本申請(qǐng)要求2014年4月1日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/973,484的權(quán)益，其全文通過(guò)引用并入本文。文件“40-21_70001_0000_US_ST25.txt”中所含的序列表(49千字節(jié)，于2014年4月1日創(chuàng)建，2014年4月1日與美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/973,484一起提交)，和文件“40-21_70001_0000_US_ST25.txt”中所含的替換序列表(49千字節(jié)，于2014年4月4日創(chuàng)建，2014年4月4日作為替換序列表提交以更正發(fā)明人的序列表)的全文并入本文。文件“40-21_70001_0000_WO_ST25.txt”中所含的序列表(70千字節(jié)，于2015年3月13日創(chuàng)建)在此提交并通過(guò)引用將其全文并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域：
：本文公開的是用于控制尤其是植物中無(wú)脊椎害蟲侵?jǐn)_的方法，和在這種方法中有用的組合物和多核苷酸。更具體地，本發(fā)明涉及用于尤其通過(guò)RNA干擾改變無(wú)脊椎害蟲中基因表達(dá)的多核苷酸及其使用方法。目標(biāo)害蟲物種包括侵?jǐn)_作物植物的昆蟲，例如，小菜蛾(Plutellaxylostella，菜蛾)、草地夜蛾(Spodopterafrugiperda，草地粘蟲)、豆莢草盲蝽(Lygushesperus，西部無(wú)澤盲蝽)和Euschistusheros(新熱帶區(qū)褐臭蝽)。
背景技術(shù)：
：：經(jīng)濟(jì)作物經(jīng)常是無(wú)脊椎害蟲例如昆蟲攻擊的目標(biāo)。用于控制植物中昆蟲侵?jǐn)_的組合物通常是化學(xué)殺蟲劑的形式。然而，使用化學(xué)殺蟲劑存在若干缺點(diǎn)。例如，化學(xué)殺蟲劑通常是非選擇性的，且應(yīng)用旨在控制作物植物中蟲害的化學(xué)殺蟲劑可以在非目標(biāo)昆蟲和其他無(wú)脊椎動(dòng)物上發(fā)揮它們的效果?；瘜W(xué)殺蟲劑通常持續(xù)存在于環(huán)境中且降解緩慢，因此可能在食物鏈中累積。此外，使用持續(xù)的化學(xué)殺蟲劑可能導(dǎo)致目標(biāo)昆蟲物種產(chǎn)生抗性。因此對(duì)于對(duì)環(huán)境更友好的用于控制或消除植物上或植物中的昆蟲侵?jǐn)_的方法存在長(zhǎng)期需求，即物種選擇性、環(huán)境惰性、非持續(xù)性和生物可降解且良好適合抗蟲性管理方案的方法。包括蘇蕓金桿菌(“Bt”)細(xì)菌的殺蟲組合物是可商購(gòu)的且用作環(huán)境安全和可接受的殺蟲劑已超過(guò)三十年。這些組合物的功效歸因于僅由Bt菌產(chǎn)生的殺蟲蛋白。殺蟲Bt蛋白不會(huì)持續(xù)存在于環(huán)境中，對(duì)于受影響的目標(biāo)物種具有高度選擇性，僅通過(guò)目標(biāo)昆蟲的攝取發(fā)揮它們的效果，且已經(jīng)證明對(duì)植物和其他非目標(biāo)生物(包括人和其他脊椎動(dòng)物)無(wú)害。包含一種或多種編碼殺蟲Bt蛋白的重組基因的轉(zhuǎn)基因植物也是本領(lǐng)域可獲得的，且對(duì)害蟲侵?jǐn)_有抗性。使用表達(dá)Bt蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的一個(gè)積極的環(huán)境結(jié)果是減少了在這種轉(zhuǎn)基因作物田地中施用以控制害蟲侵?jǐn)_的化學(xué)殺蟲劑的量，從而降低由非降解或過(guò)量化學(xué)殺蟲劑導(dǎo)致的土壤和水的污染。此外，由于減少使用非選擇性的化學(xué)殺蟲劑，其中種植表達(dá)Bt蛋白的轉(zhuǎn)基因作物植物的田地中的益蟲的數(shù)量顯著增加。RNA干擾(RNAi，RNA-介導(dǎo)的基因抑制)是另一種用于害蟲控制的方法。在無(wú)脊椎動(dòng)物中，基于RNAi的基因抑制最初在線蟲中被證實(shí)(Fire等,(1998)Nature,391:806-811；Timmons&Fire(1998)Nature,395:854)。隨后，在大量物種中報(bào)道了利用重組核酸技術(shù)的基于RNAi的無(wú)脊椎動(dòng)物基因的抑制，包括來(lái)自各種昆蟲和線蟲分類的農(nóng)學(xué)或經(jīng)濟(jì)上重要的害蟲，例如根瘤線蟲(根結(jié)線蟲屬)，參見(jiàn)Huang等(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:14302-14306,doi:10.1073/pnas.0604698103)；棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)，參見(jiàn)Mao等(2007)NatureBiotechnol.,25:1307-1313,doi:10.1038/nbt1352；西部玉米根蟲(DiabroticavirgiferaLeConte)，參見(jiàn)Baum等(2007)NatureBiotechnol.,25:1322-1326,doi:10.1038/nbt1359；甜菜孢囊線蟲(粟根線蟲，Heteroderaschachtii)，參見(jiàn)Sindhu等(2008)J.Exp.Botany,60:315-324,doi:10.1093/jxb/ern289；蚊子(埃及伊蚊，Aedesaegypti)，參見(jiàn)Pridgeon等(2008)J.Med.Entomol.,45:414-420,doi:full/10.1603/0022-2585％282008％2945％5B414％3ATAADRK％5D2.0.CO％3B2；果蠅(Drosophilamelanogaster)、面象蟲(Triboliumcastaneum)、豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)、煙草天蛾(Manducasexta)，參見(jiàn)Whyard等(2009)InsectBiochem.Mol.Biol.,39:824-832,doi:10.1016/j.ibmb.2009.09.00；菜蛾(Plutellaxylostella)，參見(jiàn)Gong等(2011)PestManag.Sci.,67:514-520,doi:10.1002/ps.2086；桃蚜(Myzuspersicae)，參見(jiàn)Pitino等(2011)PLoSONE,6:e25709,doi:10.1371/journal.pone.0025709；褐飛虱(Nilaparvatalugens)，參見(jiàn)Li等(2011)PestManag.Sci.,67:852-859,doi:10.1002/ps.2124和白粉虱(煙粉虱，Bemisiatabaci)，參見(jiàn)Upadhyay等(2011)J.Biosci.,36:153-161,doi:10.1007/s12038-011-9009-1。本發(fā)明涉及控制蟲害、尤其是侵?jǐn)_作物植物且之前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)RNA介導(dǎo)的基因抑制方法有抗性的昆蟲的方法，例如，小菜蛾(菜蛾)、草地夜蛾(草地粘蟲)、豆莢草盲蝽(西部無(wú)澤盲蝽)和Euschistusheros(新熱帶區(qū)褐臭蝽)。已經(jīng)鑒別用于測(cè)試抗性昆蟲物種小菜蛾(菜蛾)、草地夜蛾(草地粘蟲)、豆莢草盲蝽(西部無(wú)澤盲蝽)和Euschistusheros(新熱帶區(qū)褐臭蝽)的雙鏈RNA(dsRNA)引發(fā)序列。這些引發(fā)劑被設(shè)計(jì)用于抑制新的靶基因，所述新的靶基因是之前被證實(shí)對(duì)西部玉米根蟲(Diabroticavirgifera)中的RNAi-介導(dǎo)的死亡率是有效目標(biāo)的基因的推定的同源基因。本發(fā)明進(jìn)一步涉及在控制蟲害的方法中有用的多核苷酸和重組DNA分子和構(gòu)建體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及殺蟲組合物，和抗蟲害侵?jǐn)_的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還涉及用于鑒定對(duì)于控制蟲害有效的雙鏈RNA引發(fā)劑的方法，和用于鑒定可能代表實(shí)質(zhì)功能的靶基因、使得這些基因成為RNAi-介導(dǎo)的沉默和控制蟲害的優(yōu)選目標(biāo)的方法。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及控制昆蟲物種，尤其是經(jīng)濟(jì)上或農(nóng)學(xué)上重要的害蟲。本發(fā)明的組合物和方法包括重組多核苷酸分子，例如用于制備抗昆蟲物種侵?jǐn)_的轉(zhuǎn)基因植物的重組DNA構(gòu)建體和例如作為局部應(yīng)用試劑以引起昆蟲物種中RNAi-介導(dǎo)的靶基因抑制且因此控制或預(yù)防那些昆蟲物種侵?jǐn)_的RNA“引發(fā)劑”。本發(fā)明的另一種應(yīng)用是包含多核苷酸的組合物(例如，包含用于抑制靶基因的dsRNA引發(fā)劑的組合物)，其局部施用于昆蟲物種或待保護(hù)以免受昆蟲物種侵?jǐn)_的植物、植物部分、或種子。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于選擇優(yōu)選昆蟲靶基因的方法，所述靶基因很可能是RNAi-介導(dǎo)的控制昆蟲物種的有效目標(biāo)。一方面，本發(fā)明提供用于控制植物的昆蟲侵?jǐn)_的方法，包括用dsRNA接觸侵?jǐn)_植物的昆蟲，其中所述dsRNA包括至少一個(gè)18個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的片斷，所述核苷酸的序列與所述昆蟲的靶基因的片段具有約95％到約100％的互補(bǔ)性，和其中所述靶基因的DNA序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44。在實(shí)施方式中，所述dsRNA包括具有與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％同一性或互補(bǔ)性的序列的RNA鏈。