本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種白芨組培苗培養(yǎng)基及其制備方法。

背景技術(shù)：

白芨為蘭科植物，喜溫暖、陰涼和較陰濕的環(huán)境，不耐寒。常常在丘陵和低山地區(qū)的溪河兩岸、山坡草叢中及疏林下。以塊莖供藥用，能收斂止血，消腫生??；治肺結(jié)核咳血，支氣管擴(kuò)張咯血等癥。外用治外傷出血、燒燙傷、手足皸裂等癥。在生物醫(yī)藥、保健食品、紡織印染、特種涂料和日用化工等方面有巨大的商業(yè)利用價值。隨著白芨食品的開發(fā)利用和印染業(yè)、美容業(yè)的需求，白芨用量日趨增多，人們長年無節(jié)制采挖，加上白芨本身自然繁殖率低，導(dǎo)致資源日漸枯竭?，F(xiàn)已列入《瀕危動植物種國際貿(mào)易公約》予以保護(hù)。因此，采用現(xiàn)代生物技術(shù)，通過大量、快速克隆繁殖白芨種苗，并開展人工種植，對保護(hù)、開發(fā)和可持續(xù)利用這一名貴中藥具有重大的社會意義和經(jīng)濟(jì)效益。

現(xiàn)有組培技術(shù)中，對白芨的組培方面報道不多，且大多數(shù)相關(guān)報道針對外植體原球莖進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖、分化、生根等，對白芨組培中鱗球莖誘導(dǎo)方面的報道甚少。傳統(tǒng)白芨栽培方面主要利用野生資源分株繁殖，由于野生資源瀕危滅絕且分株繁殖易導(dǎo)致種源退化和病毒感染，通過克隆組培技術(shù)快速繁殖白芨種苗是人工栽培必須解決的問題。而組培苗的鱗球莖將直接影響馴化移栽成活率，因此在白芨組培過程中誘導(dǎo)鱗球莖對提高其移栽成活率及資源保護(hù)具有非常重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種白芨組培苗鱗球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其制備方法， 該誘導(dǎo)培養(yǎng)基能實現(xiàn)白芨苗在組培時形成鱗球莖，通過此方法，提高白芨組培苗的馴化移栽成活率，解決了傳統(tǒng)的栽培技術(shù)中繁殖系數(shù)低、種源退化的問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種白芨組培苗鱗球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于：包括MS+白糖20～50g/L+卡拉膠5.5～10g/L+BA0.2～5mg/L+NAA0.1～2.5mg/L+IBA0.3～1.0mg/L+ZT0.1～4mg/L+CCC2.0～10.0mg/L+土豆汁20～50ml/L+香蕉泥25～60ml/L。在本發(fā)明的白芨組培苗鱗球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每升MS培養(yǎng)基中含有的組分及各組分的重量如下：NH₄NO₃1650mg、KNO₃1900mg、CaCl₂·2H₂O 440mg、MgSO₄·7H₂O 370mg、KH₂PO₄170mg、KI 0.83mg、H₃BO₃6.2mg、MnSO₄·H₂O 16.9mg、ZnSO₄·7H₂O 8.6mg、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg、CuSO₄·5H2O 0.025mg、CoCl2·6H2O 0.025mg、FeSO4·7H2O 27.8mg、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg、肌醇100mg、煙酸0.5mg、鹽酸吡哆鋅(VB6)0.5mg、鹽酸硫胺素(VB1)0.1mg、甘氨酸2mg。

上述白芨組培苗鱗球莖誘導(dǎo)的培養(yǎng)基的制備方法包括以下步驟：

(1)將白糖和卡拉膠進(jìn)行預(yù)處理：分別將白糖和卡拉膠按照比例稱量再加入10倍質(zhì)量的蒸餾水溶解，靜置1.5～3小時；

(2)MS培養(yǎng)基母液的配制，包括母液1、母液2、母液3、母液4、母液5母液6、母液7和母液8的配制，其中：

母液1的配制：稱取85g KH₂PO₄置于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，定容?000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液2的配制：稱取950g KNO₃置于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓ㄈ葜?000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液3的配制：稱取825g NH₄NO₃置于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓ㄈ葜?000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液4的配制：185g MgSO₄·7H₂O置于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓? 容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液5的配制：稱取220g CaCl₂·2H₂O置于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，定容?000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液6的配制：分別稱量8.3g KI、6.2g H₃BO₃、16.9g MnSO₄·H₂O、8.6g ZnSO₄·7H₂O、0.25g Na₂MoO₄·2H₂O、0.025g CuSO₄·5H₂O和0.025g CoCl₂·6H₂O，加入燒杯中溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液7的配制：分別稱量100g肌醇、0.5g煙酸、0.5g鹽酸吡哆醇(VB6)0.5mg、鹽酸硫胺素(VB1)0.1g和2g甘氨酸，加入燒杯中溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液8的配制：稱量27.8g FeSO₄·7H₂O、37.3g Na₂-EDTA·2H₂O分別加入1000ml蒸餾水溶解，然后將兩種溶液混合，加熱并煮沸8分鐘，并不斷攪拌，使兩種溶液充分螯合，再定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；

