專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)端粒酶活性的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)診斷和預(yù)后技術(shù)。具體而言，本發(fā)明涉及檢測(cè)端粒酶活性的方法。
背景技術(shù)：
端粒酶是合成染色體末端上端粒的酶。端粒是發(fā)現(xiàn)于真核生物染色體末端的DNA序列，其在復(fù)制過(guò)程中保持基因信息的保真度。在正常情況下，端粒隨著細(xì)胞分裂的每個(gè)循環(huán)變得越來(lái)越短。認(rèn)為足夠短的端粒是細(xì)胞停止分裂的信號(hào)。
端粒酶屬于使用RNA作為生產(chǎn)DNA的模板的稱(chēng)為逆轉(zhuǎn)錄酶的一類(lèi)酶。端粒酶含有RNA和蛋白質(zhì)成分。酶的RNA部分和端粒中的DNA結(jié)合，而蛋白質(zhì)成分吸引DNA亞基進(jìn)入?yún)^(qū)域并將它們連接至染色體末端。然后通過(guò)加入端粒重復(fù)部分(telomeric repeats)延伸染色體末端富含G的鏈。通過(guò)含有和端粒重復(fù)部分互補(bǔ)序列的部分端粒酶RNA成分的逆轉(zhuǎn)錄來(lái)產(chǎn)生該延伸。端粒酶催化的富含G的鏈的延伸之后，推定通過(guò)更多常規(guī)方法復(fù)制端粒的互補(bǔ)DNA鏈。在真核生物的情況中，端粒酶由重復(fù)的限定的核苷酸序列(重復(fù)部分)累積組成，例如，在人中含有TTAGGG序列。
在正常組織中是檢測(cè)不到端粒酶活性的，除了種系細(xì)胞。必須通過(guò)重復(fù)循環(huán)的DNA復(fù)制保持其染色體末端的種系細(xì)胞可假定由于端粒酶的活性而隨著時(shí)間不縮短它們端粒的長(zhǎng)度。再生組織的干細(xì)胞表達(dá)非常低水平的端粒酶且它們的端粒隨著多次細(xì)胞分裂而縮短。偶爾在鄰近腫瘤的組織中檢測(cè)到端粒酶活性，該組織可能反映隱藏的微小轉(zhuǎn)移(micrometastases)存在。
認(rèn)為端粒酶在細(xì)胞衰老過(guò)程中起作用。抑制體細(xì)胞中端粒酶的活性可能在控制它們分裂次數(shù)中是重要的。實(shí)際上，初級(jí)成纖維細(xì)胞中端粒的長(zhǎng)度和這些細(xì)胞在衰老之前經(jīng)受的分裂次數(shù)密切相關(guān)。端粒DNA的丟失是細(xì)胞復(fù)制潛力結(jié)束的信號(hào)，作為全部機(jī)理的部分，通過(guò)這種方式多細(xì)胞生物限制其細(xì)胞的增生。
由于其在控制復(fù)制中的作用，最近端粒酶還涉及腫瘤發(fā)生。已經(jīng)在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到端粒酶活性。已經(jīng)提出端粒酶是形成人癌細(xì)胞無(wú)限制生長(zhǎng)的原因。不同于正常細(xì)胞，癌細(xì)胞中的端粒酶通過(guò)保持端粒長(zhǎng)度顯示使細(xì)胞不滅以致細(xì)胞從不接受停止分裂的信號(hào)。端粒酶對(duì)于化學(xué)療法是理想的靶子，因?yàn)樵撁冈诩s90％的人癌細(xì)胞中是有活性的，但是在大多數(shù)正常細(xì)胞中沒(méi)有活性。醫(yī)藥公司已經(jīng)篩選了上千種化合物來(lái)發(fā)現(xiàn)能夠阻斷端粒酶的試劑。
已經(jīng)發(fā)展稱(chēng)為端粒重復(fù)擴(kuò)增法(telomeric repeat amplificationprotocol)(TRAP)的方法來(lái)測(cè)定端粒酶活性。TRAP是基于酶活性的體外檢測(cè)。簡(jiǎn)短地說(shuō)，源自端粒序列的合成寡核苷酸用作底物。該底物通過(guò)測(cè)試樣品中的端粒酶延伸，然后將延伸產(chǎn)物擴(kuò)增和定量。TRAP方法的詳述可以發(fā)現(xiàn)于，例如，Harley等的美國(guó)專(zhuān)利No.5,891,639(此后稱(chēng)為Harley)，和Emrich等的美國(guó)專(zhuān)利No.6,221,584(此后稱(chēng)為Emrich)中。最近，許多研究組已經(jīng)報(bào)道了使用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)的改良TRAP方法(參見(jiàn)例如，Hou等，Clin.Chem.47519-524，2001；Elmore等，Diagn.Mol.Pathol.，11，177-185，2002；和Wege等，Nucleic Acid Res.，31E3-3，2003)。特別地，實(shí)時(shí)PCR技術(shù)已經(jīng)用于提供更快和更靈敏的端粒酶延伸產(chǎn)物定量。
目前TRAP通常包括多個(gè)培養(yǎng)步驟并在每個(gè)培養(yǎng)步驟后將樣品從一個(gè)試管轉(zhuǎn)移至另一個(gè)。轉(zhuǎn)移處理耗時(shí)并易于污染和操作失誤(例如，將樣品加入錯(cuò)誤的試管或加樣孔中)。目前TRAP通常從細(xì)胞或組織提取物開(kāi)始。由于同時(shí)含有RNA和蛋白質(zhì)成分的端粒酶受到提取物中的蛋白酶和RNA酶的消化，經(jīng)常需要蛋白酶抑制劑和/或RNA酶抑制劑來(lái)防止端粒酶的降解。向提取物中添加蛋白酶抑制劑和/或RNA酶抑制劑增加了分析成本。因此，需要更靈活、容易操作且快速而低成本的端粒酶試驗(yàn)。
發(fā)明概述本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)端粒酶活性的方法，該方法使用引物延伸然后實(shí)時(shí)PCR定量。該方法提供了快速、靈敏和精確地測(cè)定生物樣品中的端粒酶活性的方法。
一實(shí)施方案中，該方法包括步驟(1)將生物樣品加入反應(yīng)管中，該反應(yīng)管中含有具有第一引物和核苷三磷酸的第一反應(yīng)混合物，具有第二引物和DNA聚合酶的第二反應(yīng)混合物，以及分隔第一反應(yīng)混合物和第二反應(yīng)混合物的蠟層；(2)在適于端粒酶從第一引物產(chǎn)生延伸產(chǎn)物的條件下用第一反應(yīng)混合物培養(yǎng)生物樣品；(3)混合延伸產(chǎn)物和第二反應(yīng)混合物；(4)在可以從單個(gè)293T細(xì)胞檢測(cè)端粒酶活性的條件下使用實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增延伸產(chǎn)物；和(5)使用步驟(4)條件下擴(kuò)增的對(duì)照模板定量擴(kuò)增的延伸產(chǎn)物。該實(shí)施方案的單管設(shè)計(jì)簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)程序并減少了實(shí)驗(yàn)誤差。