在實(shí)施方式中，所述dsRNA包括具有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的RNA鏈。在實(shí)施方式中，所述dsRNA引發(fā)劑抑制昆蟲中的基因并且抑制或殺死昆蟲。另一方面，本發(fā)明提供在昆蟲中引起死亡或發(fā)育障礙的方法，包括在昆蟲的飲食中提供至少一種重組RNA，其包括至少一種與昆蟲的靶基因序列的片段基本上同一或基本上互補(bǔ)的沉默元件，其中所述靶基因序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44，和其中通過(guò)昆蟲攝取重組RNA導(dǎo)致昆蟲的死亡或發(fā)育障礙。在實(shí)施方式中，所述沉默元件包括具有與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％同一性或互補(bǔ)性的序列的RNA鏈。在實(shí)施方式中，所述沉默元件包括具有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的RNA鏈。另一方面，本發(fā)明提供包括殺蟲有效量的重組RNA分子的殺蟲組合物，其中所述重組RNA分子包括至少一個(gè)18個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的片斷，所述核苷酸的序列與侵?jǐn)_植物的昆蟲的靶基因的片段具有約95％到約100％的互補(bǔ)性，和其中所述靶基因的DNA序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44。在實(shí)施方式中，所述重組RNA分子是dsRNA。在實(shí)施方式中，所述重組RNA分子包括至少一個(gè)片斷(例如RNA鏈或RNA鏈的片斷)，其具有與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％同一性或互補(bǔ)性的序列。在實(shí)施方式中，所述重組RNA分子包括至少一個(gè)片斷(例如RNA鏈或RNA鏈的片斷)，其具有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列。另一方面，本發(fā)明提供一種具有改進(jìn)的抗蟲性的植物，包括在植物中表達(dá)重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包括編碼至少一種與昆蟲的靶基因序列的片段基本上同一或基本上互補(bǔ)的沉默元件的DNA，其中所述靶基因序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44，和其中通過(guò)昆蟲攝取重組RNA導(dǎo)致昆蟲的死亡或發(fā)育障礙。在實(shí)施方式中，所述沉默元件是ssRNA。在其他實(shí)施方式中，所述沉默元件是dsRNA。在實(shí)施方式中，所述沉默元件包括RNA(例如RNA鏈或RNA鏈的片斷)，其具有與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％同一性或互補(bǔ)性的序列。在實(shí)施方式中，所述沉默元件包括RNA(例如RNA鏈或RNA鏈的片斷)，其具有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列。另一方面，本發(fā)明提供包括異源啟動(dòng)子的重組DNA構(gòu)建體，例如在細(xì)菌細(xì)胞或真核細(xì)胞(例如植物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞)中具有功能的異源啟動(dòng)子，其可操作地與編碼RNA轉(zhuǎn)錄物的DNA連接，其中所述RNA轉(zhuǎn)錄物包括具有與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％同一性或互補(bǔ)性的序列。在實(shí)施方式中，所述RNA轉(zhuǎn)錄物是ssRNA。在其他實(shí)施方式中，所述RNA轉(zhuǎn)錄物是dsRNA。在實(shí)施方式中，所述沉默元件包括RNA(例如RNA鏈或RNA鏈的片斷)，其具有與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％同一性或互補(bǔ)性的序列。在實(shí)施方式中，所述沉默元件包括RNA(例如RNA鏈或RNA鏈的片斷)，其具有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供包括本發(fā)明多核苷酸或引發(fā)劑的人造組合物，例如用于局部施用至需要保護(hù)以免受昆蟲侵?jǐn)_的植物或物質(zhì)的dsRNA制劑、用于制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物的重組構(gòu)建體和載體、用于處理植物(包括植物種子或可繁殖部分例如塊莖)的制劑和涂層、用本發(fā)明多核苷酸處理或包含本發(fā)明多核苷酸的植物種子或可繁殖部分例如塊莖以及從這種植物、種子或可繁殖部分產(chǎn)生的商品和食物(尤其是具有可檢測(cè)含量的本發(fā)明多核苷酸的商品和食物)。本發(fā)明的進(jìn)一步方面是結(jié)合肽或蛋白質(zhì)的多克隆或單克隆抗體，所述肽或蛋白質(zhì)由選自SEQIDNOs:1-12和43-44的序列或序列片段編碼；本發(fā)明的另一方面是結(jié)合肽或蛋白質(zhì)的多克隆或單克隆抗體，所述肽或蛋白質(zhì)由選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46或其補(bǔ)體的序列或序列片段編碼。這種抗體通過(guò)如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法來(lái)制備。本發(fā)明的其他方面和具體實(shí)施方式在以下發(fā)明詳述和工作實(shí)施例中公開。附圖說(shuō)明圖1描繪了實(shí)施例2所述的在草地夜蛾(草地粘蟲，F(xiàn)AW)SF9細(xì)胞中dsRNA引發(fā)劑(TOPPANEL)T34640(SEQIDNO:17，靶向V-ATPaseA亞基)、(MIDDLEPANEL)T34642(SEQIDNO:18，靶向COPIcoatomerbeta亞基)或(BOTTOMPANEL)T34644(SEQIDNO:19，靶向COPIcoatomerbeta主要亞基)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖2描繪了實(shí)施例2所述的在小菜蛾(菜蛾，DBM)細(xì)胞中dsRNA引發(fā)劑(TOPPANEL)T42017(SEQIDNO:21，靶向V-ATPase亞基A)、(TOPPANEL)T33310(SEQIDNO:29，靶向V-ATPase亞基A)、(MIDDLEPANEL)T32938(SEQIDNO:28，靶向COPIcoatomerbeta亞基)和(BOTTOMPANEL)T32937(SEQIDNO:13，靶向COPIcoatomerbeta主要亞基)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。發(fā)明詳述除非另有定義，所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
：的普通技術(shù)人員所通常理解的相同含義。通常，所使用的命名法和如下所述的制備或?qū)嶒?yàn)程序是本領(lǐng)域眾所周知和通常使用的。這些程序使用常規(guī)方法，例如本領(lǐng)域和各種一般文獻(xiàn)所提供的那些。當(dāng)術(shù)語(yǔ)以單數(shù)形式提供時(shí)，本發(fā)明人也預(yù)期由該術(shù)語(yǔ)的復(fù)數(shù)形式所描述的本發(fā)明方面。當(dāng)通過(guò)引用并入的參考文獻(xiàn)中使用的術(shù)語(yǔ)和定義中存在矛盾時(shí)，本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)具有給定的定義。所使用的其他技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有其中使用它們的領(lǐng)域的普通含義，如各種領(lǐng)域-具體的詞典所示，例如“TheAmericanScienceDictionary”(EditorsoftheAmericanHeritageDictionaries,2011,HoughtonMifflinHarcourt,BostonandNewYork)、“McGraw-HillDictionaryofScientificandTechnicalTerms”(6thedition,2002,McGraw-Hill,NewYork)或“OxfordDictionaryofBiology”(6thedition,2008,OxfordUniversityPress,OxfordandNewYork)。發(fā)明人不意欲限制于機(jī)制或作用方式。其參考文獻(xiàn)僅為說(shuō)明性目的而提供。除非另有說(shuō)明，在本說(shuō)明書文本中的核酸序列當(dāng)從左到右閱讀時(shí)以5'到3'方向給出。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解給定的DNA序列理解為定義除了用尿嘧啶(U)核苷酸替換DNA的胸腺嘧啶(T)核苷酸之外與DNA序列相同的對(duì)應(yīng)的RNA序列。因此，提供具體的DNA序列理解為定義準(zhǔn)確的RNA等效物。給定的第一多核苷酸序列，不管DNA或RNA，進(jìn)一步定義了其準(zhǔn)確的補(bǔ)體(其可以是DNA或RNA)的序列，即通過(guò)形成Watson-Crick堿基配對(duì)與第一多核苷酸完美雜交的第二多核苷酸。與靶基因或靶基因片段“基本上同一”或“基本上互補(bǔ)”是指設(shè)計(jì)多核苷酸鏈(或雙鏈多核苷酸的至少一條鏈)以使其與靶基因或靶基因片段或靶基因或靶基因片段的轉(zhuǎn)錄物雜交(通常在生理?xiàng)l件下，例如在活的植物或動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的那些)；本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解這種雜交不一定需要100％的序列同一性或互補(bǔ)性。