一種酶法制備魷魚皮膠原蛋白肽的工藝方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種制備魷魚皮膠原蛋白肽的工藝方法，尤其是涉及一種酶法制備魷 魚皮膠原蛋白肽的工藝方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著我國水產(chǎn)品加工業(yè)的迅猛發(fā)展，加工過程中產(chǎn)生大量的廢棄物，包括魚皮、魚 鱗和魚骨等，約占魚體總重的50~70 %。但是水產(chǎn)品原料利用率低，大量水產(chǎn)品邊角料和廢 棄料被加工成飼料，沒有進行精深加工，造成資源的極大浪費，更嚴重的是導致環(huán)境污染。 同時，水產(chǎn)加工原料利用率低、高附加值產(chǎn)品稀少等成為了水產(chǎn)加工業(yè)面臨的最為突出的 問題，嚴重限制了水產(chǎn)加工業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈的延伸和可持續(xù)發(fā)展。
[0003] 水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物膠原含量很高，且與陸生動物來源的膠原蛋白相比，水產(chǎn)膠原 蛋白具有更高的安全性。膠原蛋白肽在消化、吸收、營養(yǎng)等方面具有很多優(yōu)勢，且由于活性 中心的暴露而具有很多獨特的生理活性，如抗氧化、抗過敏、抗腫瘤、抗衰老、預防關(guān)節(jié)炎、 降血壓、促進傷口愈合、促進皮膚膠原代謝、免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能。當前，膠原蛋白肽已 經(jīng)被廣泛的用于食品、生物醫(yī)藥及美容化妝品、飼料添加劑以及其他領域。
[0004] 膠原蛋白肽的研究與開發(fā)已成為近年來的熱點，如何快速高效的提取純化膠原蛋 白肽成為關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種酶法制備魷魚皮膠原蛋白肽的工藝方法，通過該工藝方法可以 得到較好品質(zhì)的膠原蛋白肽產(chǎn)品。
[0006] -種酶法制備魷魚皮膠原蛋白肽的工藝方法，原料魷魚皮預處理后，先經(jīng)堿性蛋 白酶水解后，再經(jīng)復合蛋白酶繼續(xù)水解得到膠原蛋白水解液，其中，復合蛋白酶由木瓜蛋白 酶與風味蛋白酶組成。
[0007] 作為優(yōu)選，原料預處理的步驟為：將魷魚皮解凍清洗干凈，用0.5 %NaOH溶液浸泡 12h，清水洗凈之后，切碎，真空包裝后貯藏于-20°c冰箱。
[0008] 作為優(yōu)選，堿性蛋白酶的加酶量為0.2~0.4%，堿性蛋白酶水解pH為9.5~10.5， 堿性蛋白酶水解溫度為47.5~52.5°C，堿性蛋白酶水解時間為3~δΙ^ρΗ、酶解時間、酶解溫 度、蛋白酶加酶量對酶解液抗氧化活性、酶解液水解度、多肽轉(zhuǎn)化率均會產(chǎn)生不同影響。
[0009] 作為優(yōu)選，復合蛋白酶中，木瓜蛋白酶與風味蛋白酶的質(zhì)量比為1:0.5~3。木瓜蛋 白酶與風味蛋白酶的質(zhì)量比不同，其酶解液抗氧化活性、水解度、多肽轉(zhuǎn)化率均會有所不 同。
[0010] 作為優(yōu)選，復合蛋白酶的加酶量為0.2~0.4%，復合蛋白酶水解pH為7~8,復合蛋 白酶水解溫度為50~55°C，復合蛋白酶水解時間為2~5h <φΗ、酶解時間、酶解溫度、蛋白酶 加酶量對酶解液抗氧化活性、酶解液水解度、多肽轉(zhuǎn)化率均會產(chǎn)生不同影響。
[0011] 作為優(yōu)選，先用0.3%堿性蛋白酶在pH 10.5、溫度47.5°C條件下水解4h，再用 ο. 4 %復合蛋白酶在pH 7.5、溫度50 °C的條件下繼續(xù)水解4.5h，復合蛋白酶中，木瓜蛋白酶 與風味蛋白酶的質(zhì)量比為1:2。結(jié)果酶解液的水解度可達28.89%、DPPH清除率為88.24%， 多肽轉(zhuǎn)化率為49.74%，同時84.56%的膠原蛋白肽分子量分布介于180Da~2000Da之間，可 以得到較好品質(zhì)的膠原蛋白肽產(chǎn)品。
[0012]作為優(yōu)選，水解后得到的膠原蛋白水解液經(jīng)活性炭過濾后，經(jīng)過超濾、二級納濾膜 過濾后，再經(jīng)過反滲透納濾，最后經(jīng)過噴霧干燥得到分級的膠原蛋白肽粉。膠原蛋白水解液 經(jīng)活性炭過濾后，經(jīng)過超濾，其主要除去活性炭、大分子、懸浮物等雜質(zhì)，二級納濾膜過濾， 其主要用于膠原蛋白肽的分子量分級，根據(jù)不同需要，可將絕大多數(shù)的膠原蛋白肽集中在 某一分子量區(qū)間，更易于人體的吸收;再經(jīng)過反滲透納濾，其用于產(chǎn)品的脫鹽與濃縮，在常 溫下，使得膠原蛋白肽成為低鹽母液，并可同時濃縮膠原蛋白肽;最后經(jīng)過噴霧干燥得到分 級的膠原蛋白肽粉。
