本發(fā)明涉及到一種抑制酒精發(fā)酵過程中污染微生物的方法。該方法特指采用月桂酰精氨酸乙酯（英文名：lauramide arginine ethyl ester）抑制釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）發(fā)酵生產(chǎn)酒精、朗姆酒、黃酒過程中污染的微生物。

背景技術(shù)：

采用釀酒酵母以玉米、甜菜、甘蔗、小麥等農(nóng)作物原料發(fā)酵生產(chǎn)酒精在全球普偏應(yīng)用，其生產(chǎn)過程包括原料的粉碎、蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾。發(fā)酵過程采用的微生物為酵母菌中的釀酒酵母菌屬（Saccharomyces cerevisiae)。發(fā)酵溫度控制在29 ± 1°C，pH值控制在4.2 至4.7，發(fā)酵過程常采用分批發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵中很容易受到細(xì)菌的污染。細(xì)菌的污染不僅會使發(fā)酵液變酸，也會降低酒精的產(chǎn)量。污染的微生物包括枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）等。

工廠采用添加抗菌素抑制細(xì)菌的污染。這些抗生素主要有莫能菌素（Monensin ）和維吉尼亞菌素（Virginiamycin），有時(shí)候也會使用青霉素。

朗姆酒是以甘蔗壓榨出來的糖汁或糖蜜為原料，經(jīng)釀酒酵母發(fā)酵、蒸餾、陳釀而生產(chǎn)的一種蒸餾酒，酒精含量45%左右。發(fā)酵過程中的溫度控制在32±1°C，發(fā)酵時(shí)間通常在6至8小時(shí)，發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)酒精含量通常達(dá)到8.0%至10.0%，蔗糖含量降到2.0%以下。發(fā)酵結(jié)束采用離心沉降的方法將酵母菌從發(fā)酵液中分離出來。分離得到的發(fā)酵液進(jìn)入蒸餾工序。分離出的酵母，采用稀酸溶液調(diào)pH2~2.5保存，作為下批發(fā)酵的菌種。污染微生物會大量產(chǎn)生乳酸，表現(xiàn)在pH下降、酒精產(chǎn)量降低、產(chǎn)品口味改變等不良后果。污染的細(xì)菌主要有發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、蠟狀乙酸細(xì)菌（Bacillus cereus）。工廠采用莫能菌素（Monensin）或維吉尼亞菌素（Virginamicin）控制細(xì)菌的含量，抗生素的殘留會對人的健康產(chǎn)生潛在的影響。

綜上所述，尋找一種安全有效的物質(zhì)用于抑制酒精發(fā)酵或朗姆酒發(fā)酵過程中細(xì)菌的污染具有實(shí)際的意義。

月桂酰精氨酸乙酯是采用精氨酸、乙醇、月桂酸為原料經(jīng)過幾步化學(xué)反應(yīng)而得到的一種陽離子表面活性劑。其CAS編碼為60372-77-2，INS 編碼為243。

月桂酰精氨酸乙酯通過破壞微生物的細(xì)胞膜而具有廣譜抗菌活性。能夠與鹽酸、乳酸、檸檬酸、硫酸、磷酸、抗壞血酸、脂肪酸等形成鹽類。是一種白色粉末，常溫下水中的溶解度24%左右，熔點(diǎn)54 °C左右。在pH3~7的范圍內(nèi)能保持其化學(xué)穩(wěn)定性和抗菌活性。2005年，F(xiàn)DA認(rèn)定為一種GRAS物質(zhì)，最大用量為200ppm。另外，歐洲批準(zhǔn)可以應(yīng)用到化妝品中以及食品中作為抗菌物質(zhì)。

月桂酰精氨酸乙酯在人、動物、自然環(huán)境中分解為脂肪酸、乙醇和氨基酸，是一種環(huán)境友好型物質(zhì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明克服了酒精發(fā)酵過程中采用抗生素抑制污染細(xì)菌方法的不足。所用的物質(zhì)為月桂酰精氨酸乙酯或者它的鹽類，這些鹽類包括其鹽酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、抗壞血酸鹽、乙酸鹽，以及其他脂肪酸鹽。月桂酰精氨酸乙酯或其鹽的使用濃度為10PPM至80PPM。發(fā)酵過程主要為采用谷物、蔗糖、甜菜、馬鈴薯、纖維素等作為原料進(jìn)行的酒精發(fā)酵過程。本發(fā)明利用月桂酰精氨酸乙酯對釀酒酵母與細(xì)菌最低抑菌濃度（MIC）的差異，經(jīng)過研究找到合適濃度能夠?qū)?xì)菌的生長和繁殖產(chǎn)生顯著影響，而對釀酒酵母的生長及繁殖的影響比較輕微，達(dá)到抑制污染細(xì)菌增值的目的。

附圖說明。

圖1是不同月桂酰精氨酸乙酯濃度對釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae CICC1023)生長的影響。

圖2是不同月桂酰精氨酸乙酯濃度對干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei CICC20241)生長的影響。