(3)將預(yù)處理的白糖和卡拉膠水溶液、10ml/L母液1、母液2、母液3、母液4、母液5；5ml/L母液6、母液7、母液8分別倒入灌裝機(jī)中，再按比例分別加入BA、NAA、IBA、ZT、CCC、土豆汁、香蕉泥。加水定容，調(diào)節(jié)pH值至5.8，并攪拌20min后灌裝，其中，灌裝時間為1.5s，間歇時間為0.7s。將罐裝好的營養(yǎng)液在122℃、0.16MPa的條件下滅菌20分鐘，取出冷凝后制得該培養(yǎng)基。

本發(fā)明白芨組培苗鱗球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基通過采用特定含量的MS培養(yǎng)基BA、NAA、IBA、ZT、CCC、土豆汁及香蕉泥的協(xié)同調(diào)節(jié)作用，經(jīng)該誘導(dǎo)培養(yǎng)基不僅為白芨的組培提供豐富的營養(yǎng)元素，并且?guī)缀?00％的白芨苗在組培過程組中形成鱗球莖，且該鱗球莖均比黃豆粒大，具有鱗球莖的組培苗馴化移栽成活率提高到95％以上，且植株變異率低，植株結(jié)構(gòu)完整健壯度好。并且通過組培技術(shù) 不受自然條件影響顯著提高其繁殖系數(shù)，從而大大提高白芨的經(jīng)濟(jì)價值。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述，但它們不是對本發(fā)明的進(jìn)一步限制。

實施例1

該白芨組培苗鱗球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：MS+白糖30g/L+卡拉膠7g/L+BA0.3mg/L+NAA1.0mg/L+IBA0.4mg/L+ZT0.1mg/L+CCC4.0mg/L+土豆汁40ml/L+香蕉泥30ml/L。其中，MS基本培養(yǎng)基的配方為：每升培養(yǎng)基中含有的組分的含量如下：

NH₄NO₃1650mg、KNO₃1900mg、CaCl₂·2H₂O 440mg、MgSO₄·7H₂O 370mg、KH₂PO₄170mg、KI 0.83mg、H₃BO₃6.2mg、MnSO₄·H₂O 16.9mg、ZnSO₄·7H₂O 8.6mg、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg、CuSO₄·5H₂O 0.025mg、CoCl₂·6H₂O 0.025mg、FeSO₄·7H₂O 27.8mg、Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg、肌醇100mg、煙酸0.5mg、鹽酸吡哆醇0.5mg、鹽酸硫胺素0.1mg、甘氨酸2mg。

上述白芨組培苗鱗球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制過程為：

(1)、首先將白糖和卡拉膠進(jìn)行預(yù)處理：分別將白糖和卡拉膠按照比例稱量再加入10倍質(zhì)量的蒸餾水溶解，靜置2小時；

(2)、MS基本培養(yǎng)基母液的配制：包括母液1、母液2、母液3、母液4、母液5、母液6、母液7和母液8的配制，其中

母液1的配制：稱取85g KH₂PO₄置于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，定容?000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液2的配制：稱取950g KNO₃置于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓ㄈ葜?000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液3的配制：稱取825g NH₄NO₃置于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，定容?000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液4的配制：185g MgSO₄·7H₂O置于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，定容?000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液5的配制：稱取220g CaCl₂·2H₂O置于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，定容?000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液6的配制：分別稱量8.3g KI、6.2g H₃BO₃、16.9g MnSO₄·H₂O、8.6g ZnSO₄·7H₂O、0.25g Na₂MoO₄·2H₂O、O.025g CuSO₄·5H₂O和0.025g CoCl₂·6H₂O，加入燒杯中溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液7的配制：分別稱量100g肌醇、0.5g煙酸、0.5g鹽酸吡哆醇(VB6)0.5mg、鹽酸硫胺素(VB1)0.1g和2g甘氨酸，加入燒杯中溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液8的配制：稱量27.8g FeSO₄·7H₂O、37.3g Na₂-EDTA·2H₂O分別加入1000ml蒸餾水溶解，然后將兩種溶液混合，加熱并煮沸8分鐘，并不斷攪拌，使兩種溶液充分螯合，再定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；

