Crk19蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物莖葉生長中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種CRK19蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物莖葉生長中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的應(yīng)用具體為由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(即CRK19蛋白)在如下a1)或a2)中的應(yīng)用：a1)抑制植物莖葉徒長；a2)選育莖葉徒長受到抑制的植物品種。CRK19基因過表達(dá)植株，相比野生型對照植株，在ABA抑制的莖葉徒長方面表現(xiàn)更加敏感。本發(fā)明通過調(diào)節(jié)CRK19的表達(dá)水平來抑制植物莖葉徒長具有重要意義，通過基因工程手段獲得CRK19基因高表達(dá)、莖葉徒長受到抑制的轉(zhuǎn)基因作物。本發(fā)明符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的目的，可以節(jié)約養(yǎng)分、減少化肥和農(nóng)藥的噴施，對于培育綠色無公害新品種提供了可能性，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】
CRK19蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物莖葉生長中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種C服19蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物莖葉生 長中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 果樹、水稻、蔬菜和花弁等植物常因雨水過多或者光照時間短等因素而出現(xiàn)莖葉 徒長現(xiàn)象。果樹徒長除了天氣因素外，其品種、苗木本身容易出現(xiàn)莖葉徒長，如梨樹、桃樹 等。水稻徒長又稱惡苗病，導(dǎo)致水稻株高變長、莖纖弱、葉片顏色變淡，嚴(yán)重時導(dǎo)致抽穗前死 亡或者穗小粒少，產(chǎn)量損失可達(dá)30% W上。因此，抑制莖葉徒長在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有重大的實 際意義。目前控制莖葉徒長的一般手段是通過改善植物栽培條件、加強(qiáng)田間管理W及噴施 農(nóng)藥等，但是運些方法具有工作量大、污染環(huán)境等特點。因此，培育莖葉徒長受到抑制的新 品種變得越發(fā)重要，而且隨著近年來分子生物學(xué)和植物激素作用機(jī)制研究的不斷深入，通 過基因工程向植物中導(dǎo)入外源基因來調(diào)控植物的生長發(fā)育已經(jīng)成為現(xiàn)實。
[0003] 脫落酸(Abscisic AcicUABA)是傳統(tǒng)的五大植物激素之一，因其具有促進(jìn)葉片和 果實脫落而得名。在植物體內(nèi)合成ABA的主要組織器官是種子、根尖、果實和花器官;在細(xì)胞 內(nèi)，ABA的合成起始于質(zhì)體，通過0-類胡蘿h素(C40)裂解而成的。ABA有順式和反式兩種旋光 異構(gòu)體，在植物體內(nèi)有活性并且起主要作用的是S-( + )-ABA"ABA可W通過調(diào)控氣孔運動W 及抗性物質(zhì)的積累來增強(qiáng)植物對非生物脅迫的抗性。在植物的生長發(fā)育過程中，ABA具有抑 審剛子萌發(fā)、抑制幼苗生長、抑制主根發(fā)育及促進(jìn)葉片衰老和脫落等作用。近年來，ABA信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制有了長足的進(jìn)步，許多參與到ABA信號通路里的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子被鑒定出來，包括ABA 受體W及ABA響應(yīng)基因。運些ABA信號通路調(diào)節(jié)子的發(fā)現(xiàn)有助于人們更深的理解ABA信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)機(jī)制，并且有助于將其應(yīng)用與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐。