另一實(shí)施方案中，檢測(cè)方法包括如下步驟(1)將第一引物和核苷三磷酸引入樣品細(xì)胞中；(2)在適于端粒酶從細(xì)胞內(nèi)的第一引物產(chǎn)生延伸產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)樣品細(xì)胞(原位引物延伸)；(3)使用實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增延伸產(chǎn)物(extension product)；和(4)使用步驟(3)條件下擴(kuò)增的對(duì)照模板定量擴(kuò)增的延伸產(chǎn)物。在該實(shí)施方案中，延伸產(chǎn)物是在完整的樣品細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的并在完成定量步驟之前在合適的條件下可以保存一段延長(zhǎng)的時(shí)間。
本發(fā)明還公開(kāi)了實(shí)施該方法和診斷端粒酶相關(guān)疾病的試劑盒。一實(shí)施方案中，試劑盒包括(1)反應(yīng)管，其含有具有第一引物和核苷三磷酸的第一反應(yīng)混合物，具有第二引物和DNA聚合酶的第二反應(yīng)混合物，以及分隔第一反應(yīng)混合物和第二反應(yīng)混合物的蠟層；和(2)對(duì)照管或加樣孔(well)，含有具有第一引物和核苷三磷酸的第一反應(yīng)混合物，具有第二引物、DNA聚合酶和對(duì)照模板的第二反應(yīng)混合物，以及分隔第一反應(yīng)混合物和第二反應(yīng)混合物的蠟層。
附圖簡(jiǎn)述將參考以下附圖詳細(xì)地說(shuō)明，其中相同數(shù)字所指的是相同要素，且其中

圖1是示意圖，描繪了檢測(cè)端粒酶活性方法的實(shí)施方案。
圖2是示意圖，描繪了檢測(cè)端粒酶活性方法中另外的延伸步驟。
圖3是示意圖，描繪了檢測(cè)端粒酶活性方法的另一個(gè)實(shí)施方案。
圖4A和圖4B各自是熒光/PCR循環(huán)曲線(xiàn)和閾值循環(huán)數(shù)(thresholdcycle)/細(xì)胞數(shù)量曲線(xiàn)，證明了檢測(cè)方法的靈敏性。
圖5A和圖5B各自是熒光/PCR循環(huán)曲線(xiàn)和閾值循環(huán)數(shù)/模板分子數(shù)量(template molecule number)曲線(xiàn)，使用對(duì)照模板通過(guò)實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)生。
圖6是曲線(xiàn)，顯示了樣品細(xì)胞數(shù)量和閾值循環(huán)數(shù)之間或模板分子數(shù)量和閾值循環(huán)數(shù)之間的線(xiàn)性回歸。
圖7是柱狀圖，顯示了各種細(xì)胞系和組織中的端粒酶活性。
圖8是熒光/PCR循環(huán)曲線(xiàn)，顯示了注射器處理后接受原位引物延伸的細(xì)胞中的端粒酶活性檢測(cè)。
圖9是熒光/PCR循環(huán)曲線(xiàn)，顯示了磷酸鈣沉淀后接受原位引物延伸的細(xì)胞中的端粒酶活性檢測(cè)。
發(fā)明詳述圖1顯示了用于檢測(cè)和定量生物樣品中端粒酶活性的方法100。首先，將生物樣品加入反應(yīng)管中，該反應(yīng)管含有具有第一引物和核苷三磷酸的第一反應(yīng)混合物以及具有第二引物和DNA聚合酶的第二反應(yīng)混合物(步驟102)。通過(guò)高溫熔化的蠟層將第一反應(yīng)混合物和第二反應(yīng)混合物分隔。將生物樣品和第一反應(yīng)混合物混合，其占據(jù)在反應(yīng)管的上部，并在適于端粒酶從第一引物產(chǎn)生延伸產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)(步驟104)。然后通過(guò)熔化蠟層將延伸產(chǎn)物和第二反應(yīng)混合物混合(步驟108)，并通過(guò)實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增(步驟110)。第一反應(yīng)混合物中未延伸的第一引物和第二反應(yīng)混合物中的第二引物形成用于PCR擴(kuò)增的引物對(duì)。然后通過(guò)比較反應(yīng)管中的PCR產(chǎn)物量和具有已知量的對(duì)照模板的對(duì)照管中的PCR產(chǎn)物量來(lái)定量生物樣品中的端粒酶活性(步驟112)。該實(shí)施方案中，已經(jīng)最佳化第一引物延伸和PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件以致可以檢測(cè)單個(gè)293T細(xì)胞的端粒酶活性。
生物樣品包括從受檢者分離的組織、細(xì)胞和生物流體，以及存在于受檢者內(nèi)部的組織、細(xì)胞和生物流體。生物樣品還包括初級(jí)細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞，和任何其它的培養(yǎng)細(xì)胞。由于本發(fā)明的方法檢測(cè)端粒酶活性，端粒酶是RNA酶敏感的核糖核蛋白，不僅僅是端粒酶的RNA或蛋白質(zhì)成分的存在，該方法需要酶活性細(xì)胞或組織樣品。一實(shí)施方案中，生物樣品是通過(guò)常規(guī)方法從受檢者如活體解剖分離的組織樣品。優(yōu)選生物樣品是細(xì)胞或組織提取物，尤其是來(lái)自人細(xì)胞或組織的提取物。通過(guò)重復(fù)融/凍細(xì)胞、將細(xì)胞或組織均化，或在含有非離子或/和兩性離子去污劑的溶解緩沖劑(lysis buffer)中溶解(lysing)細(xì)胞或組織來(lái)產(chǎn)生提取物。非離子去污劑的實(shí)例包括但不限制于，吐溫20、曲通(Triton)X-100、曲通X-114、polydocanol(Thesit)、NP-40、n-辛基糖苷、n-十二烷基糖苷、n-十二烷基-β-D-麥芽苷(-maltoside)、辛?；?N-甲基葡糖酰胺(-glucamide)(MEGA-8)、癸?；?N-甲基葡糖酰胺(MEGA-10)，和異十三烷基-聚(乙烯二醇醚)n。兩性離子去污劑的實(shí)例包括但不限制于，CHAPS(3-[(3-膽胺(-cholamido)丙基)二甲基銨基(ammonio)]-1-丙烷-磺酸鹽)、CHAPSO(3-[(3-膽胺丙基)二甲基銨基]-2-羥基-1-丙烷-磺酸鹽)、N-十二烷基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷-磺酸鹽，和毛地黃皂甙。溶解緩沖劑中去污劑的量可以為約0.1重量％至約2重量％。一實(shí)施方案中，溶解緩沖劑含有約0.5重量％的去污劑。