圖3是不同月桂酰精氨酸乙酯濃度對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis CICC10033)生長的影響。

圖4是不同月桂酰精氨酸乙酯濃度對植物乳桿菌(Bacterial Strain Code CICC20263)生長的影響。

圖5是月桂酰精氨酸乙酯對酒精發(fā)酵過程中采用的酵母菌活性的影響。

圖6是月桂酰精氨酸乙酯對酒精發(fā)酵過程中污染乳酸細(xì)菌的影響。

圖7是月桂酰精氨酸乙酯對酒精發(fā)酵過程中酒精產(chǎn)量的影響

發(fā)明詳述及舉例。

月桂酰精氨酸乙酯是一種陽離子表面活性劑，主要作用于微生物的細(xì)胞膜從而導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中的物質(zhì)流失而使微生物死亡，各種微生物對月桂酰精氨酸乙酯的敏感程度是不同的。微生物對月桂酰精氨酸乙酯的敏感程度是濃度依賴性，也就是說與微生物的數(shù)量和月桂酰精氨酸乙酯的含量有關(guān)。

在朗姆酒發(fā)酵過程中污染的細(xì)菌濃度經(jīng)常達(dá)到10⁶- 10⁸CFU/ml，污染的細(xì)菌主要有發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）和蠟狀乙酸細(xì)菌（Bacillus cereus）。

工廠采用抗生素控制細(xì)菌的含量，如果細(xì)菌含量達(dá)到10⁵– 10⁶CFU/ml，認(rèn)為可接受，極少的時(shí)候會達(dá)到10⁴CFU/ml。

本發(fā)明研究使用的微生物來自于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心（CICC），下表列出了研究采用的微生物名稱及其菌種編號。實(shí)驗(yàn)通過添加不同濃度的月桂酰精氨酸乙酯，采用一定配比發(fā)酵培養(yǎng)基研究了這幾種微生物在不同時(shí)間的生長特性和微生物濃度。

表示微生物數(shù)量采用可見分光光度計(jì)測定吸光度（OD值）。

表1、研究用微生物名稱及其菌種編號。

月桂酰精氨酸乙酯對選定釀酒酵母的抑菌濃度是60PPM，當(dāng)50PPM時(shí)的影響不顯著。與釀酒酵母比較，選定的幾種乳酸細(xì)菌對月桂酰精氨酸乙酯更敏感，通常在20PPM以下其生長就被顯著的抑制。本實(shí)驗(yàn)找到合適的月桂酰精氨酸乙酯濃度，保證對釀酒酵母的影響是輕微的，而對乳酸菌生長的影響是顯著的，通過控制使用量達(dá)到抑制乳酸菌生長的目的。

以下為實(shí)驗(yàn)采用的培養(yǎng)基配比：

乳酸細(xì)菌斜面培養(yǎng)基（g/L）

蔗糖 10.0

植物蛋白 5.0

酵母膏 8.0

磷酸二氫鉀 10.0

瓊脂 18.0

用20%的氫氧化鉀溶液調(diào)pH為7.4。

乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）

蔗糖 10.0

酵母膏 8.0

磷酸鈉（Na₂HPO₄·12H₂0） 22.4

磷酸二氫鉀 1.4

硫酸鎂（MgSO₄·7H₂O） 0.2

用20%的氫氧化鉀溶液調(diào)pH為7.4。

酵母菌斜面培養(yǎng)基 （g/L）

葡萄糖 20.0

酵母膏 10.0

蛋白胨 20.0

瓊脂 18.0

用20%的氫氧化鉀溶液調(diào)pH為7.4。

酵母發(fā)酵培養(yǎng)基 （g/L）

蔗糖 160.0

紅糖 30.0

酵母膏 10.0

磷酸二氫鉀 5.0

氯化鈉 2.0

用20%的氫氧化鉀溶液調(diào)pH為7.4。

實(shí)驗(yàn)過程。

菌種的活化：取低溫保藏的含有菌種的甘油管室溫解凍，用接種環(huán)蘸取菌懸液，涂布到預(yù)先制備好的斜面培養(yǎng)基上，置于31±0.5℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16h。

菌懸液的制備：將斜面培養(yǎng)基上長出的菌落全部鏟出，與50mL含0.2%的NaCl的無菌鹽水混合，搖勻備用。

菌體的擴(kuò)大培養(yǎng)：用1mL移液槍吸取制備好的菌懸液0.5mL，接種到預(yù)先準(zhǔn)備好的含50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于31±0.5℃的恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

不同月桂酰精氨酸乙酯濃度條件下菌體生長曲線的測定：在原有的發(fā)酵培養(yǎng)基中再分別添加10、20、30、40、50、60PPM的月桂酰精氨酸乙酯按[0032]中的培養(yǎng)方法擴(kuò)大培養(yǎng)若干瓶，置于31±0.5℃的恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間取出一瓶，測定培養(yǎng)液OD值，做出培養(yǎng)液的OD值隨培養(yǎng)時(shí)間變化的曲線。