[0004] 類受體蛋白激酶RLKs(Rec邱tor-l化e kinases)已被報道廣泛參與調(diào)控植物的生 長發(fā)育和響應(yīng)外界環(huán)境脅迫，包括調(diào)控植物育性、根系生長、莖的生長、細(xì)胞分化、激素信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)W及抗病過程等。典型的類受體蛋白激酶由胞外結(jié)構(gòu)域化xtracellular domain)、單 次跨膜結(jié)構(gòu)域（Transmembrane domain)和胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域（切toplasmic kinase domain) =部分組成。胞外結(jié)構(gòu)域的功能一般是感受外界信號或刺激，并將信號傳遞給胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，W 使細(xì)胞對刺激做出反應(yīng);單次跨膜結(jié)構(gòu)域起到傳遞胞外信號和支持固定的作用;胞內(nèi)激酶 結(jié)構(gòu)域的功能主要是憐酸化下游底物，進(jìn)而起到傳遞信號的作用。富含半脫氨酸的類受體 蛋白激酶C服S(切steine-rich rec邱tor-Uke protein kinases)是I?LKs的一個亞家族， 其胞外區(qū)域有保守的富含半脫氨酸的C-8X-C-2X-C結(jié)構(gòu)域，運種結(jié)構(gòu)域的功能可能與蛋白 之間的互作有關(guān)系。C服S的功能也逐漸被闡釋，已有研究表明C服S參與植物對生物脅迫和 非生物脅迫的響應(yīng)過程。C服19基因在擬南芥tair網(wǎng)站上的基因號為AT4G23270化ttps://www.arabidopsis.org/)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種CRK19蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物莖葉生長中的應(yīng) 用。所述莖葉徒長即農(nóng)作物、果樹或者花弁園藝植物莖葉發(fā)育過望并且導(dǎo)致±壤養(yǎng)分過度 浪費W及產(chǎn)量降低的現(xiàn)象。
[0006] 本發(fā)明所提供的應(yīng)用，具體為如下A或B:
[0007] A.由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(C服19蛋白）在如下al)-a2) 任一中的應(yīng)用：
[000引 al)抑制植物莖葉徒長；
[0009] a2)選育莖葉徒長受到抑制的植物品種。
[0010] B.由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)（C服19蛋白）的編碼基因在 如下al)-a2)任一中的應(yīng)用：
[00川 al)抑制植物莖葉徒長；
[0012] a2)選育莖葉徒長受到抑制的植物品種。
[OOU]在本發(fā)明中，從上曰2)中的所述選育莖葉徒長受到抑制的植物品種的方法，具體可 包括將所述CRK19蛋白表達(dá)量較高的植株作為親本進(jìn)行雜交的步驟。
[0014] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育莖葉徒長受到抑制的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0015] 本發(fā)明所提供的培育莖葉徒長受到抑制的轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可包括如下步 驟:向受體植物中導(dǎo)入由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(CRK19蛋白）的編 碼基因，得到轉(zhuǎn)基因植物;所述轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相比莖葉徒長受到抑制。
[0016] 在上述應(yīng)用或方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的 編碼基因（即C服19基因）是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
[0017] 1)編碼序列為序列表中序列2自5'末端第31至1968位核巧酸所示的DNA分子；
[001引 2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0019] 3)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0020] 4)在嚴(yán)格條件下與1)-3)任一所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列3所示 的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0021] 5)與1)-4)任一限定的DNA分子具有90% W上同源性且編碼由序列表中序列3所示 的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0022] 上述嚴(yán)格條件可為用6 X SSC，0.5 % SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2 X SSC， 0.1 % SDS和 1 X SSC，0.1 % SDS各洗膜一次。
[0023] 其中，序列1由2823個核巧酸組成，為所述CRK19基因在擬南芥基因組中序列，其中 第 797-887、1026-1116、1239-1528、1740-1822、2061-2143 及 2298-2383位均為內(nèi)含子序列； 序列2由2099個核巧酸組成，為所述C服19基因的cDNA序列，其中第31-1968位為編碼序列 (0RF);序列1和序列2均編碼序列表中序列3所示的蛋白質(zhì)，序列袖645個氨基酸殘基組成。