由于端粒酶同時(shí)含有RNA和蛋白質(zhì)組分，可以將蛋白酶和/或RNA酶抑制劑加入提取物中來(lái)防止提取物中的端粒酶通過(guò)其它細(xì)胞蛋白酶破壞。蛋白酶抑制劑的實(shí)例包括但不限制于，氨肽酶抑制劑(amastain)、4-脒基苯基甲烷磺?；?AMPSF)、抗蛋白酶、抑酶肽、苯丁抑制素、胰凝乳蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、3，4-二氯異香豆精、抑脂酶免疫酮A和B、彈性酶抑制劑、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、亮抑蛋白酶肽、胃酶抑制劑A、苯基甲基磺?；?PMSF)、膦酰二肽、甲苯磺?；?lài)氨酰氯甲基酮(TLCK)、甲苯磺?；交滨；燃谆?TPCK)，和胰蛋白酶抑制劑。RNA酶抑制劑的實(shí)例包括但不限制于，胰型RNA酶抑制劑、人胎盤(pán)RNA酶抑制劑，和二乙基焦碳酸酯(DEPC)。
反應(yīng)管可以是適于方法特定應(yīng)用需要的任何形狀和大小的容器。通常，反應(yīng)管是如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的PCR管或PCR加樣孔。
第一反應(yīng)混合物中的第一引物是適于作為端粒酶底物的寡脫氧核糖核苷。第一引物起兩個(gè)作用其作為端粒酶底物來(lái)產(chǎn)生延伸產(chǎn)物，其還作為隨后的PCR反應(yīng)中的引物。一實(shí)施方案中，第一引物的長(zhǎng)度為10-60個(gè)核苷酸。另一實(shí)施方案中，第一引物的長(zhǎng)度為12-30個(gè)核苷酸。優(yōu)選作為端粒酶底物的第一引物不含有利用第一引物作為底物的特定端粒酶的完全端粒重復(fù)序列。例如，人端粒酶添加了端粒重復(fù)序列5’-TTAGGG-3’(SEQ ID NO1)。因此，如果使用本發(fā)明方法來(lái)測(cè)定人端粒酶活性，端粒酶底物應(yīng)該是缺失完全重復(fù)序列5’-TTAGGG-3’的人端粒酶底物。原因是端粒酶只通過(guò)添加端粒重復(fù)部分來(lái)延伸端粒酶底物。因此，在PCR反應(yīng)中和第一引物形成引物對(duì)的第二引物必需含有和端粒重復(fù)部分互補(bǔ)的序列。如果在端粒酶延伸反應(yīng)中使用的第一引物(即，端粒酶底物)含有完全端粒重復(fù)部分，則PCR反應(yīng)中使用的第二引物將容易地和未延伸的第一引物雜交并形成可能導(dǎo)致負(fù)面PCR結(jié)果的引物二聚物。
反應(yīng)混合物中的核苷三磷酸包括但不限制于，脫氧腺苷三磷酸(dATP)、脫氧鳥(niǎo)苷三磷酸(dGTP)、脫氧尿苷三磷酸(dUTP)、脫氧胸苷三磷酸(dTTP)和脫氧胞苷三磷酸(dCTP)。一實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物中含有等摩爾比的dATP、dGTP、dCTP以及dUTP和dTTP之一。核苷三磷酸總稱(chēng)為dNTPs。
除了第一引物和核苷三磷酸，第一反應(yīng)混合物還可以含有維持端粒酶引物延伸反應(yīng)最佳pH的緩沖系統(tǒng)。緩沖系統(tǒng)的實(shí)例包括但不限制于，磷酸鹽緩沖系統(tǒng)、檸檬酸鹽緩沖系統(tǒng)、硼酸鹽緩沖系統(tǒng)，三-(羥甲基)氨基甲烷、3-[(3-膽胺丙基)二甲基銨基(-ammoniol)]-1-丙烷磺酸鹽(CHAPS)、N-[2-羥乙基]哌嗪-N’-2-[乙烷磺酸](HEPES)，和3-[N-嗎啉代]丙烷磺酸(MOPS)。
適于端粒酶從第一引物產(chǎn)生延伸產(chǎn)物的條件是本領(lǐng)域公知的。通常，端粒延伸反應(yīng)是在約20-30℃下進(jìn)行約10-60分鐘，優(yōu)選約25℃或約30℃下約15-30分鐘，最優(yōu)選為約25℃下約20分鐘。
步驟104的延伸產(chǎn)物可以接受另外的不依賴(lài)模板的延伸(步驟106)。優(yōu)選通過(guò)酶反應(yīng)方式來(lái)完成該延伸，如通過(guò)使用末端轉(zhuǎn)移酶連接核苷酸或通過(guò)使用DNA連接酶連接短DNA片段。一實(shí)施方案中，通過(guò)末端轉(zhuǎn)移酶將聚脲苷酸尾加至延伸產(chǎn)物的3’端。另一實(shí)施方案中，將10-20個(gè)核苷酸的短DNA寡聚物連接至延伸產(chǎn)物的3’端。這些修飾產(chǎn)生了第二引物的單一序列并因此包括了第一引物中的全部端粒重復(fù)序列。如圖2所示，含有人端粒重復(fù)TTAGGG的第一引物用作人端粒酶底物。端粒酶媒介的延伸后，延伸產(chǎn)物具有3’序列(TTAGGG)nTTAGGGTTAGGG-3’，其中n是等于或大于零的整數(shù)。另外的將至少10個(gè)核苷酸的聚脲苷酸尾加至延伸產(chǎn)物的3’端的不依賴(lài)模板的延伸后，延長(zhǎng)的延伸產(chǎn)物具有3’序列(TTAGGG)nTTAGGGTTAGGGAAAAAAAAAAAm-3’，其中n是等于或大于零的整數(shù)。然后可以將第二引物設(shè)計(jì)成具有與端粒重復(fù)序列和延長(zhǎng)的延伸產(chǎn)物3’端的聚脲苷酸序列的連接互補(bǔ)的序列。如圖2所示，與端粒重復(fù)部分和附加核苷酸的連接互補(bǔ)的第二引物應(yīng)該能夠從延伸產(chǎn)物中分辯出未延伸的第一引物，只要第一引物在其3’端不具有完全端粒重復(fù)序列。
不存在另外的延伸步驟106時(shí)，第二反應(yīng)混合物中的第二引物通常含有多個(gè)不完全的端粒重復(fù)序列和至少一個(gè)完全的端粒重復(fù)序列來(lái)最小化非特異性PCR產(chǎn)物如引物-二聚物的形成。
第二反應(yīng)混合物中的DNA聚合酶可以是適于標(biāo)準(zhǔn)PCR條件的任何DNA聚合酶。這樣的酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。一實(shí)施方案中，第二反應(yīng)混合物還包括鎂鹽，其提供了延伸產(chǎn)物PCR擴(kuò)增的最佳鎂。另一實(shí)施方案中，第二反應(yīng)混合物還含有第一引物，或dNTP，或兩者。
分隔第一反應(yīng)混合物和第二反應(yīng)混合物的蠟層具有約50-90℃的熔化溫度，優(yōu)選約60-80℃。一實(shí)施方案中，可以將痕量的染料加入第一反應(yīng)混合物和第二反應(yīng)混合物之一中來(lái)監(jiān)控PCR擴(kuò)增之前可能通過(guò)蠟層的泄漏。另一實(shí)施方案中，將第二反應(yīng)混合物和蠟預(yù)混并在蠟固化時(shí)限制在蠟層范圍內(nèi)。當(dāng)蠟層在較高溫度下熔化時(shí)第二反應(yīng)混合物內(nèi)含物得到釋放。