[0013]本發(fā)明工藝條件下制備得到的膠原蛋白肽產(chǎn)品，不僅水解度、DPPH清除率、多肽轉(zhuǎn) 化率等均較為理想，而且97.63 %膠原蛋白肽分子量小于2000Da，具有較好的品質(zhì)和較高的 利用價值;本發(fā)明對魷魚皮膠原蛋白肽后期進一步的分離純化及應用具有較高的的理論指 導意義。
【附圖說明】
[0014] 圖1是本發(fā)明的工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0015] 下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明所要保護的范圍并 不限于此。
[0016] 材料與試劑
[0017] 魷魚皮:購于舟山魷魚加工廠，清洗瀝干后貯藏于-20 °C冰箱。
[0018] 堿性蛋白酶（2.4AU/g)、風味蛋白酶（500LAPU/g):諾維信公司；木瓜蛋白酶 (200000U/g):廣西南寧龐博生物工程有限公司;Gly-Gly-Tyr-Arg:Sigma公司；二苯代苦味 ?；杂苫?DPPH)、硫酸銅、濃硫酸、硫酸鉀、茚三酮、果糖、甘氨酸、三氯乙酸、無水乙醇、氫 氧化鈉、濃鹽酸等均為分析純。
[0019] 儀器與設備
[0020] HH2型數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海嘉鵬科技有 限公司；UV-2550紫外可見分光光度計：日本SMMADZU公司；FD1.0-60型冷凍干燥機:丹麥 Heto公司；臺式冷凍高速離心機：美國Thermo Scientific公司；Milli_Q超純水裝置:美國 MILLIP0RE公司；Kjeltec 2300全自動凱氏定氮儀:瑞典F0SS公司;Waters 600高效液相色 譜儀，美國Waters公司；DELTA 320pH計：瑞士METTLER TOLEDO公司；J0YN-8000T噴霧干燥 機:上海喬躍實業(yè)有限公司。
[0021] 參照圖1，一種酶法制備魷魚皮膠原蛋白肽的工藝方法，原料魷魚皮預處理后，先 經(jīng)堿性蛋白酶水解后，再經(jīng)復合蛋白酶繼續(xù)水解得到膠原蛋白水解液，其中，復合蛋白酶由 木瓜蛋白酶與風味蛋白酶組成。
[0022] 具體步驟如下：
[0023] 原料預處理
[0024] 將魷魚皮解凍清洗干凈，用0.5%Na0H溶液浸泡12h，去除魷魚皮上的雜蛋白。清水 洗凈之后，切碎，真空包裝后貯藏于_20°C冰箱，用于后期試驗。
[0025] 酶解過程
[0026] 取20g魷魚皮置于錐形瓶中，按1:4(質(zhì)量比）的比例加水，調(diào)節(jié)至合適pH，按適當?shù)?比例添加蛋白酶，封住瓶口后置于水浴鍋中磁力攪拌水解一定時間，取出置沸水中滅酶 lOmin，冷卻搖勻后離心（4000r/min，lOmin)，得到膠原蛋白水解液，貯藏于4°C冰箱;其中， 添加蛋白酶的過程為:先經(jīng)一定量(0.2~0.4% )的堿性蛋白酶在一定pH(9.5~10.5)及溫 度條件(47.5~52.5°C )下水解一段時間（3~5h)后，再經(jīng)一定量(0.2~0.4% )的復合蛋白 酶在一定pH(7~8)及溫度條件(50~55°C)下繼續(xù)水解一段時間（2~5h)得到膠原蛋白水解 液，其中，復合蛋白酶由木瓜蛋白酶與風味蛋白酶組成，木瓜蛋白酶與風味蛋白酶的質(zhì)量比 為1:0.5~3。即風味蛋白酶與木瓜蛋白酶在堿性蛋白酶酶解液基礎上進行。
[0027]膠原蛋白水解液經(jīng)活性炭過濾后，經(jīng)過超濾，其主要除去活性炭、大分子、懸浮物 等雜質(zhì)，二級納濾膜過濾，其主要用于膠原蛋白肽的分子量分級，根據(jù)不同需要，可將絕大 多數(shù)的膠原蛋白肽集中在某一分子量區(qū)間，更易于人體的吸收;再經(jīng)過反滲透納濾，其用于 產(chǎn)品的脫鹽與濃縮，在常溫下，使得膠原蛋白肽成為低鹽母液，并可同時濃縮膠原蛋白肽； 最后經(jīng)過噴霧干燥得到分級的膠原蛋白肽粉。
[0028]水解度的測定
[0029]總氮的測定:凱氏定氮法，參照GB 5009.5-2010《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì) 的測定》；
[0030]游離氨基氮的測定:取O.lOOOg干燥過的甘氨酸定容至100mL，取此液分別稀釋成2 μ g/mL~2 0 yg/mL的溶液用于標準曲線繪制。取2mL稀釋液加入1. OmL諱三酮顯色齊丨」，搖勾后 于沸水浴中加熱15min，冷卻后加入5mL 40%乙醇溶液混勾，靜置1