[0024] 在所述方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基 因是通過含有所述蛋白質(zhì)的編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述受體植物中的。
[0025] 所述重組表達(dá)載體可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng) 桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pCAMBIA-1 300-22 l、pGreen0029、 pCAMBIA3301、pBI121、地inl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表達(dá)載體。 所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺巧酸信號和任何其它 參與mRNA加工或基因表達(dá)的DM片段。所述聚腺巧酸信號可引導(dǎo)聚腺巧酸加入到mRNA前體 的3'端。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核巧酸前可加上任何一種增強(qiáng) 型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子，例如花挪菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、泛素基因 Ubiquitin啟動子(P化i)、脅迫誘導(dǎo)型啟動子rd29A等，它們可單獨使用或與其它的植物啟 動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯 增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，運些增強(qiáng)子區(qū)域可W是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但 必需與編碼序列的閱讀框相同，W保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密 碼子的來源是廣泛的，可W是天然的，也可W是合成的。翻譯起始區(qū)域可W來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū) 域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用重組表達(dá)載 體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具 有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。也可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接 W逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0026] 在本發(fā)明中，所述重組表達(dá)載體中啟動所述蛋白質(zhì)的編碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為 35S啟動子。
[0027] 更為具體的，所述重組表達(dá)載體為將所述CRK19基因插入pCAMBIA-1300-221載體 的多克隆位點Sma I與Kpn I之間后得到的重組質(zhì)粒。
[0028] 在上述方法中，將攜帶有所述C服19基因的所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述受體植物， 具體可為:通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌 介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。
[0029] 本發(fā)明的再一個目的是提供一種抑制植物莖葉徒長的方法。
[0030] 本發(fā)明所提供的抑制植物莖葉徒長的方法，具體可包括如下步驟：
[0031] (1)向受體植物中導(dǎo)入由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼 基因，得到轉(zhuǎn)基因植物；
[0032] (2)將所述轉(zhuǎn)基因植物的種子播種于含有ABA的基質(zhì)中或者向所述轉(zhuǎn)基因植物噴 施外源ABA。
[0033] 在步驟（2)中，所述ABA在所述基質(zhì)中的含量為0.扣M。所述基質(zhì)具體可為培養(yǎng)基 (如MS培養(yǎng)基)或±壤。
[0034] 在所述方法中，所述抑制植物莖葉徒長具體體現(xiàn)為:在0.5咖ABA條件下，與所述 受體植物相比，所述轉(zhuǎn)基因植物的子葉轉(zhuǎn)綠受到抑制(所述轉(zhuǎn)基因植物的子葉轉(zhuǎn)綠率顯著 低于所述受體植物）。
[0035] 另外，由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或所述蛋白質(zhì)的編碼基 因在如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0036] bl)降低植物對ABA的耐受性；