通過(guò)實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增定量延伸產(chǎn)物(有或無(wú)另外的延伸)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，通常通過(guò)將熱穩(wěn)定酶和一對(duì)引物加入含有模板的反應(yīng)混合物中并通過(guò)多個(gè)熱循環(huán)來(lái)完成PCR擴(kuò)增。方法100中，第一反應(yīng)混合物中未延伸的第一引物作為5’PCR引物，第二反應(yīng)混合物中的第二引物作為3’PCR引物。
使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)來(lái)檢測(cè)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中的PCR產(chǎn)物。通過(guò)將每個(gè)擴(kuò)增的線(xiàn)性部分和使用已知模板產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相比較來(lái)測(cè)量特定PCR產(chǎn)物的累積。
一實(shí)施方案中，正常進(jìn)行PCR反應(yīng)，但是添加與兩個(gè)側(cè)翼PCR引物之間的序列結(jié)合的熒光標(biāo)記探針寡核苷酸。該方法依賴(lài)于Taq聚合酶的5’核酸外切酶活性從探針的5’端分裂熒光標(biāo)記的核苷酸。該探針寡核苷酸在3’端還具有抑制全部熒光的熒光淬滅劑，因此，當(dāng)除去5’標(biāo)記的核苷酸時(shí)就失去淬滅作用，因?yàn)閮蓚€(gè)熒光團(tuán)之間的距離太遠(yuǎn)以致不能相互影響。每個(gè)循環(huán)產(chǎn)生更多的熒光使整個(gè)PCR反應(yīng)被實(shí)時(shí)跟隨?？梢酝ㄟ^(guò)將指數(shù)式擴(kuò)增的線(xiàn)性部分和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相比較來(lái)計(jì)算存在于反應(yīng)中的模板量。這樣的檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)例包括但不限制于，TaqMan系統(tǒng)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)。
另一實(shí)施方案中，通過(guò)使用單標(biāo)記的熒光引物來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物，如LUX引物(Invitrogen，Carlsbad，CA)和Amplifluor RP引物(Chemicon，Temecula，CA)。當(dāng)熒光引物并入雙鏈PCR產(chǎn)物中時(shí)引物產(chǎn)生增加量的熒光發(fā)射。然后基于關(guān)閉的反應(yīng)管中每個(gè)PCR循環(huán)的擴(kuò)增步驟中產(chǎn)生的熒光來(lái)測(cè)定PCR產(chǎn)物量。
仍然另一實(shí)施方案中，使用擇優(yōu)與雙鏈DNA結(jié)合的熒光染料來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物。因此如SYBR綠的染料可以準(zhǔn)確地定量在單鏈寡核苷酸引物存在下產(chǎn)生的雙鏈產(chǎn)物量。
通過(guò)將反應(yīng)管中增加的熒光與含有已知量對(duì)照模板的對(duì)照管中增加的熒光相比較來(lái)定量端粒酶活性(步驟110)。通常，使用含有不同稀釋度對(duì)照模板的一套對(duì)照管或加樣孔進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR來(lái)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。然后在同一PCR條件下擴(kuò)增測(cè)試管或加樣孔中的延伸產(chǎn)物并基于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量測(cè)試管或加樣孔中的端粒酶活性。端粒酶活性通常以某個(gè)時(shí)間段內(nèi)合成的端粒重復(fù)量部分的量來(lái)表示。人端粒酶優(yōu)選的對(duì)照模板是TSR9，其具有序列5’-AATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAG-3’(SEQ ID NO2)。
另一實(shí)施方案中，將細(xì)胞或組織提取物加入含有第一引物、第二引物、dNTPs、DNA聚合酶，和擇優(yōu)結(jié)合雙鏈DNA的熒光染料的總反應(yīng)混合物中。在相同的反應(yīng)管中連續(xù)進(jìn)行端粒酶媒介的延伸和PCR擴(kuò)增。
圖3顯示了檢測(cè)端粒酶活性的另一方法300。該實(shí)施方案中，在完整細(xì)胞中進(jìn)行引物延伸步驟。特別地，將第一引物和核苷三磷酸引入完整樣品細(xì)胞中(步驟302)；然后在適于端粒酶在細(xì)胞內(nèi)從第一引物產(chǎn)生延伸產(chǎn)物而保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的條件下培養(yǎng)樣品細(xì)胞(步驟304)。步驟304也指的是如“原位引物延伸步驟”，因?yàn)檠由飚a(chǎn)物是在樣品細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生的。然后擴(kuò)增延伸產(chǎn)物并使用實(shí)時(shí)PCR和對(duì)照模板來(lái)定量(步驟308)。一實(shí)施方案中，將樣品細(xì)胞和第二反應(yīng)混合物混合并接受PCR擴(kuò)增。另一實(shí)施方案中，在溶解緩沖劑中溶解樣品細(xì)胞并將溶解產(chǎn)物用于實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中。
或者，在完成端粒酶媒介的引物延伸后將樣品細(xì)胞保存(步驟306)。該實(shí)施方案中，由于延伸產(chǎn)物仍然在完整的樣品細(xì)胞內(nèi)部，比細(xì)胞/組織提取物產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物可以更好地保存延伸產(chǎn)物。因此方法300使操作者可以在接受樣品后立即進(jìn)行端粒酶媒介的引物延伸步驟，并保存中間體產(chǎn)物即引物延伸步驟304之后的樣品細(xì)胞，用于較后時(shí)間的定量。
