的角度經(jīng)過物鏡聚焦到20mi的光斑，入射到樣品表 面。反射信號經(jīng)光電倍增管收集，實時測量樣品表面的反射率。整個生物光盤固定在機械轉(zhuǎn) 臺上。機械轉(zhuǎn)臺以固定角速度旋轉(zhuǎn)，同時通過機械轉(zhuǎn)臺的移動從而得到整個生物光盤表面 的反射率。系統(tǒng)在電腦控制器的控制下以20M1的精度掃描整張生物光盤，光電倍增管收集 到的反射信號可反推成整個生物光盤上的生物層高度。光電倍增管以很高的頻率去收集生 物層的反射信號，同時整個系統(tǒng)在500rpm轉(zhuǎn)速下運轉(zhuǎn)，可以很好的去除每倍頻40dB的1/f?噪 聲，獲得高達50dB的噪聲抑制，高精度的測量生物分子層的厚度。
[0084] 在一些實施方案中，本發(fā)明所述檢測生物分子的方法步驟II在孵育待測樣本后還 包括水洗甩干的步驟。優(yōu)選的，所述水洗為去離子水洗。
[0085] 在一些實施方案中，為了減小背景噪聲的影響，本發(fā)明在生物光盤的制備過程中， 在結(jié)合生物分子的抗體的同時還設(shè)置了參考蛋白，構(gòu)成一對參考對。本發(fā)明所述檢測生物 分子的方法在加入待測樣本前，先對生物光盤進行掃描，記錄所有蛋白點(包括待測生物分 子和參考蛋白）的初始位置。隨后在指定區(qū)域內(nèi)添加待測樣本，在孵育的過程中，由于免疫 結(jié)合的特性，抗體將捕獲特定的抗原，于是生物光盤表面的生物分子的抗體的高度將有所 增加。孵育過后，對生物轉(zhuǎn)盤再進行一次掃描，獲取光盤上蛋白點的高度數(shù)據(jù)。用抗體的增 加量減去參照蛋白的增加量來定義這種特異性結(jié)合。
[0086] 如果是非特異性結(jié)合，那么其高度的增加量將通過參考蛋白的增加量而減去。通 過前后兩次探測到的生物光盤的反射率，實現(xiàn)生物光盤表面形貌的恢復(fù)，從而實現(xiàn)間接對 特異性結(jié)合的抗原的探測。由上述的公式可以得到與d的關(guān)系：
[0087] 上述檢測獲得是生物分子的高度，但是檢測的最終目的是獲得待測樣本中生物分 子的含量(濃度）。因此本發(fā)明采用現(xiàn)有精度較好的酶聯(lián)免疫吸附測定方案，對待測樣本中 生物分子的濃度進行標(biāo)定。隨后使用這一已知的樣本利用上述檢測方法進行多次檢測，得 到一個參考區(qū)間。對測量結(jié)果進行統(tǒng)計處理，使用3 〇法則去除誤差信號，得到一個置信區(qū) 間，獲得待測樣本中生物分子的含量。
[0088] 為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細闡述。如無特征 說明，本發(fā)明所述的試劑及設(shè)備均為本領(lǐng)域常用試劑及設(shè)備。
[0089] 實施例1、
[0090] 1、實驗材料：
[0091 ]待測樣本:前列腺病人血液；
[0092]實驗試劑:食人魚洗液:體積比為1: 3的雙氧水和濃硫酸的混合物；3-氨丙基三乙 氧基硅烷活化劑:無水乙醇與3-氨丙基三乙氧基硅烷以1:19的體積比配成的混合溶液;酪 蛋白溶液：磷酸鹽緩沖液PBS緩沖液與1 %的酪蛋白以20 :1的體積比配成；PBST溶液：含 0.05%的Tween 20的PBS溶液。
[0093]數(shù)據(jù)采集卡購自NI公司的PCI-6220。
[0094] 2、生物光盤的制備
[0095] 1)采用PECVD在4英寸的硅片上蒸鍍一層Si02后置入食人魚洗液中浸泡30min，然 后使用去離子水反復(fù)清洗，氮氣吹干；
[0096] 2)將處理后的硅片浸入3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES活化劑中l(wèi)Omin，取出后使用 丙酮清洗多次，再用去離子水再次清洗。
[0097] 3)將處理后的硅片置入含5 %戊二醛的磷酸鹽緩沖液(PBS )，浸泡一段時間后，使 用去離子水清洗干凈，氮氣吹干。
[0098] 4)使用蛋白打印機將前列腺癌特異抗體和參考蛋白打印在光盤表面。蛋白打印完 成后，表面使用硼氫化鈉溶液(NaBH4)清洗。
[0099] 5)最后在處理后的硅片表面涂覆一層酪蛋白溶液，隨后依次使用50mmol/L的檸檬 酸溶液(pH 6.0)、PBST溶液以及去離子水清洗，并以1 OOOrpm甩干。
[0100] 3、檢測前列腺腫瘤細胞
[0101] 1)提取病人lmL血液，離心得到上層血清樣本。
[0102] 2)固定生物光盤的機械轉(zhuǎn)臺以500rpm速度旋轉(zhuǎn)，穩(wěn)定后，所述激光器發(fā)射488nm的 激光以30度的角度經(jīng)過聚焦透鏡聚焦到旋轉(zhuǎn)的生物光盤表面，電腦控制器控制旋轉(zhuǎn)掃描系 統(tǒng)以20WI1的精度對整張生物光盤進行預(yù)掃描記錄生物光盤表面的原始高度信息，發(fā)送一個 反饋信號給數(shù)據(jù)采集卡。
[0103] 3)將血清樣本滴到指定的檢測區(qū)域，并孵育20min，隨后使用去離子水清洗并甩 干。
[0104] 4)按照步驟2)在對滴加血清樣本的生物光盤表明進行掃描，記錄數(shù)據(jù)，發(fā)送一個 反饋信號給數(shù)據(jù)采集卡。