[0037] b2)選育對ABA耐受性降低的植物品種。
[0038] 在上述應(yīng)用或方法中，所述植物即可為雙子葉植物，也可為單子葉植物。
[0039] 進(jìn)一步，所述雙子葉植物可為十字花科植物。在本發(fā)明的一個實施例中，所述植物 具體為擬南芥，更加具體為擬南芥野生型(Col-0生態(tài)型）。
[0040] 在本發(fā)明中，W上所有所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)均 可替換為序列3所示蛋白質(zhì)與標(biāo)簽蛋白所形成的融合蛋白，具體如在pCAMBIA-1300-221載 體的酶切位點Sma I和Kpn I之間插入序列2的第31-1965位所示DM片段后所得重組質(zhì)粒表 達(dá)得到的融合蛋白。
[0041] 本發(fā)明研究結(jié)果表明C服19蛋白正調(diào)節(jié)ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。實驗證明，相比野生型對照 植株，C服19基因過表達(dá)植株的莖葉W及根系生長受到明顯抑制，因此，可W通過基因工程 的方法獲得C服19基因高表達(dá)、莖葉徒長受到抑制的轉(zhuǎn)基因作物。本發(fā)明符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā) 展的目的，可W節(jié)約養(yǎng)分、減少化肥和農(nóng)藥的噴施，對于培育綠色無公害新品種提供了可能 性，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0042] 圖1為實時巧光定量PCR檢測過表達(dá)材料中CRK19mRNA的表達(dá)情況。
[0043] 圖2為ABA對C服19過表達(dá)植株幼苗生長的影響分析結(jié)果。A表示野生型Col-0 W及 C服19基因高表達(dá)株系C190E-巧日C190E-2在MS平板上培養(yǎng)10天后的子葉轉(zhuǎn)綠情況。B表示野 生型Co^OW及C服19基因高表達(dá)株系C190E-1和C190E-2在含有0.5測ABA的MS平板上培養(yǎng) 10天后的子葉轉(zhuǎn)綠情況。C是對A和B的統(tǒng)計結(jié)果。D表示野生型Co ^0和轉(zhuǎn)空載體株系GFP-0E 在MS平板(左圖）和含有0.5咖ABA的MS平板(右圖）上培養(yǎng)10天后的子葉轉(zhuǎn)綠情況。E是對D 的統(tǒng)計結(jié)果。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)，不同字母代表同一 ABA濃度下各處理之間差異顯著 (P<0.05)。
【具體實施方式】
[0044] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0045] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0046] 下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。W下實施例中的定量試 驗，均設(shè)置=次重復(fù)試驗，結(jié)果取平均值。
[0047] pCAMBIA-1300-221 載體：由清華大學(xué)提供(記載文獻(xiàn):Lijing Liu，Yiyue Zhang, Sanyuan Tang，et al.An efficient system to detect protein ubiquitination by agroinfiltration in Nicotiana benthamiana.The Plant Journal，2010(61):893- 903.)。在pCAMBIA-1300-221載體中，位于多克隆位點(MCS)上游的啟動子為35S啟動子。在 pCAMBIA-1300-221載體中，含有GFP基因?？凇擦?8^-1300-221載體相關(guān)信息：片古古口：// www.cambia.org/daisy/cambia/materials/vectors/585.htmlo
[004引擬南芥野生型（Col-0生態(tài)型）：擬南芥野生型種子（Arabidopsis thaliana， ecotype Columbia-0)，為擬南芥生物研究中屯、（ABRC，https:z7www.arabidopsis.org/)的 產(chǎn)品。
[0049] 根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens):根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101，由清華大學(xué) 提供（記載文南犬：R.Berres，L.otten，B.Tinland et al.Transformation of vitis tissue by different strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T_6b gene.Plant Cell R邱orts,1992(11):192-195.)0
[0050] 大腸桿菌化scherichia coli)菌株DH5a(DE3)感受態(tài)：為全式金生物有限公司產(chǎn) 品D