可以在懸浮液中或作為單層培養(yǎng)樣品細(xì)胞。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法將第一引物和dNTPs引入細(xì)胞中。實(shí)例包括但不限制于，磷酸鈣沉淀、DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染/脂轉(zhuǎn)染胺(lipofectamin)轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射、超聲處理、機(jī)械剪切(例如，迫使細(xì)胞通過(guò)注射器針頭)，和破壞細(xì)胞膜或提高細(xì)胞膜滲透性的其它化學(xué)或物理方法。一實(shí)施方案中，將細(xì)胞懸浮并迫使其通過(guò)25-規(guī)格的針頭至少一次，優(yōu)選2-5次。然后將細(xì)胞接種于反應(yīng)管或加樣孔中含有第一引物和dNTPs的培養(yǎng)基中。通過(guò)針頭的剪切作用破壞了細(xì)胞膜并使第一引物進(jìn)入細(xì)胞中。然后將注射器處理的細(xì)胞與第一引物和dNTPs一起培養(yǎng)，通過(guò)細(xì)胞中的端粒酶產(chǎn)生延伸產(chǎn)物。
另一實(shí)施方案中，將第一引物和dNTPs引入使用磷酸鈣沉淀的細(xì)胞中。磷酸鈣沉淀是在第一引物和dNTP存在下形成的，并將其加入細(xì)胞中。然后在37℃培養(yǎng)細(xì)胞約10-120分鐘，通過(guò)細(xì)胞中的端粒酶產(chǎn)生延伸產(chǎn)物。
本發(fā)明的方法可以用作診斷試驗(yàn)來(lái)測(cè)定端粒酶相關(guān)疾病如霍奇森病(Hodgkin’s disease)的進(jìn)展和嚴(yán)重程度。端粒酶活性的定量也可用于，例如，測(cè)定端粒酶相關(guān)疾病治療后的嚴(yán)重程度。
在此所述的檢測(cè)方法可以通過(guò)例如利用預(yù)先包裝的診斷試劑盒來(lái)進(jìn)行，該試劑盒含有包括第一引物和核苷三磷酸的延伸組合物，和含有第二引物、核苷三磷酸、雙鏈DNA結(jié)合染料，以及DNA聚合酶的檢測(cè)組合物。當(dāng)和端粒酶混合時(shí)延伸組合物能夠從第一引物產(chǎn)生延伸產(chǎn)物；而檢測(cè)組合物能夠在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增延伸產(chǎn)物并產(chǎn)生用于定量的標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物。診斷試劑盒可以方便地用于例如臨床裝置中來(lái)診斷呈現(xiàn)端粒酶相關(guān)疾病如霍奇森病癥狀或家族史的患者。其中表達(dá)端粒酶的任何細(xì)胞類(lèi)型或組織可以用于在此所述的預(yù)后或診斷試驗(yàn)中。
一實(shí)施方案中，檢測(cè)生物樣品中的端粒酶活性，超過(guò)預(yù)測(cè)定的正常水平的提高的端粒酶活性象征端粒酶相關(guān)疾病如霍奇森病。
在此所述的檢測(cè)方法也可以用作預(yù)后試驗(yàn)來(lái)鑒定具有端粒酶相關(guān)疾病如霍奇森病或具有產(chǎn)生端粒酶相關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)的患者，其和異常的端粒酶活性相關(guān)。
此外，在此所述的預(yù)后試驗(yàn)可用來(lái)檢測(cè)是否患者可以給藥藥物候補(bǔ)物質(zhì)來(lái)治療或防止異常端粒酶活性相關(guān)的疾病。因此，本發(fā)明提供了確定使用異常端粒酶活性相關(guān)的試劑來(lái)檢測(cè)患者是否可以得到有效治療的方法?？梢栽O(shè)計(jì)預(yù)后試驗(yàn)來(lái)測(cè)定是否接受端粒酶相關(guān)疾病治療的患者對(duì)于長(zhǎng)期存活或疾病進(jìn)展具有不良前景(poor outlook)。通過(guò)建立疾病不同階段端粒酶活性的分布圖，從開(kāi)始至以后的階段，活性模式可以呈現(xiàn)相關(guān)的特定活性分布圖來(lái)增強(qiáng)不良預(yù)后(poor prognosis)的可能性。然后使用預(yù)后來(lái)設(shè)計(jì)更積極的治療方案和提高長(zhǎng)期存活和保持良好狀態(tài)的可能性。相似地，本發(fā)明的檢測(cè)方法可以用于基礎(chǔ)藥物篩選或監(jiān)控試劑(例如，藥物、小分子、蛋白質(zhì)、核苷酸)對(duì)端粒酶活性影響的臨床試驗(yàn)。例如，通過(guò)篩選試驗(yàn)測(cè)定的試劑降低端粒酶活性的有效性，可以在呈現(xiàn)端粒酶活性增強(qiáng)患者的臨床試驗(yàn)中得到監(jiān)控。這樣的臨床試驗(yàn)中，端粒酶活性可以用作特定組織表型的“讀出(read out)”。
一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了監(jiān)控試劑對(duì)患者的治療有效性的方法，包括步驟(i)在試劑給藥之前從患者獲得給藥前樣品；(ii)測(cè)定給藥前樣品中的端粒酶活性水平；(iii)從患者獲得一個(gè)或多個(gè)給藥后的樣品；(iv)測(cè)定給藥后樣品中的端粒酶活性水平；(v)比較給藥前樣品中的端粒酶活性水平和給藥后樣品中的端粒酶活性水平；和(vi)據(jù)此改變將試劑給藥于患者。例如，將端粒酶活性提高至高于檢測(cè)到的水平即降低試劑的有效性，減少試劑給藥是理想的。根據(jù)這樣的實(shí)施方案，端粒酶活性可以用作試劑有效性的指示劑，甚至在不存在可觀察表型反應(yīng)時(shí)。
如在此所述，端粒酶檢測(cè)方法可以用于各種應(yīng)用中，包括但不限制于，評(píng)價(jià)端粒酶抑制劑的有效性，測(cè)定端粒酶活性和細(xì)胞培養(yǎng)條件之間的相關(guān)性，測(cè)定端粒酶活性和時(shí)效(aging)之間、或端粒酶活性和腫瘤生成之間的相關(guān)性，診斷端粒酶相關(guān)疾病，和監(jiān)控這樣疾病的治療。
實(shí)施例實(shí)施例1.引物比例的確定在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基中(DMEM)用10％胎牛血清(FBS)在用5％CO2濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)293T細(xì)胞系(用剪切的人5型腺病毒(Ad5)DNA和SV40T-抗原轉(zhuǎn)化的初級(jí)人胚胎腎臟，從美國(guó)典型培養(yǎng)物中心(American Type Culture Collection)獲得)。在70-85％融合(confluency)收集細(xì)胞、計(jì)數(shù)，并使用含有10mM Tris-HCl，pH7.5、1mM MgCl2、1mM EGTA、0.1mM苯甲脒、5mM b-巰基乙醇、0.5％w/v CHAPS，和10％w/v丙三醇的溶解緩沖劑(CHAPS溶解緩沖劑)在冰上溶解30分鐘。使用BCA蛋白質(zhì)試驗(yàn)試劑盒(Pierce，Rockford，IL)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將細(xì)胞提取物保存于-70℃。
