一種固定酶載體材料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種固定酶載體材料及其制備方法，具體涉及一種硅膠表面經(jīng)過兩親性物質(zhì)修飾的載體材料，包括硅膠材料和修飾形成于所述硅膠材料表面的兩親性物質(zhì)；其制備方法為將硅膠粉末加入甲基磺酸水溶液中進(jìn)行活化，然后加入乙醇水溶液和3?(甲基丙烯酸酰氧)丙基三甲氧基硅烷制備成MPS?硅膠，最后加入可聚合溶劑水溶液制成表面形成兩親性物質(zhì)的固定酶載體材料。本發(fā)明的固定化酶載體提高了酶的操作穩(wěn)定性、提高載體材料、酶與底物的相適應(yīng)性，且其制備工藝較簡(jiǎn)單、成本低容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。
【專利說(shuō)明】
一種固定酶載體材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及催化材料與化學(xué)合成技術(shù)，具體涉及一種固定酶載體材料及其制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 酶作為具有特殊催化功能的生物催化劑，由于其催化高效性、高專一性及反應(yīng)條 件溫和等性質(zhì)被廣泛用于生物工程、食品工業(yè)、醫(yī)藥、精細(xì)化學(xué)工業(yè)等領(lǐng)域。脂肪酶是各種 生物酶反應(yīng)包括:對(duì)映選擇性水解和酯化、手性拆分、對(duì)映體單體制備及大分子聚合反應(yīng) 等，普遍存在的酶。但是游離酶在水溶液中很不穩(wěn)定，重復(fù)使用性差，同時(shí)對(duì)熱、高離子濃 度、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及部分有機(jī)溶劑等均不夠穩(wěn)定，容易降低甚至喪失其催化能力。另外，酶促反 應(yīng)后酶與底物和產(chǎn)物不易分離，產(chǎn)物中或多或少有酶的殘留，導(dǎo)致產(chǎn)品純度不高及酶回收 重復(fù)使用性變差。游離酶的這些不足極大制約了其實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。為了解決酶存在的 問題，人們將酶固定于載體材料中。目前固定酶的方法主要有物理法(吸附和包埋)和化學(xué) 法(交聯(lián)和共價(jià)結(jié)合）。共價(jià)結(jié)合主要是通過載體的活性官能團(tuán)與酶分子中的部分官能團(tuán)形 成共價(jià)鍵，由于這種共價(jià)結(jié)合力度強(qiáng)，從而大大提高了酶的穩(wěn)定性，但這種共價(jià)結(jié)合的有可 能會(huì)對(duì)造成酶變形而導(dǎo)致酶活性降低。包埋主要是將酶捕獲到聚合物內(nèi)部空隙中，但這種 孔內(nèi)部結(jié)構(gòu)易使傳質(zhì)受到限制;吸附主要是通過氫鍵、靜電吸附、范德華力等微弱的分子間 作用力將酶吸附到載體表面，但吸附力弱，酶與載體易脫落，污染產(chǎn)物，不利于回收。然而吸 附法固定酶操作簡(jiǎn)單且成本低，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，是目前使用較多的一種固定酶方法。
[0003] 目前，吸附法固定酶的載體材料主要是采用無(wú)機(jī)材料如:介孔碳材料、磁性Fe203/ Fe304、水滑石、Ti02、介孔二氧化硅及硅膠、聚合物材料、多糖、苯乙烯樹脂、聚羥基丁酸戊 酯等來(lái)固定酶。其中多孔結(jié)構(gòu)材料包括介孔碳材料和介孔娃氧化物微球，但介孔材料如氧 化石墨烯、碳納米管、有序介孔碳CMK-3等價(jià)格高昂，不利于產(chǎn)業(yè)化。目前研究硅膠及其相關(guān) 的報(bào)道有很多，介孔硅材料由于其如具有較高的比表面積、孔隙率、表面具有較活波官能團(tuán) 而被廣泛研究。但是介孔硅材料制備工藝復(fù)雜繁瑣，且制備成本較高，不利于固定酶的大規(guī) 模生產(chǎn)及商業(yè)化。相比之下，硅膠材料廉價(jià)易得，表面的多羥基官能團(tuán)能夠?qū)γ高M(jìn)行吸附且 易進(jìn)行相關(guān)的改性修飾使其功能化，為酶的固定提供了很好的條件，同時(shí)制備工藝簡(jiǎn)單，容 易大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。但是，現(xiàn)有的硅膠材料的吸附固定的穩(wěn)定性較低，且不利于提高酶的活 性。