[0051] 實施例UCRK19轉(zhuǎn)基因植物的獲得及鑒定
[0化2] 本實施例中所設(shè)及的C服19基因來源于擬南芥(Arabidopsis thaliana)，其在擬 南芥基因組中的序列如序列表中序列1所示，序列1由2823個核巧酸組成，為所述C服19基因 在擬南芥基因組中序列，其中第 797-887、1026-1116、1239-1528、1740-1822、2061-2143 及 2298-2383位均為內(nèi)含子序列；序列2由2099個核巧酸組成，為所述C服19基因的cDNA序列， 其中第31-1968位為編碼序列(0RF);序列1和序列2均編碼序列表中序列3所示的蛋白質(zhì)，序 列3由645個氨基酸殘基組成。
[0化3] -、重組表達(dá)載體PCAMBIA-1300-221-CRK19的構(gòu)建
[0054]提取擬南芥野生型(Col生態(tài)型）的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA。^所得cDNA為模板， 通過引物1與引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后對其產(chǎn)物進(jìn)行純化，表明擴(kuò)增得到約2000bp片 段，測序表明，該片段具有自序列表中的序列2自5'端起第31-1965位核巧酸序列。
[0化5]引物1:5 ' -TCCCCCGGGATGTCTTCTCTGATCTCTTTC-3 '（下劃線部分為Sma I的識別位 點，該序列的第10-30位為序列2的第31 -51位）；
[0化6]引物2:5 ' -GGGGTACCACGAGGAGTTACACGAGTAATG-3 '（下劃線部分為Kpn I的識別位 點，該序列的第9-30位為序列2的第1944-1965位的反向互補序列）。
[0057]用限制性內(nèi)切酶Sma I和Kpn I雙酶切W上所得PCR產(chǎn)物，膠回收酶切片段，與經(jīng)過 同樣雙酶切的pCAMBIA-1300-221載體骨架相連，得到重組質(zhì)粒。將所述重組質(zhì)粒送樣測序， 將經(jīng)測序表明在pCAMBIA-1300-221載體的酶切位點Sma I和Kpn I之間插入序列2的第31- 1965位所示DNA片段的重組質(zhì)粒命名為PCAMBIA-1300-221-CRK19。在重組表達(dá)載體 PCAMBIA-1300-221-CRK19中，啟動所述CRK19基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為35S啟動子。
[0化引在重組表達(dá)載體PCAMBIA-1300-221-C服19的構(gòu)建過程中，也可W人工合成的序列 表的序列2所示的CRK19基因為模板。
[0059] 二、CRK19轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得及鑒定
[0060] UCRK19轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的獲得
[0061 ] 將步驟一構(gòu)建的重組表達(dá)載體PCAMBIA-1300-221-C服19導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101感受 態(tài)。對轉(zhuǎn)化后的重組農(nóng)桿菌用由引物1和引物2(同上)組成的引物對進(jìn)行PCR鑒定。將經(jīng)鑒定 表明含有CRK19基因（PCR目的條帶大小為2000bp左右）的農(nóng)桿菌GV3101命名為GV3101/ PCAMBIA-1300-221-CRK19。
[0062] 采用用農(nóng)桿菌花序侵染的方法(SJ Clough,AF Bent.Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The Plant 化urnal，1998，16(6): 735-743.)將上述所得的重組農(nóng)桿菌GV3101/pCAMBIA-1300- 221-CRK19轉(zhuǎn)化擬南芥野生型(Col生態(tài)型）。
[0063] 轉(zhuǎn)化后進(jìn)行潮霉素抗性篩選，在含40mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，收集具有潮 霉素抗性的轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子，獲得具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)基因苗，即轉(zhuǎn)入pCAMBIA-1300- 221-CRK19的擬南芥植株(Ti代）。
[0064] 實驗同時設(shè)置向擬南芥野生型(Col生態(tài)型）中轉(zhuǎn)入pCAMBIA-1300-221空載體的對 照。
[00化]2、CRK19轉(zhuǎn)基因擬南芥鑒定
[0066] (1)遺傳學(xué)分離比方法鑒定插入拷貝數(shù)
[0067] 根據(jù)遺傳學(xué)原理，單拷貝插入之后自交后代會產(chǎn)生3:1的分離比。結(jié)合統(tǒng)計學(xué)的方 法，統(tǒng)計抗生素培養(yǎng)基上抗性苗和非抗性苗的數(shù)量。用分離比方法鑒定出轉(zhuǎn)基因植株為單 拷貝插入的株系(單拷貝CRK19轉(zhuǎn)基因擬南芥），從而用于純合體的篩選。