從Integrated DNA Technologies，Inc(Coralville，IA)定制寡核苷酸引物。第一引物(FP)具有序列5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’(SEQID NO3)并命名為T(mén)S，第二引物(SP)具有序列5’-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3’(SEQ ID NO4)并命名為ACX。為了檢測(cè)第一引物和第二引物的引物比例的影響，使用不同的比例(FP∶SP＝1∶1、1∶0.8、1∶0.5，和1∶0.2)。簡(jiǎn)短地說(shuō)，將1μl不同稀釋度細(xì)胞提取物和1μl引物混合物(0.5μg不同比例TS/ACX)、11.5μl水，和12.5μl PCR預(yù)混緩沖劑混合，預(yù)混緩沖劑含有0.25單位DNA聚合酶，2.5mM dATP、dUTP、dCTP和dGTP以及SYBR綠(1∶2000稀釋SYBR綠1儲(chǔ)液(S-7563)，從Molecular Probes Inc.，Eugene，OR購(gòu)買(mǎi))，首先在25℃培養(yǎng)20分鐘，然后在95℃10分鐘，并通過(guò)定量實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增(95℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，40個(gè)循環(huán))。結(jié)果顯示了1/1(w/w)的比例給出了最佳結(jié)果(表1)。
表1.引物比例對(duì)定量實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)的影響

實(shí)施例2.試驗(yàn)靈敏度的檢測(cè)為了檢測(cè)端粒酶活性試驗(yàn)方法的靈敏度，使用不同量(或細(xì)胞數(shù)量)的293T細(xì)胞提取物在實(shí)施例1中所述的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，且FP/SP比例為1/1。如表2和圖4所示，該方法能夠檢測(cè)單個(gè)293T細(xì)胞的端粒酶活性。
表2.293T細(xì)胞中端粒酶活性的檢測(cè)

實(shí)施例3.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的產(chǎn)生為了定量實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)的結(jié)果，在實(shí)施例2所述條件下使用對(duì)照模板分子來(lái)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，使端粒酶活性與通過(guò)閾值循環(huán)數(shù)的每個(gè)反應(yīng)的模板分子數(shù)量相關(guān)。如表3和圖5所示，使用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件和對(duì)照模板TSR9下實(shí)時(shí)PCR閾值(CT)讀數(shù)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。圖6顯示了293T細(xì)胞數(shù)量和閾值循環(huán)數(shù)之間的線(xiàn)性回歸以及對(duì)照模板TSR9分子數(shù)量和閾值循環(huán)數(shù)之間的線(xiàn)性回歸。
表3.使用TSR9模板對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的產(chǎn)生

實(shí)施例4.端粒酶試驗(yàn)方法的特異性為了檢測(cè)端粒酶試驗(yàn)方法的特異性，使用數(shù)個(gè)腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行試驗(yàn)，細(xì)胞系包括MCF7(乳房胸腔積液腺癌)、ZR-75-1(乳房腹水導(dǎo)管癌)和海拉細(xì)胞(頸腺癌)、各種鼠組織(從成年C57BL/6鼠采集)包括腦、腎臟、肝臟、心臟、睪丸，和血液，以及293T細(xì)胞的熱鈍化(95℃10分鐘)提取物。如表4和圖7所示，在增殖細(xì)胞、癌細(xì)胞系，(293T、海拉、MCF7和ZR-75-1)中檢測(cè)到端粒酶活性，但在熱鈍化的293T細(xì)胞提取物和空白對(duì)照中沒(méi)有檢測(cè)到。結(jié)果還顯示了正常成年鼠組織中具有低端粒酶活性，顯示了正常組織中的增殖細(xì)胞(例如，干細(xì)胞)是可檢測(cè)的。
表4.各種細(xì)胞系和鼠組織中的端粒酶活性

實(shí)施例5.反應(yīng)混合物的穩(wěn)定性為了測(cè)試端粒酶試驗(yàn)中所用試劑的穩(wěn)定性，制備含有第一引物TS、DNA聚合酶、dNTPs和SYBR綠的反應(yīng)混合物。反應(yīng)混合物的等分試樣在室溫下保持0、24、48或72小時(shí)，并在端粒酶試驗(yàn)中測(cè)試。如表5所示，反應(yīng)混合物在室溫下保持穩(wěn)定至少可達(dá)72小時(shí)。
表5.室溫下反應(yīng)混合物的穩(wěn)定性

實(shí)施例6.完整細(xì)胞中的引物延伸在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中(Dulbecco改良的Eagle養(yǎng)基(DMEM)用10％胎牛血清(FBS)，在37℃，用5％CO2濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱)培養(yǎng)293T細(xì)胞。將細(xì)胞胰蛋白酶消化，用生長(zhǎng)培養(yǎng)基洗滌，以1×106個(gè)細(xì)胞/ml的密度懸浮于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，并接受以下之一的處理處理A將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移入無(wú)菌離心管中，在Beckman GS-6R離心機(jī)中以800rpm離心5分鐘，重懸浮于磷酸緩沖鹽水(PBS)中。將重懸浮細(xì)胞通過(guò)25-規(guī)格(25-gauge)針頭引入無(wú)菌1ml注射器中，然后通過(guò)活塞的穩(wěn)定壓力排出。重復(fù)五次注射器操作。以1×104個(gè)細(xì)胞/管將細(xì)胞轉(zhuǎn)移入無(wú)菌離心管中并加入轉(zhuǎn)移基質(zhì)(2.5mM dNTP和0.1％牛血清白蛋白(BSA))，用或不用TS引物。將細(xì)胞在37℃培養(yǎng)60分鐘。將管在4℃離心20分鐘，并收集懸浮液。使用Chaps緩沖劑在4℃溶解套膜(pallets)30分鐘。溶解產(chǎn)物在4℃以14,000rpm離心20分鐘。收集上清液，在95℃加熱10分鐘，并在使用前保存于-70℃。