當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄信c第二核酸序列具有功能上的關(guān)系時(shí)，第一核酸序列“可操作地”與第二核酸序列連接或聯(lián)接。例如，如果啟動(dòng)子提供DNA的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，則啟動(dòng)子序列與DNA“可操作地連接”。通常，可操作地連接的DNA序列是連續(xù)的。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”通常是指包含多個(gè)核苷酸的DNA或RNA分子且通常是指“寡核苷酸”(長(zhǎng)度為18-25個(gè)核苷酸的多核苷酸分子)和26個(gè)或更多個(gè)核苷酸的較長(zhǎng)多核苷酸兩者。如本領(lǐng)域通常實(shí)踐的，多核苷酸也包括含有多個(gè)核苷酸(包括非規(guī)范核苷酸或化學(xué)修飾的核苷酸)的分子，例如參見(jiàn)技術(shù)手冊(cè)“RNAInterference(RNAi)andDsiRNAs”,2011(IntegratedDNATechnologiesCoralville,IA)中公開的化學(xué)修飾。通常，本發(fā)明的多核苷酸或引發(fā)劑，不管DNA或RNA或兩者，不管單鏈或雙鏈，包括至少一個(gè)與靶基因DNA或靶基因的RNA轉(zhuǎn)錄物的同等大小的片段基本上同一或互補(bǔ)的18個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸(或，在雙鏈多核苷酸情況下，至少18個(gè)連續(xù)堿基對(duì))的片斷。在本公開中，“至少18個(gè)連續(xù)的”是指“從約18個(gè)到約10,000個(gè)，包括之間的每個(gè)整數(shù)點(diǎn)”。因此，本發(fā)明的實(shí)施方式包括包含長(zhǎng)度為18-25個(gè)核苷酸(18聚體、19聚體、20聚體、21聚體、22聚體、23聚體、24聚體或25聚體)的寡核苷酸、或長(zhǎng)度為26個(gè)或更多個(gè)核苷酸的中等長(zhǎng)度的多核苷酸(26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200、約210、約220、約230、約240、約250、約260、約270、約280、約290或約300個(gè)核苷酸的多核苷酸)、或長(zhǎng)度超過(guò)約300個(gè)核苷酸的長(zhǎng)多核苷酸(例如長(zhǎng)度為約300-約400個(gè)核苷酸、約400-約500個(gè)核苷酸、約500-約600個(gè)核苷酸、約600-約700個(gè)核苷酸、約700-約800個(gè)核苷酸、約800-約900個(gè)核苷酸、約900-約1000個(gè)核苷酸、約300-約500個(gè)核苷酸、約300-約600個(gè)核苷酸、約300-約700個(gè)核苷酸、約300-約800個(gè)核苷酸、約300-約900個(gè)核苷酸或約1000個(gè)核苷酸、或甚至長(zhǎng)度超過(guò)約1000個(gè)核苷酸，例如等于包括靶基因的編碼或非編碼或編碼和非編碼部分兩者的靶基因的完整長(zhǎng)度的多核苷酸)的組合物。當(dāng)多核苷酸是雙鏈，例如工作實(shí)施例中描述的dsRNA引發(fā)劑時(shí)，其長(zhǎng)度可以類似地根據(jù)堿基對(duì)來(lái)描述。雙鏈多核苷酸，例如工作實(shí)施例中描述的dsRNA引發(fā)劑，可以進(jìn)一步根據(jù)一個(gè)或多個(gè)單鏈組分來(lái)描述。通常設(shè)計(jì)本發(fā)明的多核苷酸或引發(fā)劑以抑制或沉默一種或多種基因(“靶基因”)。術(shù)語(yǔ)“基因”是指提供轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)或編碼轉(zhuǎn)錄物的核酸的任何部分?！盎颉笨梢园ǖ幌抻趩?dòng)子區(qū)域、5'非翻譯區(qū)、可以包括內(nèi)含子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄物編碼區(qū)、3'非翻譯區(qū)或這些區(qū)域的組合。在實(shí)施方式中，靶基因可以包括編碼或非編碼序列或兩者。在其他實(shí)施方式中，靶基因的序列與信使RNA同一或互補(bǔ)，例如，在實(shí)施方式中，靶基因是cDNA。通過(guò)用dsRNA接觸控制植物的昆蟲侵?jǐn)_本發(fā)明的第一方面提供用于控制植物的昆蟲侵?jǐn)_的方法，包括用雙鏈RNA(dsRNA)接觸侵?jǐn)_植物的昆蟲，其中所述dsRNA包括至少一個(gè)18個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的片斷，所述核苷酸的序列與所述昆蟲的靶基因的片段具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)的互補(bǔ)性，和其中所述靶基因的DNA序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44。在本上下文中，“控制”包括誘導(dǎo)昆蟲(成蟲或幼蟲或蛹)的生理或行為的變化，例如，但不限于，生長(zhǎng)遲緩、死亡率增加、生殖能力降低、進(jìn)食行為或運(yùn)動(dòng)降低或停止、或變形階段發(fā)育降低或停止?！半p鏈”是指通常在生理學(xué)相關(guān)的條件下在充分互補(bǔ)的、反平行核酸鏈之間發(fā)生的堿基配對(duì)以形成雙鏈核酸結(jié)構(gòu)。在各種實(shí)施方式中，昆蟲選自夜蛾屬、草盲蝽屬、美洲蝽屬和菜蛾屬。特別感興趣的昆蟲包括草地夜蛾(Spodopterafrugiperda，草地粘蟲)、豆莢草盲蝽(Lygushesperus，西部無(wú)澤盲蝽)、Euschistusheros(新熱帶區(qū)褐臭蝽)和小菜蛾(Plutellaxylostella，菜蛾)。所述方法的各種實(shí)施方式包括其中昆蟲是草地夜蛾(草地粘蟲)和靶基因包括選自SEQIDNOs:1-3的DNA序列；其中昆蟲是豆莢草盲蝽(西部無(wú)澤盲蝽)和靶基因包括選自SEQIDNOs:4-7、43和44的DNA序列；其中昆蟲是Euschistusheros(新熱帶區(qū)褐臭蝽)和靶基因包括選自SEQIDNOs:8-9的DNA序列；和其中昆蟲是小菜蛾(菜蛾)和靶基因包括選自SEQIDNOs:10-12的DNA序列的那些。所述方法的其他實(shí)施方式包括其中昆蟲是草地夜蛾(草地粘蟲)和dsRNA包括選自SEQIDNOs:17-19的序列；其中昆蟲是豆莢草盲蝽(西部無(wú)澤盲蝽)和dsRNA包括選自SEQIDNOs:14-16、22、26、45和46的序列；其中昆蟲是Euschistusheros(新熱帶區(qū)褐臭蝽)和dsRNA包括選自SEQIDNOs:23-25的序列；和其中昆蟲是小菜蛾(菜蛾)和dsRNA包括選自SEQIDNOs:13、20-21和28-29的序列。其他實(shí)施方式包括其中dsRNA具有如實(shí)施例5所述修飾的序列以消除與非靶標(biāo)生物，例如表6所公開的修飾序列(SEQIDNOs:30-42)匹配的那些。植物可以是經(jīng)歷昆蟲侵?jǐn)_的任何植物，所述昆蟲侵?jǐn)_可以通過(guò)本文公開的多核苷酸控制。特別感興趣的植物包括商業(yè)重要的植物，包括中耕作物植物、蔬菜和水果，和其他農(nóng)學(xué)或裝飾性用途的植物。適合植物的實(shí)例提供于標(biāo)題“植物”下。在方法的實(shí)施方式中，dsRNA包括多個(gè)片段，每一個(gè)為18個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸且其序列與所述昆蟲的靶基因的片段具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)的互補(bǔ)性。例如，dsRNA可以包括對(duì)應(yīng)于靶基因的不同區(qū)域的片斷，或可以包括片斷的多個(gè)拷貝。在方法的其他實(shí)施方式中，dsRNA包括多個(gè)片斷，每一個(gè)為18或更多個(gè)連續(xù)核苷酸且其序列與不同靶基因的片段具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)的互補(bǔ)性；以這種方法可以抑制多個(gè)靶基因或多個(gè)昆蟲物種。在方法的實(shí)施方式中，dsRNA是平端。在其他實(shí)施方式中，dsRNA在一端或兩端(末端)具有懸垂；懸垂可以是單個(gè)核苷酸或2、3、4、5、6或更多個(gè)核苷酸，且可以位于鏈的5'端或3'端上。dsRNA可以是化學(xué)合成的，或可以通過(guò)在微生物中表達(dá)、通過(guò)在植物細(xì)胞中表達(dá)、或通過(guò)微生物發(fā)酵來(lái)制備。dsRNA可以是化學(xué)修飾的，例如以改進(jìn)穩(wěn)定性或功效。在所述方法的一些實(shí)施方式中，接觸包括向昆蟲表面或被昆蟲侵?jǐn)_的植物表面施用含有dsRNA的組合物。組合物可以包括或?yàn)楣腆w、液體、粉末、懸浮液、乳劑、噴霧、包封劑、微珠、載體微粒、薄膜、基質(zhì)或種子處理的形式。在實(shí)施方式中，例如可以通過(guò)在包括dsRNA的液體組合物中浸泡種子向種子施用組合物，其中種子將有效量dsRNA吸取或攝入種子內(nèi)部或種子胚乳，以通過(guò)種子或植物或由種子生長(zhǎng)的幼苗提供改進(jìn)的抗蟲性。在實(shí)施方式中，接觸包括在組合物中提供dsRNA，所述組合物進(jìn)一步包括一種或多種選自載體試劑、表面活性劑、有機(jī)硅酮化合物、多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸殺蟲劑、安全劑、誘蟲劑和昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的組分。在實(shí)施方式中，接觸包括在組合物中提供dsRNA，所述組合物進(jìn)一步包括至少一種選自馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇蕓金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發(fā)光桿菌屬殺蟲蛋白、側(cè)孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白的殺蟲劑。