[0004]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)不足，提出一種固定酶載體材料，本發(fā)明的固定 酶載體材料利用硅膠表面的多羥基部分吸附酶，同時(shí)采用兩親性物質(zhì)對(duì)表面進(jìn)行修飾改性 靜電吸附酶，提高酶的操作穩(wěn)定性;同時(shí)使得硅膠表面具有兩親性，能夠促使固定酶對(duì)底物 環(huán)境相適應(yīng)，提供酶促反應(yīng)所需要的界面環(huán)境，從而提高酶的催化效率。而且，本發(fā)明還提 供一種固定酶載體材料的制備方法。
[0006] 為達(dá)到上述技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案一方面提供一種固定酶載體材料，包括 硅膠材料和修飾形成于所述硅膠材料表面的兩親性物質(zhì)。
[0007] 優(yōu)選的，所述兩親性物質(zhì)為聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、聚氧乙烯或聚乙烯 醇。
[0008] 本發(fā)明另一方面還提供一種固定酶載體材料的制備方法，包括如下步驟， a、 將硅膠粉末置于質(zhì)量百分比為5%的甲基磺酸水溶液中，在102°C下攪拌4小時(shí)后過 濾，將過濾得到的固體通過去離子水進(jìn)行多次清洗后真空干燥24小時(shí)，即得活化的硅膠； b、 在活化后的硅膠中加入乙醇水溶液和3-(甲基丙烯酸酰氧)丙基三甲氧基硅烷，并在 氮?dú)鈿夥铡?0°C的條件下反應(yīng)24小時(shí)后過濾，過濾后的固體顆粒通過乙醇清洗多次，真空干 燥即得表面活化的MPS-硅膠； c、 將步驟b所得的MPS-硅膠中加入可聚合溶劑水溶液，并在氮?dú)鈼l件下充分反應(yīng)，過 濾、干燥即得表面形成兩親性物質(zhì)的固定酶載體材料。
[0009] 優(yōu)選的，所述兩親性物質(zhì)為PVP，所述可聚合溶劑水溶液由N-乙烯基吡咯烷酮、過 硫酸銨、三乙胺加入去離子水中形成。
[0010] 優(yōu)選的，所述步驟C還包括在氮?dú)鈼l件下攪拌1小時(shí)后，升高溫度至70°C繼續(xù)攪拌8 小時(shí)，過濾、干燥即得硅膠表面接枝聚合有PVP的固定化酶載體。
[0011] 優(yōu)選的，所述步驟c包括將MPS-硅膠分散于乙二醇和氫氧化鈉的混合溶液中，在氮 氣條件下升溫至120°c，滴加環(huán)氧乙烷反應(yīng)30分鐘，冷卻、過濾、洗滌、干燥即得硅膠表面聚 合有ΡΕ0的固定化酶載體。
[0012] 優(yōu)選的，所述兩親性物質(zhì)為聚乙烯醇。
[0013] 優(yōu)選的，所述可聚合溶劑水溶液中N-乙烯基吡咯烷酮、過硫酸銨、三乙胺的質(zhì)量百 分比分別為15%、2%、3%。
[0014] 優(yōu)選的，所述步驟B中活化后的硅膠中加入的乙醇水溶液中乙醇與水的體積比為 6:1〇
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果包括： 1、 該固定酶載體材料，具有較大比表面積，與酶結(jié)合率較高且能夠?qū)⒚咐喂痰墓潭ㄔ?載體表面，提高了酶的操作穩(wěn)定性； 2、 該固定酶載體材料，其兩親性能夠?yàn)槊复俜磻?yīng)提供良好的催化界面環(huán)境，提高載體 材料、酶與底物的相適應(yīng)性。
[0016] 3、該固體酶載體材料，制備工藝較簡(jiǎn)單，成本低容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1是本發(fā)明的硅膠-PVP載體固定CRL酶與游離CRL酶的熱穩(wěn)定性曲線對(duì)比圖； 圖2是本發(fā)明的硅膠-PVP載體固定CRL酶的重復(fù)實(shí)用性曲線； 圖3是本發(fā)明的硅膠-PVP載體固定CRL酶的掃描電鏡圖。
[0018]
【具體實(shí)施方式】
[0019] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0020] 實(shí)施例1 取7.5ml的甲基磺酸配成質(zhì)量百分比為5%的水溶液，將30g的硅膠粉末分散在甲基磺酸 水溶液中，在l〇2°C下攪拌4h，過濾后用去離子水洗滌多次，然后再真空干燥24h，得到活化 后的硅膠。
[0021] 將上述活化后的硅膠中加入140ml乙醇水溶液，然后再加入15.01g3-(甲基丙烯酸 酰氧）丙基三甲氧基硅烷，氮?dú)鈿夥障拢?0°C反應(yīng)24h;反應(yīng)結(jié)束后過濾，并用乙醇反復(fù)洗滌 去除多余MPS，真空干燥得到表面活化的MPS-硅膠;其中，本實(shí)施例中采用的MPS為3-(甲基 丙烯酸酰氧)丙基三甲氧基硅烷的簡(jiǎn)稱。