或者，在注射器操作后以1×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞放置于96孔平板上，并在用5％CO2濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中在37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第二天，用PBS洗滌細(xì)胞并將所需量的轉(zhuǎn)移緩沖劑(PBS和TS引物，0.5μg/孔，dNTP 2.5mM和0.1％BSA；或PBS和dNTP，2.5mM和0.1％BSA；或只有PBS)加入每個(gè)孔中。在37℃培養(yǎng)30分鐘、60分鐘，和過(guò)夜后，收集細(xì)胞并用CHAPS緩沖劑在4℃溶解30分鐘。在14,000rpm離心溶解產(chǎn)物。收集上清液，在95℃加熱10分鐘，并在使用前保存于-70℃。
處理B將細(xì)胞懸浮液直接接種于96孔平板中，培養(yǎng)過(guò)夜，并用所需量TS引物和dNTP使用磷酸鈣沉淀轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)短地說(shuō)，293T細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(DMEM和10％FBS)中生長(zhǎng)過(guò)夜。在轉(zhuǎn)染前3小時(shí)用新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基替換生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在TS引物和dNTP(HBS 100μl，磷酸鹽(phospate)2μl，H2O 26μl，載體DNA 10μl，第一引物20μl，0.25mMdNTP，12μl鈣)存在下形成磷酸鈣沉淀(使用來(lái)自GIBCO的磷酸鈣試劑盒)并加入細(xì)胞。細(xì)胞在37℃培養(yǎng)10、30，和60分鐘，用CHAPS溶解緩沖劑在4℃溶解30分鐘。將溶解產(chǎn)物在100℃加熱10分鐘并在14,000rpm離心20分鐘。收集上清液并保存于-70℃。
將來(lái)自處理A或B的一微升溶解產(chǎn)物和11.5μl水以及12.5μl預(yù)混物混合，預(yù)混物含有dNTPs(每種核苷三磷酸2.5mM)、0.25單位DNA聚合酶、0.25μgACX引物，并接受定量實(shí)時(shí)PCR(95℃10分鐘，95℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，進(jìn)行35-40個(gè)循環(huán))。圖8所示的結(jié)果表明了如所述處理A中用TS引物和dNTP培養(yǎng)一小時(shí)后293T細(xì)胞中的端粒酶活性是可檢測(cè)的。圖9所示的結(jié)果表明了如所述處理B中用含有TS引物和dNTP的磷酸鈣沉淀物培養(yǎng)30分鐘后293T細(xì)胞中的端粒酶活性是可檢測(cè)的。沒(méi)有使用TS引物的沒(méi)有檢測(cè)到端粒酶活性，這表明檢測(cè)的產(chǎn)物是端粒酶特異性的。
盡管已經(jīng)詳細(xì)描述優(yōu)選實(shí)施方案及其優(yōu)勢(shì)，在此還可以作出各種改變、替代和變更而不脫離權(quán)利要求限定的組合物和方法的范圍，且它們等價(jià)的內(nèi)容均類(lèi)歸于權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
序列表<110>聯(lián)合生物技術(shù)公司<120>檢測(cè)端粒酶活性的方法和組合物<130>150451<160>4<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>6<212>DNA<213>同種(Homo sapiens)<400>1ttaggg 6<210>2<211>68<212>DNA<213>人造的<220>
<223>人造對(duì)照模板<400>2aatccgtcga gcagagttag ggttagggtt agggttaggg ttagggttag ggttagggtt60agggttag 68<210>3<211>18<212>DNA<213>人造的<220>
<223>端粒酶底物和PCR引物<400>3aatccgtcga gcagagtt 18<210>4<211>30<212>DNA<213>人造的<220>
<223>PCR引物<400>4gcgcggctta cccttaccct taccctaacc 30
權(quán)利要求
1.檢測(cè)和定量生物樣品中端粒酶活性的方法，該方法包括步驟將生物樣品加入反應(yīng)管中，所述反應(yīng)管含有包括第一引物和核苷三磷酸的第一反應(yīng)混合物；包括第二引物和DNA聚合酶的第二反應(yīng)混合物；和分隔反應(yīng)管中第一反應(yīng)混合物和第二反應(yīng)混合物的蠟層；在適于端粒酶從第一引物產(chǎn)生延伸產(chǎn)物的條件下用第一反應(yīng)混合物培養(yǎng)生物樣品，所述延伸產(chǎn)物具有3’端；通過(guò)熔化蠟層混合延伸產(chǎn)物和第二反應(yīng)混合物；在從單個(gè)293T細(xì)胞檢測(cè)端粒酶活性的條件下使用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增延伸產(chǎn)物；和使用對(duì)照模板定量擴(kuò)增的延伸產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中以細(xì)胞或組織提取物的形式加入生物樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)通過(guò)使用與第一和第二引物之間的序列結(jié)合的熒光標(biāo)記探針寡核苷酸來(lái)定量。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在擇優(yōu)結(jié)合雙鏈DNA的熒光染料存在下進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中第二引物是單標(biāo)記的熒光引物，當(dāng)該熒光引物引入雙鏈聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物中時(shí)產(chǎn)生增加量的熒光發(fā)射。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括通過(guò)聚腺苷酸化和連接反應(yīng)之一在3’端延長(zhǎng)延伸產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中對(duì)照模板具有SEQ ID NO2所述的核苷酸序列。