在所述方法的一些實(shí)施方式中，接觸包括在昆蟲攝取的組合物中提供dsRNA，例如向昆蟲進(jìn)食的植物施用的液體、乳劑或粉末，或以誘餌形式。這種組合物可以進(jìn)一步包括一種或多種選自載體試劑、表面活性劑、有機(jī)硅酮化合物、多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸殺蟲劑、安全劑、誘蟲劑和昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的組分。這種組合物可以進(jìn)一步包括至少一種選自馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇蕓金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發(fā)光桿菌屬殺蟲蛋白、側(cè)孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白的殺蟲劑。在實(shí)施方式中，dsRNA和殺蟲劑的組合提供協(xié)同作用的昆蟲控制水平，即大于如果單獨(dú)測(cè)試的dsRNA和殺蟲劑組分的效果之和。引起昆蟲死亡或發(fā)育障礙的方法本發(fā)明的另一方面提供引起昆蟲死亡或發(fā)育障礙的方法，包括在昆蟲的飲食中提供至少一種重組RNA，所述重組RNA包括至少一種與昆蟲的靶基因序列的片段基本上同一或基本上互補(bǔ)的沉默元件，其中所述靶基因序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44，和其中通過(guò)昆蟲攝取重組RNA導(dǎo)致昆蟲的死亡或發(fā)育障礙。所述方法應(yīng)用于各種生命階段的昆蟲。在實(shí)施方式中，所述方法引起昆蟲幼蟲或蛹的死亡或發(fā)育障礙。在其他實(shí)施方式中，所述方法引起成蟲死亡。在所述方法的實(shí)施方式中，所述重組RNA包括至少一條RNA鏈，所述RNA鏈的序列與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)的同一性或互補(bǔ)性。方法的實(shí)施方式包括其中昆蟲是草地夜蛾(草地粘蟲)和靶基因包括選自SEQIDNOs:1-3的DNA序列；其中昆蟲是豆莢草盲蝽(西部無(wú)澤盲蝽)和靶基因包括選自SEQIDNOs:4-7、43和44的DNA序列；其中昆蟲是Euschistusheros(新熱帶區(qū)褐臭蝽)和靶基因包括選自SEQIDNOs:8-9的DNA序列；和其中昆蟲是小菜蛾(菜蛾)和靶基因包括選自SEQIDNOs:10-12的DNA序列的那些。所述方法的其他實(shí)施方式包括其中昆蟲是草地夜蛾(草地粘蟲)和沉默元件包括選自SEQIDNOs:17-19的序列；其中昆蟲是豆莢草盲蝽(西部無(wú)澤盲蝽)和沉默元件包括選自SEQIDNOs:14-16、22、26、45和46的序列；其中昆蟲是Euschistusheros(新熱帶區(qū)褐臭蝽)和沉默元件包括選自SEQIDNOs:23-25的序列；和其中昆蟲是小菜蛾(菜蛾)和沉默元件包括選自SEQIDNOs:13、20-21和28-29的序列。其他的實(shí)施方式包括其中重組RNA具有如實(shí)施例5所述修飾的序列以消除與非靶標(biāo)生物，例如表6所公開的修飾序列(SEQIDNOs:30-42)相匹配的那些。在方法的實(shí)施方式中，所述重組RNA是dsRNA。在這些實(shí)施方式中，dsRNA可以是平端dsRNA，或可以是在一端或兩端(末端)具有懸垂的dsRNA；懸垂可以是單個(gè)核苷酸或2、3、4、5、6或更多個(gè)核苷酸，且可以位于鏈的5'端或3'端上。dsRNA可以是化學(xué)合成的，或可以通過(guò)在微生物中表達(dá)、通過(guò)在植物細(xì)胞中表達(dá)、或通過(guò)微生物發(fā)酵來(lái)制備。dsRNA可以是化學(xué)修飾的，例如以改進(jìn)穩(wěn)定性或功效。在其中所述重組RNA是dsRNA的方法的實(shí)施方式中，dsRNA包括至少一條RNA鏈，所述RNA鏈的序列與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％的同一性或互補(bǔ)性。在所述方法的一些實(shí)施方式中，重組RNA以可攝取組合物的形式提供于昆蟲的飲食中，例如提供于向昆蟲進(jìn)食的植物施用的液體、乳劑或粉末中，或以誘餌形式。這種組合物可以進(jìn)一步包括一種或多種選自載體試劑、表面活性劑、有機(jī)硅酮化合物、多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸殺蟲劑、安全劑、誘蟲劑和昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的組分。這種組合物可以進(jìn)一步包括至少一種選自馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇蕓金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發(fā)光桿菌屬殺蟲蛋白、側(cè)孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白的殺蟲劑。在實(shí)施方式中，重組RNA和殺蟲劑的組合提供協(xié)同作用的昆蟲控制水平，即大于如果單獨(dú)測(cè)試的重組RNA和殺蟲劑的效果之和。殺蟲組合物本發(fā)明的另一方面提供包括殺蟲有效量的重組RNA分子的殺蟲組合物，其中所述重組RNA分子包括至少一個(gè)18個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的片斷，所述核苷酸具有與侵?jǐn)_植物的昆蟲的靶基因片段具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)互補(bǔ)性的序列，和其中所述靶基因的DNA序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44?！皻⑾x有效”是指有效誘導(dǎo)侵?jǐn)_植物的昆蟲(成蟲或幼蟲或蛹)的生理或行為的變化，例如，但不限于，生長(zhǎng)遲緩、死亡率增加、生殖能力降低或繁殖力降低、進(jìn)食行為或運(yùn)動(dòng)降低或停止、或變形階段發(fā)育降低或停止；在實(shí)施方式中，向植物施用殺蟲有效量的重組RNA分子改進(jìn)植物對(duì)昆蟲侵?jǐn)_的抗性。在殺蟲組合物的實(shí)施方式中，重組RNA分子包括至少一條RNA鏈，所述RNA鏈的序列與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)的同一性或互補(bǔ)性。在具體的實(shí)施方式中，重組RNA分子是包括具有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的RNA鏈的dsRNA。在實(shí)施方式中，重組RNA分子是長(zhǎng)度為至少50個(gè)堿基對(duì)的dsRNA。在方法的實(shí)施方式中，重組RNA分子是dsRNA。在實(shí)施方式中，重組RNA分子是dsRNA，其可以是平端dsRNA，或可以是在一端或兩端(末端)具有懸垂的dsRNA；懸垂可以是單個(gè)核苷酸或2、3、4、5、6或更多個(gè)核苷酸，且可以位于鏈的5'端或3'端上。在實(shí)施方式中，重組RNA分子是可以是化學(xué)合成的dsRNA，或可以通過(guò)在微生物中表達(dá)、通過(guò)在植物細(xì)胞中表達(dá)、或通過(guò)微生物發(fā)酵來(lái)制備。在實(shí)施方式中，重組RNA分子是長(zhǎng)度大于典型的天然存在的調(diào)控小RNA(例如內(nèi)源產(chǎn)生的siRNA和成熟miRNA)的長(zhǎng)度的dsRNA，即多核苷酸是長(zhǎng)度為至少約30個(gè)連續(xù)堿基對(duì)的雙鏈RNA。在實(shí)施方式中，重組RNA分子是長(zhǎng)度為約50到約500個(gè)堿基對(duì)的dsRNA。殺蟲組合物的實(shí)施方式包括其中昆蟲是草地夜蛾(草地粘蟲)和靶基因包括選自SEQIDNOs:1-3的DNA序列；其中昆蟲是豆莢草盲蝽(西部無(wú)澤盲蝽)和靶基因包括選自SEQIDNOs:4-7、43和44的DNA序列；其中昆蟲是Euschistusheros(新熱帶區(qū)褐臭蝽)和靶基因包括選自SEQIDNOs:8-9的DNA序列；和其中昆蟲是小菜蛾(菜蛾)和靶基因包括選自SEQIDNOs:10-12的DNA序列的那些。殺蟲組合物的其他實(shí)施方式包括其中昆蟲是草地夜蛾(草地粘蟲)和重組RNA分子包括至少一條RNA鏈，所述RNA鏈的序列與選自SEQIDNOs:17-19的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)的同一性或互補(bǔ)性；其中昆蟲是豆莢草盲蝽(西部無(wú)澤盲蝽)和重組RNA分子包括至少一條RNA鏈，所述RNA鏈的序列與選自SEQIDNOs:14-16、22、26、45和46的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)的同一性或互補(bǔ)性；其中昆蟲是Euschistusheros(新熱帶區(qū)褐臭蝽)和重組RNA分子包括至少一條RNA鏈，所述RNA鏈的序列與選自SEQIDNOs:23-25的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)的同一性或互補(bǔ)性；和其中昆蟲是小菜蛾(菜蛾)和重組RNA分子包括至少一條RNA鏈，所述RNA鏈的序列與選自SEQIDNOs:13、20-21和28-29的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)的同一性或互補(bǔ)性的那些。殺蟲組合物的具體實(shí)施方式包括其中昆蟲是草地夜蛾(草地粘蟲)和重組RNA分子是包括具有選自SEQIDNOs:17-19的序列的RNA鏈的dsRNA；其中昆蟲是豆莢草盲蝽(西部無(wú)澤盲蝽)和重組RNA分子是包括具有選自SEQIDNOs:14-16、22、26、45和46的序列的RNA鏈的dsRNA；其中昆蟲是Euschistusheros(新熱帶區(qū)褐臭蝽)和重組RNA分子是包括具有選自SEQIDNOs:23-25的序列的RNA鏈的dsRNA；和其中昆蟲是小菜蛾(菜蛾)和重組RNA分子是包括具有選自SEQIDNOs:13、20-21和28-29的序列的RNA鏈的dsRNA的那些。