[0022] 將21mgN-乙烯基吡咯烷酮、2.8mg過硫酸銨、4.2mg三乙胺分散于140ml去離子水 中，將上述制備的MPS-硅膠顆粒分散其中，反復(fù)充放氮?dú)夂?，在氮?dú)鈿夥障聰嚢鑜h。然后將 溫度升至70 °C攪拌8h，使得N-乙烯基吡咯烷酮在MPS-硅膠表面進(jìn)行接枝聚合，并形成表面 具有聚乙烯吡咯烷酮的固定化酶載體;為了便于后續(xù)描述，實(shí)施例中N-乙烯基吡咯烷酮和 聚乙烯吡咯烷酮分別采用簡(jiǎn)稱，具體為N-乙烯基吡咯烷酮的簡(jiǎn)稱是NVP、聚乙烯吡咯烷酮的 簡(jiǎn)稱為PVP，相對(duì)應(yīng)的，上述制備的固定酶載體為硅膠-PVP載體。
[0023] 將1.17g CRL分散于50ml的0.1M、PH=7.0的PBS緩沖溶液中，然后加入0.5g上述制 備的硅膠-PVP載體材料充分分散，將硅膠-PVP載體與酶的混合物置于37 °C的搖床中，在 160rpm的搖速下反應(yīng)3小時(shí)，過濾，并采用去離子水洗滌5次后，離心凍干干燥后即得固定化 酶，具體為硅膠-PVP載體固定CRL，將上述固定化酶保存在4°C環(huán)境下。其中，本實(shí)施例中的 CRL為皺褶假絲酵母脂肪酶的簡(jiǎn)稱。
[0024]固定化酶的熱穩(wěn)定性、重復(fù)使用率結(jié)果如附圖1、圖2所示。將制備的固定化酶通過 PNPP顯色法測(cè)定催化活力，結(jié)果顯示:在固定化酶重復(fù)多次使用后，固定化酶催化活性保持 穩(wěn)定;在50°C下，隨反應(yīng)時(shí)間的增加，固定化酶的相對(duì)活性較游離酶穩(wěn)定，這說(shuō)明酶固定在 本發(fā)明的載體材料上，其熱穩(wěn)定性有所提高。
[0025] 實(shí)施例2 取7.5ml的甲基磺酸配成質(zhì)量百分比為5%的水溶液，將30g的硅膠粉末分散在甲基磺酸 水溶液中，在l〇2°C下攪拌4h，過濾后用去離子水洗滌多次，然后再真空干燥24h，得到活化 后的硅膠。
[0026] 將上述活化后的硅膠中加入140ml乙醇水溶液，然后再加入15. OlgMPS，氮?dú)鈿夥?下，50°C反應(yīng)24h;反應(yīng)結(jié)束后過濾，并用乙醇反復(fù)洗滌去除多余MPS，真空干燥得到表面活 化的MPS-硅膠;其中，本實(shí)施例中采用的MPS為3-(甲基丙烯酸酰氧)丙基三甲氧基硅烷的簡(jiǎn) 稱。
[0027]稱取起始劑乙二醇和NaOH放入500ml反應(yīng)釜內(nèi)，將上述MPS-硅膠顆粒分散其中，然 后用氮?dú)庵脫Q3次后，升溫至115°C，抽真空脫水lmin，然后向反應(yīng)釜內(nèi)充氮?dú)?，?dāng)溫度升至 120°C時(shí)，緩慢滴加適量還氧乙燒，并保證溫度不能超過140°C。反應(yīng)30min后，通入冷卻水使 之冷卻，過濾、洗滌、干燥，制得硅膠-ΡΕ0材料。其中，本實(shí)施例中ΡΕ0為聚氧乙烯的簡(jiǎn)稱。 [0028] 將1.17g CRL分散于50ml的0.1M、PH=7.0的PBS緩沖溶液中，然后加入0.5g上述制 備的硅膠-PEO載體材料充分分散，將硅膠-PEO載體與酶的混合物置于37 °C的搖床中，在 160rpm的搖速下反應(yīng)3小時(shí)，過濾，并采用去離子水洗滌5次后，離心凍干干燥后即得固定化 酶，具體為硅膠-PE0載體固定CRL，將上述固定化酶保存在4°C環(huán)境下。其中，本實(shí)施例中的 CRL為皺褶假絲酵母脂肪酶的簡(jiǎn)稱。
[0029] 實(shí)施例3 根據(jù)實(shí)施例1制備硅膠-PVP載體。
[0030] 將l.OgPPL分散于50ml的0.1M、PH=7.0的PBS緩沖溶液中，然后加入0.5g上述制備 的硅膠-PVP載體材料充分分散，將硅膠-PVP載體與酶的混合物置于37 °C的搖床中，在 160rpm的搖速下反應(yīng)3小時(shí)，過濾，并采用去離子水洗滌5次后，離心凍干干燥后即得固定化 酶，具體為硅膠-PVP載體固定PPL，將上述固定化酶保存在4°C環(huán)境下。其中，本實(shí)施例中的 PPL為豬胰脂肪酶的簡(jiǎn)稱。
[0031] 測(cè)定實(shí)施例1~3所得的固定化酶的催化活性、熱穩(wěn)定性和重復(fù)使用率，同時(shí)測(cè)定相 對(duì)應(yīng)的CRL和PPL的游離酶的催化活性、熱穩(wěn)定性和重復(fù)使用率，具體如表1所示： 表1