[0105] 5)數(shù)據(jù)采集卡將光電倍增管提供的電壓信號轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號，并進行分析，計算 蛋白的高度和濃度，結(jié)果見圖3。
[0106] 其中蛋白的高度可以由下述計算公式反推出：
[0108]血清前列腺特異抗原(PSA)正常值一般<4ng/mL，而當(dāng)前列腺癌發(fā)生時PSA>10ng/ mL。由圖3結(jié)果可見，本發(fā)明所述檢測方法這一檢測區(qū)間內(nèi)有著明顯的區(qū)分度，檢測靈敏度 高，適用于前列腺癌細胞的檢測。
【主權(quán)項】
1. 一種生物光盤，其特征在于，依次由基底、透明介質(zhì)層和生物分子銜接層組成。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物光盤，其特征在于，所述基底為硅片，所述透明介質(zhì)層為 Si〇2薄膜或Si3N4薄膜。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物光盤，其特征在于，所述生物分子經(jīng)抗原抗體反應(yīng)固定在 生物光盤上。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物光盤，其特征在于，所述生物光盤被分成96個超疏水性的 區(qū)域。5. 權(quán)利要求1所述生物光盤的制備方法，其特征在于，基底蒸鍍透明介質(zhì)后活化修飾。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述活化修飾為依次對蒸鍍透明介質(zhì) 后的基底表面進行羥基化、氨基硅烷化、醛基化、結(jié)合生物分子的抗體。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述活化修飾具體包括以下步驟： 1) 、將蒸鍍透明介質(zhì)后的基底置于食人魚洗液中浸泡25min~35min; 2) 、3_氨丙基三乙氧基硅烷活化劑浸泡5~15min; 3) 、含5%戊二醛的磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡； 4 )、將生物分子的抗體結(jié)合在生物光盤表面。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述活化修飾還包括硼氫化鈉溶液 (NaBH4)清洗的步驟。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的制備方法，其特征在于，所述活化修飾還包括涂覆酪蛋白 溶液后清洗的步驟。10. 權(quán)利要求1-4任意一項所述生物光盤在檢測生物分子中的應(yīng)用。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于，所述生物分子為腫瘤細胞、病毒、蛋白或 基因。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤細胞為前列腺癌細胞、肺癌細 胞、鼻咽癌細胞、食管癌細胞、胃癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞、宮頸癌細胞； 所述病毒可以為SAS病毒、禽流感病毒。13. -種旋轉(zhuǎn)掃描系統(tǒng)，其特征在于，包括激光器、聚焦透鏡、權(quán)利要求1-4任意一項所 述的生物光盤、固定生物光盤的機械轉(zhuǎn)臺、反射鏡、光電倍增管、電腦控制器;所述電腦控制 器控制固定生物光盤的機械轉(zhuǎn)臺以固定角速度旋轉(zhuǎn)，所述激光器發(fā)射的激光經(jīng)過聚焦透鏡 聚焦到旋轉(zhuǎn)的生物光盤上，經(jīng)過生物光盤表面和反射鏡反射后反射信號被所述光電倍增管 收集反饋給所述電腦控制器實時測量生物光盤表面的反射率。14. 一種檢測生物分子的方法，其特征在于，包括如下步驟： I、 采用權(quán)利要求13所述的旋轉(zhuǎn)掃描系統(tǒng)對權(quán)利要求1-4任意一項所述的生物光盤表面 進行掃描，記錄生物光盤表面的原始數(shù)據(jù)； II、 將待測樣本滴加到生物光盤的檢測區(qū)域，孵育20min，再次對生物光盤表面進行掃 描，記錄數(shù)據(jù)； III、 比較分析兩次掃描數(shù)據(jù)獲得生物光盤表面生物分子的厚度，根據(jù)已知樣本的參考 區(qū)間獲得待測樣本中生物分子的含量。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述掃描具體為所述固定生物光盤的機 械轉(zhuǎn)臺以500rpm速度旋轉(zhuǎn)，所述激光器發(fā)射488nm的激光以30度的角度經(jīng)過聚焦透鏡聚焦 到旋轉(zhuǎn)的生物光盤表面，電腦控制器控制旋轉(zhuǎn)掃描系統(tǒng)以20μπι的精度掃描整張生物光盤。
【文檔編號】G01N33/543GK105891466SQ201610270214
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月26日
【發(fā)明人】秦金, 郭松坡, 王亮, 丁立, 李晨暉
【申請人】中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)