殺蟲組合物的其他實(shí)施方式包括其中重組RNA分子具有如實(shí)施例5所述修飾的序列以消除與非靶標(biāo)生物，例如表6所公開的修飾序列(SEQIDNOs:30-42)相匹配的那些。0037在各種實(shí)施方式中，殺蟲組合物包括殺蟲有效量的由天然存在的核糖核苷酸(例如在天然存在的RNA中發(fā)現(xiàn)的那些)組成的重組RNA分子。在某些實(shí)施方式中，多核苷酸是核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的組合，例如，合成多核苷酸主要由核糖核苷酸組成但具有一個(gè)或多個(gè)末端脫氧核糖核苷酸或一個(gè)或多個(gè)末端雙脫氧核糖核苷酸。在某些實(shí)施方式中，多核苷酸包括非規(guī)范核苷酸例如次黃嘌呤核苷、硫尿核苷或假尿嘧啶核苷。在某些實(shí)施方式中，多核苷酸包括化學(xué)修飾的核苷酸?；瘜W(xué)修飾的寡核苷酸或多核苷酸的實(shí)例是本領(lǐng)域眾所周知的；參見(jiàn)例如美國(guó)專利公開2011/0171287、美國(guó)專利公開2011/0171176、美國(guó)專利公開2011/0152353、美國(guó)專利公開2011/0152346和美國(guó)專利公開2011/0160082，其通過(guò)引用并入本文。說(shuō)明性實(shí)例包括但不限于，可以用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵合修飾來(lái)部分或完全修飾的天然存在的寡核苷酸或多核苷酸的磷酸二脂主鏈，修飾的核苷堿基或修飾的糖可用于寡核苷酸或多核苷酸合成，且寡核苷酸或多核苷酸可以用熒光性部分(例如熒光素或若丹明)或其他標(biāo)記(例如生物素)標(biāo)記。重組RNA分子通過(guò)本領(lǐng)域已知的合適手段提供。實(shí)施方式包括其中重組RNA分子是化學(xué)合成的(例如通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄、例如利用T7聚合酶或其他聚合酶的轉(zhuǎn)錄)、通過(guò)在微生物中或在細(xì)胞培養(yǎng)物(例如在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的植物或昆蟲細(xì)胞)中表達(dá)產(chǎn)生、通過(guò)在植物細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生或通過(guò)微生物發(fā)酵產(chǎn)生。在實(shí)施方式中，在該方法中使用的重組RNA分子作為分離的RNA片段(不是表達(dá)構(gòu)建體的一部分，即，缺少額外元件例如啟動(dòng)子或終止子序列)提供。這種重組RNA分子可以較短，例如約18到約300或約50到約500個(gè)核苷酸(對(duì)于單鏈多核苷酸)或約18到約300或約50到約500個(gè)堿基對(duì)(對(duì)于雙鏈多核苷酸)的單鏈或雙鏈RNA分子。實(shí)施方式包括其中多核苷酸是包括具有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的片斷的dsRNA。在實(shí)施方式中，殺蟲組合物可以為選自固體、液體、粉末、懸浮液、乳劑、噴霧、包封劑、微珠、載體微粒、薄膜、基質(zhì)、土壤澆灌、昆蟲飲食或昆蟲誘餌和種子處理的形式。在實(shí)施方式中，例如可以通過(guò)在包括dsRNA的液體殺蟲組合物中浸泡種子來(lái)向種子施用殺蟲組合物，其中種子將有效量的dsRNA吸取或攝入種子內(nèi)部或種子胚乳內(nèi)，以通過(guò)種子或植物或由種子生長(zhǎng)的幼苗提供對(duì)改進(jìn)的抗蟲性。在一些實(shí)施方式中，殺蟲組合物以被昆蟲攝取的形式提供，例如提供于向昆蟲進(jìn)食的植物施用的液體、乳劑或粉末中，或以誘餌形式。所述殺蟲組合物可以進(jìn)一步包括一種或多種選自載體試劑、表面活性劑、有機(jī)硅酮化合物、多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸殺蟲劑、安全劑、誘蟲劑和昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的組分。殺蟲組合物可以進(jìn)一步包括至少一種選自馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇蕓金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發(fā)光桿菌屬殺蟲蛋白、側(cè)孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白的殺蟲劑。在實(shí)施方式中，重組RNA分子和殺蟲劑的組合提供協(xié)同作用的昆蟲控制水平，即大于如果單獨(dú)測(cè)試的重組RNA分子和殺蟲劑組分的效果之和。本發(fā)明的相關(guān)方面是用本文所述的殺蟲組合物處理的植物或處理植物的種子，其中所述植物顯示改進(jìn)的抗蟲性。在實(shí)施方式中，與沒(méi)有用殺蟲組合物處理的植物相比，所述顯示改進(jìn)的抗蟲性的植物的特征在于提高的產(chǎn)量。提供具有改進(jìn)的抗蟲性的植物的方法本發(fā)明的另一方面提供一種提供具有改進(jìn)的抗蟲性的植物的方法，包括在植物中表達(dá)包括編碼RNA的DNA的重組DNA構(gòu)建體，所述RNA包括至少一個(gè)與昆蟲的靶基因序列的片段基本上同一或基本上互補(bǔ)的沉默元件，其中所述靶基因序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44，和其中通過(guò)昆蟲攝取RNA導(dǎo)致昆蟲的死亡或發(fā)育障礙。在方法的實(shí)施方式中，沉默元件的序列與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)的同一性或互補(bǔ)性。在具體的實(shí)施方式中，沉默元件是由兩條分離的、基本上互補(bǔ)的鏈形成雙鏈RNA的RNA，其中至少一條RNA鏈包括與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)同一性或互補(bǔ)性的序列。在其他實(shí)施方式中，沉默元件是由單個(gè)自雜交發(fā)夾轉(zhuǎn)錄物形成雙鏈RNA的RNA，其中發(fā)夾的一條“臂”包括與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)同一性或互補(bǔ)性的序列。其他實(shí)施方式包括其中沉默元件具有如實(shí)施例5所述修飾的序列以消除與非靶標(biāo)生物，例如表6所公開的修飾序列(SEQIDNOs:30-42)相匹配的那些。在方法的實(shí)施方式中，重組DNA構(gòu)建體進(jìn)一步包括與編碼RNA的DNA可操作地連接的異源啟動(dòng)子，所述RNA包括至少一個(gè)沉默元件，其中所述異源啟動(dòng)子在植物細(xì)胞中具有功能。在植物細(xì)胞中具有功能的啟動(dòng)子包括標(biāo)題“啟動(dòng)子”下所列的那些。在方法的實(shí)施方式中，重組DNA構(gòu)建體通過(guò)轉(zhuǎn)基因表達(dá)或瞬時(shí)表達(dá)在植物中表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括在植物中表達(dá)至少一種選自馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇蕓金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發(fā)光桿菌屬殺蟲蛋白、側(cè)孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白的殺蟲劑。殺蟲劑可以由包括編碼至少一個(gè)沉默元件的DNA的相同的重組DNA構(gòu)建體表達(dá)，或由不同的重組DNA構(gòu)建體表達(dá)。本發(fā)明的相關(guān)方面是具有改進(jìn)的抗蟲性的植物，或這種植物的種子，其中所述植物通過(guò)包括在植物中表達(dá)重組DNA構(gòu)建體的方法來(lái)提供，所述重組DNA構(gòu)建體包括編碼RNA的DNA，所述RNA包括至少一個(gè)與昆蟲的靶基因序列片段基本上同一或基本上互補(bǔ)的沉默元件，其中所述靶基因序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44，和其中通過(guò)昆蟲攝取RNA導(dǎo)致昆蟲的死亡或發(fā)育障礙。在實(shí)施方式中，與沒(méi)有用殺蟲組合物處理的植物相比，顯示改進(jìn)的抗蟲性的植物的特征在于提高的產(chǎn)量。本發(fā)明也涵蓋通過(guò)這種方法提供并顯示改進(jìn)的抗蟲性的植物的果實(shí)、種子或可繁殖部分。本發(fā)明的相關(guān)方面是具有改進(jìn)的抗蟲性的植物或幼苗，其中所述植物或幼苗由用重組DNA構(gòu)建體處理的種子生長(zhǎng)，所述重組DNA構(gòu)建體包括編碼RNA的DNA，所述RNA包括至少一個(gè)與昆蟲的靶基因序列片段基本上同一或基本上互補(bǔ)的沉默元件，其中所述靶基因序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44；或者所述植物由用RNA直接處理的種子生長(zhǎng)，所述RNA包括至少一個(gè)與昆蟲的靶基因序列片段基本上同一或基本上互補(bǔ)的沉默元件，其中所述靶基因序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44。在實(shí)施方式中，通過(guò)在包括重組DNA構(gòu)建體(或包括至少一個(gè)沉默元件的編碼的RNA)的液體組合物中浸泡種子來(lái)施用重組DNA構(gòu)建體(或包括至少一個(gè)沉默元件的編碼的RNA)，其中種子將有效量DNA或編碼的RNA吸取或攝入種子內(nèi)部或種子胚乳內(nèi)，以通過(guò)由種子生長(zhǎng)的植物或幼苗提供改進(jìn)的抗蟲性。用于昆蟲控制的編碼RNA的重組DNA構(gòu)建體本發(fā)明的另一方面提供包括與編碼RNA轉(zhuǎn)錄物的DNA可操作連接的異源啟動(dòng)子的重組DNA構(gòu)建體，所述RNA轉(zhuǎn)錄物包括與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)同一性或互補(bǔ)性的序列。