從表1可見，在溫度為50°C，反應(yīng)時(shí)間為240min時(shí)，將游離酶與其相對(duì)應(yīng)的固定化酶比 較，固定化酶的活性得到明顯提升，且對(duì)應(yīng)固定酶熱穩(wěn)定性值均大于游離酶，這說(shuō)明固定化 酶的熱穩(wěn)定性得到了很大的提升。
[0032] 從圖2可見，隨著重復(fù)使用次數(shù)的增加，固定化酶的活性趨于穩(wěn)定。
[0033]由圖3可知，從固定化酶硅膠-PVP0CRL固定酶的電鏡圖可以看出，CRL成功吸附在 載體材料表面。
[0034]本發(fā)明所提出的利用兩親性物質(zhì)修飾硅膠表面，一方面通過硅膠表面的羥基物理 吸附酶;另一方面通過表面的兩親性物質(zhì)靜電吸附酶;進(jìn)一步，表面兩親性物質(zhì)能與底物良 好接觸，從而為酶的催化提供了合適的反應(yīng)界面環(huán)境。
[0035]以上所述本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何根據(jù) 本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思所做出的各種其他相應(yīng)的改變與變形，均應(yīng)包含在本發(fā)明權(quán)利要求的保 護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種固定酶載體材料，其特征在于，包括硅膠材料和修飾形成于所述硅膠材料表面 的兩親性物質(zhì)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定酶載體材料，其特征在于，所述兩親性物質(zhì)為聚乙烯吡咯 烷酮、聚氧乙烯或聚乙烯醇。3. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定酶載體材料的制備方法，其特征在于，包括如下步 驟， a、 將硅膠粉末置于質(zhì)量百分比為5%的甲基磺酸水溶液中，在102°C下攪拌4小時(shí)后過 濾，將過濾得到的固體通過去離子水進(jìn)行多次清洗后真空干燥24小時(shí)，即得活化的硅膠； b、 在活化后的硅膠中加入乙醇水溶液和3-(甲基丙烯酸酰氧）丙基三甲氧基硅烷，并在 氮?dú)鈿夥铡?0°C的條件下反應(yīng)24小時(shí)后過濾，過濾后的固體顆粒通過乙醇清洗多次，真空干 燥即得表面活化的MPS-硅膠； c、 將步驟b所得的MPS-硅膠中加入可聚合溶劑水溶液，并在氮?dú)鈼l件下充分反應(yīng)，過 濾、干燥即得表面形成兩親性物質(zhì)的固定酶載體材料。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述兩親性物質(zhì)為PVP，所述可聚合溶 劑水溶液由N-乙烯基吡咯烷酮、過硫酸銨、三乙胺加入去離子水中形成。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟C還包括在氮?dú)鈼l件下攪拌1 小時(shí)后，升高溫度至70 °C繼續(xù)攪拌8小時(shí)，過濾、干燥即得硅膠表面接枝聚合有PVP的固定化 酶載體。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟C包括將MPS-硅膠分散于乙 二醇和氫氧化鈉的混合溶液中，在氮?dú)鈼l件下升溫至120°C，滴加環(huán)氧乙烷反應(yīng)30分鐘，冷 卻、過濾、洗滌、干燥即得硅膠表面聚合有PEO的固定化酶載體。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述兩親性物質(zhì)為聚乙烯醇。8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述可聚合溶劑水溶液中N-乙烯基吡 咯烷酮、過硫酸銨、三乙胺的質(zhì)量百分比分別為15%、2%、3%。9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟B中活化后的硅膠中加入的 乙醇水溶液中乙醇與水的體積比為6:1。
【文檔編號(hào)】C08G83/00GK105950603SQ201610322517
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月16日
【發(fā)明人】黃鳳洪, 時(shí)杰, 張珊, 鄭明明, 鄧乾春
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所