(3)、將預(yù)處理的白糖和卡拉膠水溶液、10ml/L母液1、母液2、母液3、母液4、母液5；5ml/L母液6、母液7、母液8分別倒入灌裝機(jī)中，再分別加入BA 0.3mg/L、NAA1.0mg/L、IBA0.4mg/L、ZT0.1mg/L、CCC4.0mg/L、土豆汁40ml/L、香蕉泥30ml/L。加水定容，調(diào)節(jié)pH值至5.8，并攪拌20min后灌裝，其中，灌裝時間為1.5s，間歇時間為0.7s。將罐裝好的營養(yǎng)液在122℃、0.16MPa的條件下滅菌20分鐘，取出冷凝后制得該培養(yǎng)基。

實施例2

該白芨組培苗鱗球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：MS+白糖20g/L+卡拉膠 7.5g/L+BA0.5mg/L+NAA1.5mg/L+IBA1.0mg/L+ZT0.6mg/L+CCC2.0mg/L+土豆汁30ml/L+香蕉泥40ml/L。其中，MS基本培養(yǎng)基的配方為：每升培養(yǎng)基中含有的組分的含量如下：

NH₄NO₃1650mg、KNO₃1900mg、CaCl₂·2H₂O 440mg、MgSO₄·7H₂O 370mg、KH₂PO₄170mg、KI 0.83mg、H₃BO₃6.2mg、MnSO₄·H₂O 16.9mg、ZnSO₄·7H₂O 8.6mg、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg、CuSO₄·5H₂O 0.025mg、CoCl₂·6H₂O 0.025mg、FeSO₄·7H₂O 27.8mg、Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg、肌醇100mg、煙酸0.5mg、鹽酸吡哆醇0.5mg、鹽酸硫胺素0.1mg、甘氨酸2mg。

上述白芨組培苗鱗球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制過程為：

(1)、將白糖和卡拉膠進(jìn)行預(yù)處理：分別將白糖和卡拉膠按照比例稱量再加入10倍質(zhì)量的蒸餾水溶解，靜置2小時；

(2)、MS基本培養(yǎng)基母液的配制：包括母液1、母液2、母液3、母液4、母液5、母液6、母液7和母液8的配制，其中

母液1的配制：稱取85g KH₂PO₄置于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，定容?000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液2的配制：稱取950g KNO₃置于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，定容?000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液3的配制：稱取825g NH₄NO₃置于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓ㄈ葜?000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液4的配制：185g MgSO₄·7H₂O置于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，定容?000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液5的配制：稱取220g CaCl₂·2H₂O置于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，定容?000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液6的配制：分別稱量8.3g KI、6.2g H₃BO₃、16.9g MnSO₄·H₂O、8.6g ZnSO₄·7H₂O、0.25_g Na₂MoO₄·2H₂O、0.025g CuSO₄·5H₂O和0.025g CoCl₂·6H₂O，加入燒杯中溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液7的配制：分別稱量100g肌醇、0.5g煙酸、0.5g鹽酸吡哆醇(VB6)0.5mg、鹽酸硫胺素(VB1)0.1g和2g甘氨酸，加入燒杯中溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液8的配制：稱量27.8g FeSO₄·7H₂O、37.3g Na₂-EDTA·2H₂O分別加入1000ml蒸餾水溶解，然后將兩種溶液混合，加熱并煮沸8分鐘，并不斷攪拌，使兩種溶液充分螯合，再定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；

(3)、將預(yù)處理的白糖和卡拉膠水溶液、10ml/L母液1、母液2、母液3、母液4、母液5；5ml/L母液6、母液7、母液8分別倒入灌裝機(jī)中，再分別加入BA0.5mg/L、NAA1.5mg/L、IBA1.0mg/L、ZT0.6mg/L、CCC2.0mg/L、土豆汁30ml/L、香蕉泥40ml/L。加水定容，調(diào)節(jié)pH值至5.8，并攪拌20min后灌裝，其中，灌裝時間為1.5s，間歇時間為0.7s。將罐裝好的營養(yǎng)液在122℃、0.16MPa的條件下滅菌20分鐘，取出冷凝后制得該培養(yǎng)基。