在具體的實(shí)施方式中，RNA轉(zhuǎn)錄物由分離的、基本上互補(bǔ)的鏈(例如其中一條鏈在分離的DNA構(gòu)建體上編碼或其中兩條鏈在編碼RNA轉(zhuǎn)錄物的DNA的分離部分上編碼，和其是單獨(dú)轉(zhuǎn)錄或單獨(dú)制備，例如在重組酶或核酸酶的作用下)形成雙鏈RNA，其中至少一條RNA鏈包括與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)同一性或互補(bǔ)性的序列。在其他實(shí)施方式中，RNA轉(zhuǎn)錄物由單個(gè)自雜交發(fā)夾轉(zhuǎn)錄物形成雙鏈RNA，其中發(fā)夾的一條“臂”包括與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)同一性或互補(bǔ)性的序列。重組DNA構(gòu)建體的實(shí)施方式包括其中異源啟動(dòng)子對(duì)于在細(xì)菌中表達(dá)RNA轉(zhuǎn)錄物具有功能的那些。在其中重組DNA構(gòu)建體將在細(xì)菌中表達(dá)的實(shí)施方式中，所述細(xì)菌選自大腸桿菌(Escherichiacoli)、桿菌屬(Bacillusspecies)、假單胞細(xì)菌屬(Pseudomonasspecies)、致病桿菌屬(Xenorhabdusspecies)或發(fā)光桿菌屬(Photorhabdusspecies)。在其他實(shí)施方式中，重組DNA構(gòu)建體包括在植物細(xì)胞中具有功能的異源啟動(dòng)子。在實(shí)施方式中，將重組DNA構(gòu)建體包含于重組載體，例如重組植物病毒載體或重組桿狀病毒載體中。在實(shí)施方式中，將重組DNA構(gòu)建體例如通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化整合入植物染色體或質(zhì)體中。本發(fā)明的相關(guān)方面包括其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，和包括這種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法制備，例如在標(biāo)題“制備和使用轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物”下描述的那些。本發(fā)明的進(jìn)一步方面包括由這種轉(zhuǎn)基因植物制備的商品，和轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因后代種子或可繁殖植物部分。相關(guān)的信息和技術(shù)植物用于處理和保護(hù)植物免受昆蟲侵?jǐn)_的本文描述的方法和組合物可用于大量植物。其中可使用本文公開的方法和組合物的適合的植物包括但不限于谷物和飼草(水稻、玉米、小麥、大麥、燕麥、高粱、珍珠稷、龍爪稷、冷季型飼草和百喜草)、油籽作物(大豆、包括加拿大油菜和油籽油菜的油籽蕓苔、向日葵、花生、亞麻、芝麻和紅花)、豆類顆粒和飼料(菜豆、豇豆、豌豆、蠶豆、小扁豆、寬葉菜豆、亞洲豆、木豆、野豌豆、鷹嘴豆、羽扇豆、紫花苜蓿和苜蓿)、溫帶水果和堅(jiān)果(蘋果、梨、桃、李、漿果作物、櫻桃、葡萄、橄欖、杏仁和胡桃)、熱帶和亞熱帶水果和堅(jiān)果(柑橘屬果樹，包括酸橙、桔子和葡萄柚；香蕉和車前草、菠蘿、木瓜、芒果、鱷梨、奇異果、百香果和柿)、蔬菜作物(茄科植物，包括番茄、茄子和胡椒；蔬菜蕓苔；蘿卜、胡蘿卜、葫蘆、蔥屬、蘆筍和葉菜)、糖、塊莖和纖維作物(甘蔗、甜菜、甜菊、馬鈴薯、甘薯、木薯和棉花)、種植作物、觀賞植物和草皮草(煙草、咖啡、可可、茶、橡膠樹、藥用植物、觀賞植物和草皮草)和森林樹種。額外的構(gòu)建體元件本發(fā)明的多核苷酸和核酸分子的實(shí)施方式可以包括額外元件，例如啟動(dòng)子、小RNA識(shí)別位點(diǎn)、適配子或核酶、額外和額外的用于表達(dá)編碼序列(例如，為表達(dá)轉(zhuǎn)基因如殺蟲蛋白或選擇標(biāo)記)或非編碼序列(例如，為表達(dá)額外的抑制元件)的表達(dá)盒。例如，本發(fā)明的一方面提供包括與編碼RNA轉(zhuǎn)錄物的DNA可操作連接的異源啟動(dòng)子的重組DNA構(gòu)建體，所述RNA轉(zhuǎn)錄物包括與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％同一性或互補(bǔ)性的序列。在其他實(shí)施方式中，將包括與DNA可操作連接的啟動(dòng)子的重組DNA構(gòu)建體整合入植物基因組，所述DNA編碼：(a)包括與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％同一性或互補(bǔ)性的序列的RNA轉(zhuǎn)錄物，和(b)適配子，其中包括RNA適配子和RNA沉默元件的RNA轉(zhuǎn)錄物在植物細(xì)胞中表達(dá)；適配子用于將RNA沉默元件引導(dǎo)到細(xì)胞的期望位置。在另一個(gè)實(shí)施方式中，包括小RNA(例如通過(guò)僅在特定細(xì)胞或組織中表達(dá)的miRNA或siRNA)結(jié)合和切割的一個(gè)或多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)允許植物中更精確的表達(dá)模式，其中當(dāng)小RNA表達(dá)時(shí)，重組DNA構(gòu)建體的表達(dá)被抑制。這種額外元件描述如下。啟動(dòng)子本發(fā)明使用的啟動(dòng)子在其中構(gòu)建體意欲轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞中具有功能。通常這些啟動(dòng)子是異源啟動(dòng)子，如重組構(gòu)建體中所使用，即，它們本質(zhì)上不被認(rèn)為是可操作地與本發(fā)明構(gòu)建體中所使用的其他核酸元件連接。在各種實(shí)施方式中，啟動(dòng)子選自組成型啟動(dòng)子、空間特異性啟動(dòng)子、時(shí)間特異性啟動(dòng)子、發(fā)育特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在許多實(shí)施方式中，啟動(dòng)子是在植物中具有功能的啟動(dòng)子，例如polII啟動(dòng)子、polIII啟動(dòng)子、polIV啟動(dòng)子或polV啟動(dòng)子。適用于本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體的非組成型啟動(dòng)子包括空間特異性啟動(dòng)子、時(shí)間特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。空間特異性啟動(dòng)子可以包括細(xì)胞器-、細(xì)胞-、組織-或器官-特異性啟動(dòng)子(例如用于分別在質(zhì)體、根、花粉或種子中表達(dá)的質(zhì)體特異性、根特異性、花粉特異性或種子特異性啟動(dòng)子)。在許多情況下種子-特異性、胚胎-特異性、糊粉-特異性或胚乳-特異性啟動(dòng)子特別有用。時(shí)間特異性啟動(dòng)子可以包括傾向于在植物生長(zhǎng)周期中某些發(fā)育階段期間、或在白天或夜晚的不同時(shí)間期間、或在一年的不同季節(jié)促進(jìn)表達(dá)的啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括通過(guò)化學(xué)品或通過(guò)環(huán)境條件例如但不限于生物或非生物脅迫(例如水分不足或干旱、熱、冷、高或低的營(yíng)養(yǎng)或鹽水平、高或低的光照水平、或害蟲或病原體侵染)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。MicroRNA啟動(dòng)子是有用的，尤其是具有時(shí)間特異性、空間特異性或誘導(dǎo)型表達(dá)模式的那些；miRNA啟動(dòng)子的實(shí)例以及鑒別具有特異性表達(dá)模式的miRNA啟動(dòng)子的方法提供于美國(guó)專利申請(qǐng)公開2006/0200878、2007/0199095和2007/0300329中，其特別通過(guò)引用并入本文。表達(dá)特異性啟動(dòng)子也可以包括一般通過(guò)組成型表達(dá)但以不同程度或“強(qiáng)度”表達(dá)的啟動(dòng)子，包括通常認(rèn)為是“強(qiáng)啟動(dòng)子”或“弱啟動(dòng)子”的啟動(dòng)子。特別感興趣的啟動(dòng)子包括以下實(shí)例：從農(nóng)桿菌的T-DNA分離的蛋白石合酶啟動(dòng)子；花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子；增強(qiáng)的啟動(dòng)子元件或嵌合的啟動(dòng)子元件例如與增強(qiáng)子元件(來(lái)自玉米的熱休克蛋白70的內(nèi)含子)連接的增強(qiáng)的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子；根特異性啟動(dòng)子例如美國(guó)專利5,837,848；6,437,217和6,426,446中公開的那些；美國(guó)專利6,433,252公開的玉米L3油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子；美國(guó)專利申請(qǐng)公開2004/0216189中公開的編碼位于質(zhì)體的醛縮酶的植物核基因的啟動(dòng)子；美國(guó)專利6,084,089公開的冷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；美國(guó)專利6,140,078公開的鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；美國(guó)專利6,294,714公開的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；美國(guó)專利6,252,138公開的病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；和美國(guó)專利申請(qǐng)公布2004/0123347A1公開的水分不足-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。