8.檢測(cè)和定量樣品細(xì)胞中端粒酶活性的方法，該方法包括以下步驟將第一引物和核苷三磷酸引入樣品細(xì)胞中；在適于端粒酶從第一引物產(chǎn)生延伸產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)樣品細(xì)胞；使用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增延伸產(chǎn)物；和使用對(duì)照模板定量擴(kuò)增的延伸產(chǎn)物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其進(jìn)一步包括用溶解緩沖劑溶解樣品細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中通過(guò)磷酸鈣沉淀將第一引物和核苷三磷酸引入樣品細(xì)胞中。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中通過(guò)以下操作將第一引物和核苷三磷酸引入樣品細(xì)胞中，該操作包括將細(xì)胞穿過(guò)針頭至少一次；和在含有第一引物和核苷三磷酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在擇優(yōu)結(jié)合雙鏈DNA的熒光染料存在下進(jìn)行。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在第二引物存在下進(jìn)行，其中第二引物是熒光引物，當(dāng)將熒光引物引入雙鏈聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物中時(shí)產(chǎn)生增加量的熒光發(fā)射。
14.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中對(duì)照模板具有SEQ ID NO2所述的核苷酸序列。
15.檢測(cè)和定量生物樣品中端粒酶活性的方法，該方法包括以下步驟將生物樣品加入反應(yīng)管中，該反應(yīng)管含有包括第一引物和核苷三磷酸的第一反應(yīng)混合物；包括第二引物和DNA聚合酶的第二反應(yīng)混合物；和分隔反應(yīng)管中第一反應(yīng)混合物和第二反應(yīng)混合物的蠟層；在適于端粒酶從第一引物產(chǎn)生延伸產(chǎn)物的條件下用第一反應(yīng)混合物培養(yǎng)生物樣品，所述延伸產(chǎn)物；通過(guò)聚腺苷酸化和連接反應(yīng)之一在3’端延長(zhǎng)所述延伸產(chǎn)物；通過(guò)熔化蠟層混合延伸產(chǎn)物和第二反應(yīng)混合物；在從單個(gè)293T細(xì)胞檢測(cè)端粒酶活性的條件下使用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增延伸產(chǎn)物；和使用對(duì)照模板定量擴(kuò)增的延伸產(chǎn)物，其中第二引物包括與延長(zhǎng)的延伸產(chǎn)物3’端核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
16.用于檢測(cè)端粒酶活性的試劑盒，該試劑盒包括反應(yīng)管，其包括包括第一引物和核苷三磷酸的第一反應(yīng)混合物；包括第二引物和DNA聚合酶的第二反應(yīng)混合物；和分隔反應(yīng)管中第一反應(yīng)混合物和第二反應(yīng)混合物的蠟層；和對(duì)照管，其含有第一反應(yīng)混合物；包括第二引物、對(duì)照模板，和DNA聚合酶的第三反應(yīng)混合物；和分隔對(duì)照管中第一反應(yīng)混合物和第三反應(yīng)混合物的蠟層。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中對(duì)照模板具有SEQ IDNO2所述的核苷酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，其進(jìn)一步含有包括(a)DNA聚合酶或(b)連接酶和寡核苷酸的延長(zhǎng)混合物。
19.用于檢測(cè)端粒酶活性的試劑盒，該試劑盒包括用于溶解樣品細(xì)胞的溶解緩沖劑；反應(yīng)緩沖劑，其包括第一引物；核苷三磷酸；第二引物；和DNA聚合酶；和對(duì)照模板，其包括SEQ ID NO2所述核苷酸序列或與SEQ ID NO2所述核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
20.監(jiān)控用抑制端粒酶活性的試劑治療患者的有效性的方法，所述方法包括在試劑給藥之前從患者獲得給藥前的樣品；測(cè)定給藥前樣品中的端粒酶活性水平；從患者獲得一個(gè)或多個(gè)給藥后的樣品；測(cè)定給藥后樣品中的端粒酶活性水平；和比較給藥前樣品中的端粒酶活性水平與給藥后樣品中的端粒酶活性水平。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)端粒酶活性的方法，該方法使用引物延伸，隨后進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR定量。本發(fā)明的方法提供了快速、靈敏和準(zhǔn)確測(cè)定生物樣品中的端粒酶活性的方法。一實(shí)施方案中，該方法包括如下步驟將生物樣品加入反應(yīng)管中，該反應(yīng)管含有包括第一引物和核苷三磷酸的第一反應(yīng)混合物，包括第二引物和DNA聚合酶的第二反應(yīng)混合物，和分隔第一反應(yīng)混合物和第二反應(yīng)混合物的蠟層；用第一反應(yīng)混合物培養(yǎng)生物樣品；將延伸產(chǎn)物和第二反應(yīng)混合物混合；使用實(shí)時(shí)PCR和對(duì)照模板擴(kuò)增和定量延伸產(chǎn)物。另一實(shí)施方案中，檢測(cè)方法包括原位引物延伸步驟，使延伸產(chǎn)物在完整細(xì)胞中產(chǎn)生。該實(shí)施方案中，在合適的條件下可以在完成定量步驟之前將延伸產(chǎn)物保存延長(zhǎng)的時(shí)間。
文檔編號(hào)C12Q1/48GK1732271SQ200380107388
公開(kāi)日2006年2月8日 申請(qǐng)日期2003年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月12日
發(fā)明者李莊武, 包駿, 毛華, 馬文彬, 李麗娜 申請(qǐng)人:美國(guó)聯(lián)合生物公司