[0068] (2)轉(zhuǎn)基因擬南芥C190E-1和C190E-2純合系的篩選
[0069] 經(jīng)上述鑒定分析后，從中隨機(jī)選擇二個單拷貝C服19轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，分別記為 C190E-1和C190E-2(Ti代）。播種于含40mg/L潮霉素 MS培養(yǎng)基上，經(jīng)過連續(xù)2代篩選，W所有 自交后代均能正常生長（即所有后代均具潮霉素抗性)的親本植株為純合系，最終獲得T3代 轉(zhuǎn)基因擬南芥C190E-1和C190E-2的純合系植株，作為實驗材料進(jìn)行后續(xù)實驗分析。
[0070] S、轉(zhuǎn)基因擬南芥C190E-1和C190E-2純合系中C服19基因表達(dá)量分析
[0071] 提取擬南芥野生型(Col-0生態(tài)型)和過表達(dá)植株(C190E-1和C190E-2)的總RNA，利 用實時巧光定量PCR檢測材料中C服19基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)情況。具體如下：
[0072] 1、轉(zhuǎn)錄水平分析(RNA表達(dá)量）
[0073] W上述獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株(C190E-1和C190E-2)及擬南芥野生型（Col-0生 態(tài)型）為實驗材料。取生長4周左右的擬南芥幼苗，提取RNA并且反轉(zhuǎn)錄cDNA，然后通過實時 巧光定量PCR方法分析CRK19基因在各實驗材料中的表達(dá)情況。
[0074] 其中，擴(kuò)增C服19基因的引物序列為：
[0075] C服 19RT-F1:5'-GACTGTCTGAAAATAGGCATC-3'（序列2的第649-669位）；
[0076] CRK19RT-Rl:5'-CCTTCTCATTAAGCGTCC-3'（序列2的第902-919位的反向互補序 列)。
[0077] WActin2/8作為內(nèi)參基因，擴(kuò)增內(nèi)參Actin的引物序列為：
[007引 Actin-F:5 '-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3 '；
[00巧]Actin-R:5'-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3'。
[0080] 上述引物的反應(yīng)條件如下：
[0081] (1)反應(yīng)體系的建立
[0082] 實時巧光定量PCR反應(yīng)體系
[0083]
[0084] (2)S個重復(fù)，輕甩混勻，用Bio-Rad CFX96巧光定量PCR儀進(jìn)行實驗。
[0085] (3)反應(yīng)程序的設(shè)定：
[0086] 實時巧光定量PCR反應(yīng)程序
[0087]
[0088] (4)數(shù)值分析，作為衡量基因轉(zhuǎn)錄水平的相對差值，對各株系中CRK19基因 的表達(dá)進(jìn)行分析比較。Ct值為PCR反應(yīng)巧光信號達(dá)到設(shè)定闊值時的循環(huán)數(shù)，A Ct值為特異引 物Ct值與Act in引物Ct值之差。
[0089] C服19相關(guān)遺傳材料的實時巧光定量PCR檢測結(jié)果如圖1所示，C服19基因的表達(dá)均 為相對值，W擬南芥野生型(Col-0)中C服19基因的表達(dá)為1。從圖中可W看出，轉(zhuǎn)基因擬南 芥C190E-巧日C190E-2中C服19mRNA表達(dá)量均顯著高于野生型（Co 1 -0)中C服19mRNA表達(dá)量(P <0.05)。
[0090] 實施例2、CRK19轉(zhuǎn)基因植物幼苗生長試驗分析
[0091] ABA是植物抵抗外界逆境脅迫的重要信號分子，具有廣泛生理效應(yīng)。ABA可W促進(jìn) 種子成熟和休眠過程W及種子成熟過程中膽藏蛋白的積累、抑制種子萌發(fā)和幼苗生長、抑 制主根發(fā)育、促進(jìn)側(cè)根發(fā)育W及促進(jìn)葉片衰老和脫落等。因此當(dāng)有外源ABA存在的條件下， 植物的根長和莖葉的生長受到明顯抑制，根據(jù)野生型與邸1(19轉(zhuǎn)基因植物對ABA的敏感性可 W檢測CRK19是否參與到ABA抑制的莖葉徒長過程。
[0092] 將野生型擬南芥(Col-0生態(tài)型）、實施例1得到的單拷貝插入的T3代純合體C190E- 1和C190E-2的種子直接播種在無 ABA和含有0.5咖ABA的MS板子上(每種實驗材料播種80- 100粒），4°C層積3天，然后放在光照培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)5天后拍照并且統(tǒng)計子葉轉(zhuǎn)綠情況。 實驗重復(fù)3次，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE)，不同字母代表同一 ABA濃度下各處理之間差異顯 著（P<0.05)。
[0093] 實驗同時設(shè)置向擬南芥野生型(Col生態(tài)型）中轉(zhuǎn)入pCAMBIA-1300-221空載體的對 照巧載對照），即GFP-0E株系。