公開了啟動(dòng)子及其使用，尤其是在植物中具有功能的重組DNA構(gòu)建體的所有以上描述的專利和專利公開通過(guò)引用并入本文。感興趣的植物導(dǎo)管或韌皮部特異性啟動(dòng)子包括發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)的rolC或rolA啟動(dòng)子、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)T-DNA基因5的啟動(dòng)子、水稻蔗糖合酶RSs1基因啟動(dòng)子、鴨跖草黃斑駁病毒啟動(dòng)子、椰子葉腐病毒啟動(dòng)子、水稻東格魯桿狀病毒啟動(dòng)子、豌豆谷氨酰胺合酶GS3A基因啟動(dòng)子、馬鈴薯轉(zhuǎn)化酶基因的invCD111和invCD141啟動(dòng)子、Kertbundit等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,88:5212-5216的從擬南芥分離的在煙草中顯示具有韌皮部特異性表達(dá)的啟動(dòng)子、VAHOX1啟動(dòng)子區(qū)域、豌豆細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因啟動(dòng)子、來(lái)自胡蘿卜的酸轉(zhuǎn)化酶基因啟動(dòng)子、硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因Sultr1；3的啟動(dòng)子、植物蔗糖合酶基因的啟動(dòng)子和植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因的啟動(dòng)子。適合與本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體或多核苷酸一起使用的啟動(dòng)子包括聚合酶II(“polII”)啟動(dòng)子和聚合酶III(“polIII”)啟動(dòng)子。RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度通常短于400個(gè)核苷酸的結(jié)構(gòu)或催化性RNA，并將T殘余物的簡(jiǎn)單運(yùn)行識(shí)別為終止信號(hào)；它已經(jīng)用于轉(zhuǎn)錄siRNA雙鏈體(參見(jiàn)例如Lu等.(2004)NucleicAcidsRes.,32:e171)。因此PolII啟動(dòng)子在其中將由本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體來(lái)制備短RNA轉(zhuǎn)錄物的一些實(shí)施方式中是優(yōu)選的。在一個(gè)實(shí)施方式中，重組DNA構(gòu)建體包括PolII啟動(dòng)子以表達(dá)側(cè)翼為自切割核酶序列(例如自切割錘頭核酶)的RNA轉(zhuǎn)錄物，產(chǎn)生經(jīng)加工的RNA，例如結(jié)合Leptinotarsa靶基因的轉(zhuǎn)錄物的單鏈RNA，其具有確定的5'和3'端，不含潛在的干擾側(cè)翼序列。另一種方法使用polIII啟動(dòng)子以生成具有相對(duì)確定的5'和3'端的轉(zhuǎn)錄物，即轉(zhuǎn)錄具有最少5'和3'側(cè)翼序列的RNA。在一些實(shí)施方式中，PolIII啟動(dòng)子(例如U6或H1啟動(dòng)子)對(duì)于增加導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄RNA中2個(gè)堿基對(duì)懸垂(UU)的短的富含AT的轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)而言是優(yōu)選的；這可例如用于表達(dá)siRNA型構(gòu)建體。已經(jīng)報(bào)道使用polIII啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)siRNA構(gòu)建體的表達(dá)；參見(jiàn)vandeWetering等.(2003)EMBORep.,4:609-615,和Tuschl(2002)NatureBiotechnol.,20:446-448。桿狀病毒啟動(dòng)子例如桿狀病毒多角體蛋白和p10啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知且可商購(gòu)的；例如參見(jiàn)Invitrogen的“GuidetoBaculovirusExpressionVectorSystems(BEVS)andInsectCellCultureTechniques”,2002(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)和F.J.Haines等“BaculovirusExpressionVectors”,未標(biāo)注日期的(OxfordExpressionTechnologies,Oxford,UK)。啟動(dòng)子元件可以包括非天然存在的啟動(dòng)子或啟動(dòng)子元件或其同源物但可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)的核酸序列。這種“與基因無(wú)關(guān)的”調(diào)控序列的實(shí)例包括包含配體結(jié)合區(qū)域或適配子(參見(jiàn)下文“適配子”)和調(diào)控區(qū)域(其可以是順式作用)的天然存在或人工設(shè)計(jì)的RNA序列。參見(jiàn)例如Isaacs等(2004)Nat.Biotechnol.,22:841-847,BayerandSmolke(2005)NatureBiotechnol.,23:337-343,MandalandBreaker(2004)NatureRev.Mol.CellBiol.,5:451-463,DavidsonandEllington(2005)TrendsBiotechnol.,23:109-112,Winkler等(2002)Nature,419:952-956,Sudarsan等(2003)RNA,9:644-647,andMandalandBreaker(2004)NatureStruct.Mol.Biol.,11:29-35?？梢詾榫唧w的空間或時(shí)間特異性選擇或設(shè)計(jì)這種“核糖調(diào)節(jié)子”，例如，僅在存在(或不存在)合適配體的給定濃度的情況下調(diào)控DNA的翻譯，所述DNA編碼用于抑制靶基因的沉默元件。一個(gè)實(shí)例是在脅迫下(例如非生物脅迫例如水、溫度或營(yíng)養(yǎng)脅迫、或生物脅迫例如粘附害蟲或病原體)植物產(chǎn)生的對(duì)內(nèi)源性配體(例如茉莉酮酸或水楊酸)起反應(yīng)的核糖調(diào)節(jié)子；在脅迫下，內(nèi)源性配體的水平增加到足以使核糖調(diào)節(jié)子開始轉(zhuǎn)錄DNA的水平，所述DNA編碼用于抑制靶基因的沉默元件。重組酶位點(diǎn)在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體或多核苷酸包括編碼一個(gè)或個(gè)位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別位點(diǎn)的DNA。在一個(gè)實(shí)施方式中，重組DNA構(gòu)建體包括至少一對(duì)loxP位點(diǎn)，其中l(wèi)oxP位點(diǎn)之間的DNA的位點(diǎn)特異性重組通過(guò)Cre重組酶介導(dǎo)。選擇loxP位點(diǎn)的位置和相對(duì)方向以實(shí)現(xiàn)期望的重組；例如，當(dāng)loxP位點(diǎn)處于相同方向時(shí)，loxP位點(diǎn)之間的DNA以環(huán)形切除。在另一個(gè)實(shí)施方式中，重組DNA構(gòu)建體包括編碼一個(gè)loxP位點(diǎn)的DNA；在Cre重組酶和另一個(gè)具有l(wèi)oxP位點(diǎn)的DNA存在下，兩個(gè)DNA重組。適配子在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體或多核苷酸包括加工至RNA適配子的DNA，即通過(guò)并非主要基于Watson-Crick堿基配對(duì)的結(jié)合機(jī)制結(jié)合配體的RNA(例如，與互補(bǔ)的反平行核酸鏈之間發(fā)生的以形成雙鏈核酸結(jié)構(gòu)的堿基配對(duì)相反)。例如參見(jiàn)EllingtonandSzostak(1990)Nature,346:818-822。適配子的實(shí)例可以例如發(fā)現(xiàn)于公眾適配子數(shù)據(jù)庫(kù)，于aptamer.icmb.utexas.edu在線可得(Lee等.(2004)NucleicAcidsRes.,32(1):D95-100)。然而，本發(fā)明中可用的適配子可以是單價(jià)的(結(jié)合單個(gè)配體)或多價(jià)的(結(jié)合超過(guò)一個(gè)單獨(dú)配體，例如結(jié)合兩個(gè)或更多個(gè)不同配體的一個(gè)單元)。可用于本發(fā)明的配體包括核酸次級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)并非主要基于Watson-Crick堿基配對(duì)的機(jī)制可以識(shí)別并結(jié)合的任何分子(或分子部分)。以這種方法，配體和適配子的識(shí)別和結(jié)合類似于抗原和抗體那樣，或生物效應(yīng)子和受體那樣。配體可以包括單個(gè)分子(或分子部分)、或兩個(gè)或更多個(gè)分子(或分子部分)的組合，且可以包括一個(gè)或多個(gè)高分子絡(luò)合物(例如聚合物、脂質(zhì)雙層、脂質(zhì)體、細(xì)胞膜或其他的細(xì)胞結(jié)構(gòu)或細(xì)胞表面)。具體的配體實(shí)例包括維生素例如輔酶B12和焦磷酸硫胺素、黃素單核苷酸、鳥嘌呤、腺苷、S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷高半胱氨酸、輔酶A、賴氨酸、酪氨酸、多巴胺、葡糖胺-6-磷酸酯、咖啡因、茶堿、抗生素例如氯霉素和新霉素、除草劑例如草甘磷和麥草畏；蛋白質(zhì)，包括病毒或噬菌體外殼蛋白和無(wú)脊椎動(dòng)物表皮或消化道表面蛋白質(zhì)；和RNA，包括病毒RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(t-RNA)、核糖體RNA(rRNA)和RNA聚合酶例如RNA依賴性的RNA聚合酶(RdRP)?？