培養(yǎng)液OD值（吸光度）的測定：采用723PC型可見分光光度計(jì)，以未接種的經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)基為空白對照，測定其在600nm波長下培養(yǎng)液的OD值（吸光度）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖一，通過不同時(shí)間OD值（吸光度）的變化，表明不同月桂酰精氨酸乙酯濃度對釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae CICC1023)生長的影響。從圖一看出當(dāng)月桂酰精氨酸乙酯濃度達(dá)到60PPM時(shí)對酵母菌的生長具有較大的影響，在50PPM時(shí)的影響輕微。

圖二，通過不同時(shí)間OD值（吸光度）的變化，表明不同月桂酰精氨酸乙酯濃度對干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei CICC20241)生長的影響。實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)月桂酰精氨酸乙酯濃度達(dá)到40PPM時(shí)，干酪乳桿菌的生長達(dá)到完全的抑制。

圖三，通過不同時(shí)間OD值（吸光度）的變化，表明不同月桂酰精氨酸乙酯濃度對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisCICC10033)生長的影響。實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)月桂酰精氨酸乙酯濃度達(dá)到10PPM時(shí)，枯草芽孢桿菌的生長達(dá)到完全的抑制。

圖四，通過不同時(shí)間OD值（吸光度）的變化，表明不同月桂酰精氨酸乙酯濃度對植物乳桿菌(Bacterial Strain CICC20263)生長的影響。圖四證明月桂酰精氨酸乙酯對植物乳桿菌的完全抑制濃度為20PPM。

生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)的目的是為了評估在朗姆酒發(fā)酵過程中月桂酰精氨酸乙酯對污染微生物、釀酒酵母以及酒精產(chǎn)量的影響。本實(shí)驗(yàn)是在朗姆酒生產(chǎn)車間完成的，實(shí)驗(yàn)方案已經(jīng)考慮了一個(gè)完整的生產(chǎn)周期。

實(shí)驗(yàn)方案：

對照組---不添加任何抑菌物質(zhì)。月桂酰精氨酸乙酯組---添加55PPM的月桂酰精氨酸乙酯。正常組---添加正常生產(chǎn)過程使用的抑菌物質(zhì)及正常使用的濃度。

酵母菌的處理和制備：酵母菌按照正常生產(chǎn)過程采用稀酸溶液處理，并按照正常工藝要求加入到發(fā)酵罐中。使用的抑菌物質(zhì)按照設(shè)計(jì)的量分別加入到發(fā)酵罐中。

發(fā)酵罐補(bǔ)料和發(fā)酵控制：發(fā)酵罐每小時(shí)補(bǔ)料一次，共補(bǔ)料六次，補(bǔ)充的原料為糖蜜水溶液，經(jīng)測定污染微生物的數(shù)量為10⁶CFU/ml，具有典型代表意義。整個(gè)發(fā)酵時(shí)間持續(xù)9個(gè)小時(shí)，當(dāng)二氧化碳不再產(chǎn)生，蔗糖濃度降低到小于1%（W/W）時(shí)發(fā)酵停止。

取樣：發(fā)酵結(jié)束，將發(fā)酵液攪拌均勻，取樣。將樣品離心沉淀，下層沉淀物用于微生物分析，上層用于酒精含量分析。

分析：分析項(xiàng)目共三項(xiàng)，分別為酵母活性、污染細(xì)菌計(jì)數(shù)和酒精產(chǎn)量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

采用車間酵母活性測定方法，測定起始酵母活性為81.5%。圖五顯示了在發(fā)酵終點(diǎn)三個(gè)實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵液中酵母菌活性的對照，證明55PPM的月桂酰精氨酸乙酯對酵母菌的活性有輕微的影響。

圖六顯示了添加月桂酰精氨酸乙酯對污染細(xì)菌生長的影響，圖示證明采用月桂酰精氨酸乙酯后污染微生物的濃度顯著低于另外兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組。

圖七顯示了添加月桂酰精氨酸乙酯對酒精產(chǎn)量的影響。

在工廠實(shí)驗(yàn)證明，月桂酰精氨酸乙酯對酒精發(fā)酵中污染的細(xì)菌具有明顯的抑制作用。對酵母菌的生長影響輕微。與使用的其他抑制劑相比酒精產(chǎn)量降低0.6%，但使用LAE的成本低于正在使用的抑制劑，綜合比較不會減少工廠利潤。

在應(yīng)用于朗姆酒發(fā)酵中，污染微生物的減少對改善產(chǎn)品的口感具有明顯的促進(jìn)作用。

本發(fā)明的要點(diǎn)、舉例、應(yīng)用已經(jīng)做了全面的敘述，可以理解，本發(fā)明的內(nèi)容不僅局限于這些舉例，不違背本發(fā)明所公開內(nèi)容，尤其是前面所提及的內(nèi)容的實(shí)驗(yàn)方案可以進(jìn)行其他的修改。