實施例3

該白芨組培苗鱗球莖導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：MS+白糖40g/L+卡拉膠8.5g/L+BA2.0mg/L+NAA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+ZT3.0mg/L+CCC8.0mg/L+土豆汁50ml/L+香蕉泥60ml/L。其中，MS基本培養(yǎng)基的配方為：每升培養(yǎng)基中含有的組分的含量如下：

NH₄NO₃1650mg、KNO₃1900mg、CaCl₂·2H₂O 440mg、MgSO₄·7H₂O 370mg、KH₂PO₄170mg、KI 0.83mg、H₃BO₃6.2mg、MnSO₄·H₂O 16.9mg、ZnSO₄·7H₂O 8.6mg、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg、CuSO₄·5H₂O 0.025mg、CoCl₂·6H₂O 0.025mg、FeSO₄·7H₂O 27.8mg、 Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg、肌醇100mg、煙酸0.5mg、鹽酸吡哆醇0.5mg、鹽酸硫胺素0.1mg、甘氨酸2mg。

上述白芨組培苗鱗球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制過程為：

(1)、將白糖和卡拉膠進(jìn)行預(yù)處理：分別將白糖和卡拉膠按照比例稱量再加入10倍質(zhì)量的蒸餾水溶解，靜置2小時；

(2)、MS基本培養(yǎng)基母液的配制：包括母液1、母液2、母液3、母液4、母液5、母液6、母液7和母液8的配制，其中

母液1的配制：稱取85g KH₂PO₄置于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓ㄈ葜?000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液2的配制：稱取950g KNO₃置于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓ㄈ葜?000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液3的配制：稱取825g NH₄NO₃置于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓ㄈ葜?000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液4的配制：185g MgSO₄·7H₂O置于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，定容?000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液5的配制：稱取220g CaCl₂·2H₂O置于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，定容?000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液6的配制：分別稱量8.3g KI、6.2g H₃BO₃、16.9g MnSO₄·H₂O、8.6g ZnSO₄·7H₂O、0.25g Na₂MoO₄·2H₂O、0.025g CuSO₄·5H₂O和0.025g CoCl₂·6H₂O，加入燒杯中溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液7的配制：分別稱量100g肌醇、0.5g煙酸、0.5g鹽酸吡哆醇(VB6)0.5mg、鹽酸硫胺素(VB1)0.1g和2g甘氨酸，加入燒杯中溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；

母液8的配制：稱量27.8g FeSO₄·7H₂O、37.3g Na₂-EDTA·2H₂O分別加入1000ml蒸餾水溶解，然后將兩種溶液混合，加熱并煮沸8分鐘，并不斷攪拌，使兩種溶液充分螯合，再定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；

(3)、將預(yù)處理的白糖和卡拉膠水溶液、10ml/L母液1、母液2、母液3、母液4、母液5；5ml/L母液6、母液7、母液8分別倒入灌裝機(jī)中，再分別加入BA2.0mg/L、NAA2.0mg/L、IBA0.5mg/L、ZT3.0mg/L、CCC8.0mg/L、土豆汁50ml/L、香蕉泥60ml/L。加水定容，調(diào)節(jié)pH值至5.8，并攪拌20min后灌裝，其中，灌裝時間為1.5s，間歇時間為0.7s。將罐裝好的營養(yǎng)液在122℃、0.16MPa的條件下滅菌20分鐘，取出冷凝后制得該培養(yǎng)基。

試驗例

選取湖北紫花三叉巨莖白芨蒴果作為外植體培養(yǎng)誘導(dǎo)形成圓球莖，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)及增殖培養(yǎng)后，得到叢生芽，將生長2cm高度的叢生芽接種于本發(fā)明實施例1制備的白芨組培苗鱗球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，采用28瓦T5白熾燈燈管作為光源，光照強(qiáng)度為2500lx，在光照溫度為25℃黑暗溫度為20℃，培養(yǎng)室空氣濕度為40％，光照時間11小時/天的條件下，培養(yǎng)80天，進(jìn)行誘導(dǎo)鱗球莖，采用該培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)后，幾乎100％的白芨苗在組培瓶中形成鱗球莖，且該鱗球莖均比黃豆粒大，具有鱗球莖的組培苗馴化移栽成活率提高到95％以上，且植株變異率低，植株結(jié)構(gòu)完整健壯度好。

雖然結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行了詳細(xì)地描述，但并非是對本專利保護(hù)范圍的限定。在權(quán)利要求書所限定的范圍內(nèi)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員不經(jīng)創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或調(diào)整仍受本專利的保護(hù)。