[0094] 結(jié)果如圖2所示，在無 ABA的條件下，CRK19高表達(dá)株系C190E-1和C190E-2W及野生 型擬南芥（Col-0生態(tài)型）的子葉均轉(zhuǎn)綠，它們之間的子葉轉(zhuǎn)綠率沒有差異(P〉0.05)。當(dāng)有 ABA(0.5iiM)存在時，各種基因型的子葉轉(zhuǎn)綠率均受到抑制，但是實施例1得到的單拷貝插入 的T3代純合體C服19轉(zhuǎn)基因株系C190E-1和C190E-2相對于野生型擬南芥(Col-0生態(tài)型）受 到抑制的程度更高(P<〇.〇5)。而對于空載對照植株GFP-0E，無論是在無 ABA的條件下，還是 在有ABA(0.5iiM)存在的條件下，其子葉轉(zhuǎn)綠率與擬南芥野生型(Col-0生態(tài)型)基本一致，無 統(tǒng)計學(xué)差異(P〉〇.〇5)。
[00M] 綜合W上結(jié)果，相對于野生型Col-0,實施例1得到的T3代純合體C服19轉(zhuǎn)基因株系 (C190E-1和C190E-2)在ABA抑制的子葉轉(zhuǎn)綠方面更加敏感，表現(xiàn)出ABA超敏表型，由于子葉 轉(zhuǎn)綠變慢會直接導(dǎo)致莖葉生長受到抑制，因此運在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上可應(yīng)用與抑制作物的莖葉徒 長，也可W抑制園藝植物和果樹的徒長，從而起到保持養(yǎng)分的作用。
【主權(quán)項】
1. 由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)在如下al)-a2)任一中的應(yīng)用： al)抑制植物莖葉徒長； a2)選育莖葉徒長受到抑制的植物品種。2. 由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因在如下al)_a2)任一 中的應(yīng)用： al)抑制植物莖葉徒長； a2)選育莖葉徒長受到抑制的植物品種。3. 培育莖葉徒長受到抑制的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：向受體植物中導(dǎo)入由 序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因，得到轉(zhuǎn)基因植物;所述轉(zhuǎn)基因 植物與所述受體植物相比莖葉徒長受到抑制。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于:所述由序列表中序列3所 示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因是如下1)至5)中任一所述的DNA分子： 1) 編碼序列為序列表中序列2自5'末端第31至1968位核苷酸所示的DNA分子； 2) 序列表中序列2所示的DNA分子； 3) 序列表中序列1所示的DNA分子； 4) 在嚴(yán)格條件下與1)-3)任一所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列3所示的氨 基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子； 5) 與1)_4)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼由序列表中序列3所示的氨 基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于:在所述方法中，所述由序列表中序列3 所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因是通過含有所述蛋白質(zhì)的編碼基因的重組表 達(dá)載體導(dǎo)入所述受體植物中的。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述重組表達(dá)載體中啟動所述蛋白質(zhì)的編 碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為35S啟動子。7. -種抑制植物莖葉徒長的方法，包括如下步驟： (1) 向受體植物中導(dǎo)入由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因， 得到轉(zhuǎn)基因植物； (2) 將所述轉(zhuǎn)基因植物的種子播種于含有ΑΒΑ的基質(zhì)中或者向所述轉(zhuǎn)基因植物噴施外 源 ΑΒΑ〇8. 由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或所述蛋白質(zhì)的編碼基因在如下 任一中的應(yīng)用： b 1)降低植物對ΑΒΑ的耐受性； b2)選育對ΑΒΑ耐受性降低的植物品種。9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于:所述植物為雙子葉植物或 單子葉植物。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用或方法，其特征在于:所述雙子葉植物為十字花科植物。
【文檔編號】C12N15/54GK106047831SQ201610380727
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月1日
【發(fā)明人】張大鵬, 路凱, 王小芳
【申請人】清華大學(xué)