捎糜诒景l(fā)明的一類RNA適配子是不結(jié)合配體但熱響應(yīng)的“熱開關(guān)”，即適配子的構(gòu)象由溫度決定；參見(jiàn)例如Box3inMandalandBreaker(2004)NatureRev.Mol.CellBiol.,5:451-463。轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單位在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體或多核苷酸包括轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單位。轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單位包括編碼目的基因例如天然蛋白質(zhì)或異源蛋白質(zhì)的DNA序列。目的基因可以是來(lái)自任何物種(包括但不限于非真核生物例如細(xì)菌和病毒；真菌、原生生物、植物、無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物)的任何編碼或非編碼序列。特定的目的基因是編碼至少一種選自馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇蕓金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發(fā)光桿菌屬殺蟲蛋白、側(cè)孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白的殺蟲劑的基因。根據(jù)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄需要，轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單位可以進(jìn)一步包括5'或3'序列或兩者。內(nèi)含子在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體或多核苷酸包括編碼可剪切內(nèi)含子的DNA。“內(nèi)含子”通常是指位于外顯子(DNA的蛋白質(zhì)編碼片斷或相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄RNA)之間的DNA片斷(或由這種片斷轉(zhuǎn)錄的RNA)，其中，在信使RNA成熟期間，所存在的內(nèi)含子通過(guò)在真核生物的核中發(fā)生的切割/連接過(guò)程從RNA鏈酶促“剪切出去”或去除。術(shù)語(yǔ)“內(nèi)含子”也適用于非編碼DNA序列，其轉(zhuǎn)錄為可以從成熟RNA轉(zhuǎn)錄物剪切出去但不是在蛋白質(zhì)編碼的外顯子之間發(fā)現(xiàn)的內(nèi)含子的RNA片斷。這樣的一個(gè)實(shí)例是植物中能夠增強(qiáng)下游編碼序列表達(dá)(有時(shí)，尤其在單子葉植物中)的可剪切序列；這些可剪切序列天然位于一些植物基因的5'非翻譯區(qū)，以及一些病毒基因中(例如煙草花葉病毒5'前導(dǎo)序列或由GallieandWalbot(1992)NucleicAcidsRes.,20:4631-4638描述為增強(qiáng)植物基因表達(dá)的“Ω”前導(dǎo)序列)。這些可剪切序列或“增強(qiáng)表達(dá)的內(nèi)含子”可以人工插入啟動(dòng)子和任何蛋白質(zhì)編碼外顯子之間的植物基因的5'非翻譯區(qū)。這種增強(qiáng)表達(dá)的內(nèi)含子的實(shí)例包括但不限于玉米乙醇脫氫酶(Zm-Adh1)、玉米Bronze-1增強(qiáng)表達(dá)的內(nèi)含子、水稻肌動(dòng)蛋白1(Os-Act1)內(nèi)含子、Shrunken-1(Sh-1)內(nèi)含子、玉米蔗糖合酶內(nèi)含子、熱休克蛋白18(hsp18)內(nèi)含子和82千道爾頓熱休克蛋白(hsp82)內(nèi)含子。通過(guò)引用特別引入本文的美國(guó)專利5,593,874和5,859,347描述了通過(guò)在位于基因啟動(dòng)子的3'和第一個(gè)蛋白質(zhì)編碼外顯子的5'的非翻譯前導(dǎo)序列中引入源自70千道爾頓玉米熱休克蛋白(hsp70)的增強(qiáng)表達(dá)的內(nèi)含子來(lái)改進(jìn)用于植物的重組DNA構(gòu)建體的方法。核酶在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體或多核苷酸包括編碼一種或多種核酶的DNA。特別感興趣的核酶包括自切割核酶、錘頭核酶、或發(fā)夾核酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，重組DNA構(gòu)建體包括編碼一種或多種用來(lái)切割轉(zhuǎn)錄RNA以提供確定的RNA片斷(例如用于抑制Leptinotarsa靶基因的沉默元件)的核酶的DNA?；蛞种圃谝恍?shí)施方式中，本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體或多核苷酸包括編碼額外的基因抑制元件的DNA，所述額外的基因抑制元件用于抑制除Leptinotarsa靶基因以外的靶基因。待抑制的靶基因可以包括編碼或非編碼序列或兩者。適合的基因抑制元件詳細(xì)描述于美國(guó)專利申請(qǐng)公開2006/0200878，其公開通過(guò)引用特別引入本文，且包括一個(gè)或多個(gè)：(a)包括至少一個(gè)反義DNA片斷(即對(duì)至少一個(gè)待抑制的基因片斷是反義的)的DNA；(b)包括至少一個(gè)反義DNA片斷(即對(duì)至少一個(gè)待抑制的基因片斷是反義的)的多個(gè)拷貝的DNA；(c)包括至少一個(gè)有義DNA片斷(即至少一個(gè)待抑制的基因片斷)的DNA；(d)包括至少一個(gè)有義DNA片斷(即至少一個(gè)待抑制的基因片斷)的多個(gè)拷貝的DNA；(e)轉(zhuǎn)錄為通過(guò)形成雙鏈RNA來(lái)抑制待抑制的基因的RNA且包括至少一個(gè)反義DNA片斷(即對(duì)至少一個(gè)待抑制的基因片斷是反義的)和至少一個(gè)有義DNA片斷(即至少一個(gè)待抑制的基因片斷)的DNA；(f)轉(zhuǎn)錄為通過(guò)形成單個(gè)雙鏈RN來(lái)抑制待抑制的基因的RNA且包括多個(gè)串聯(lián)的反義DNA片斷(即對(duì)至少一個(gè)待抑制的基因片斷是反義的)和多個(gè)串聯(lián)的有義DNA片斷(即至少一個(gè)待抑制的基因片斷)的DNA；(g)轉(zhuǎn)錄為通過(guò)形成多個(gè)雙鏈RNA來(lái)抑制待抑制的基因的RNA且包括多個(gè)反義DNA片斷(即對(duì)至少一個(gè)待抑制的基因片斷是反義的)和多個(gè)有義DNA片斷(即至少一個(gè)待抑制的基因片斷)的DNA，其中所述多個(gè)反義DNA片斷和多個(gè)有義DNA片斷排列在一系列反向重復(fù)序列中；(h)包括源自植物miRNA的核苷酸的DNA；(i)包括siRNA核苷酸的DNA；(j)轉(zhuǎn)錄為能夠結(jié)合配體的RNA適配子的DNA；和(k)轉(zhuǎn)錄為能夠結(jié)合配體的RNA適配子的DNA，和轉(zhuǎn)錄為能夠調(diào)控待抑制基因的表達(dá)的調(diào)控RNA的DNA，其中所述調(diào)控依賴于調(diào)控RNA的構(gòu)象，調(diào)控RNA的構(gòu)象受RNA適配子的結(jié)合狀態(tài)的變構(gòu)影響。在一些實(shí)施方式中，內(nèi)含子用于在缺少任何蛋白編碼外顯子(編碼序列)的情況下遞送基因抑制元件。在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)將基因抑制元件埋入內(nèi)含子來(lái)中斷內(nèi)含子例如表達(dá)增強(qiáng)內(nèi)含子(在某些實(shí)施方式中是優(yōu)選的)，其中在轉(zhuǎn)錄時(shí)，基因抑制元件從內(nèi)含子切除。因此，不要求蛋白編碼外顯子提供本文公開的重組DNA構(gòu)建體的基因抑制功能。轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體或多核苷酸包括編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的DNA。轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包括調(diào)控本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體的表達(dá)水平(相對(duì)于缺少這種調(diào)控元件情況下的它的表達(dá))的元件。適合的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的實(shí)例包括核糖開關(guān)(順式或反式作用)、轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定序列和miRNA識(shí)別位點(diǎn)，如美國(guó)專利申請(qǐng)公布2006/0200878所詳細(xì)描述，通過(guò)引用特別引入本文。制備和使用轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物植物轉(zhuǎn)化可以包括任何若干種眾所周知的方法和組合物。用于植物轉(zhuǎn)化的適合的方法幾乎包括可以將DNA引入細(xì)胞的任何方法。植物轉(zhuǎn)化的一種方法是微粒轟擊，例如，如美國(guó)專利5,015,580(大豆)、5,538,880(玉米)、5,550,318(玉米)、5,914,451(大豆)、6,153,812(小麥)、6,160,208(玉米)、6,288,312(水稻)、6,365,807(水稻)和6,399,861(玉米)和6,403,865(玉米)所述，所有專利通過(guò)引用引入以能夠生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物。植物轉(zhuǎn)化的另一種有用的方法是借助于包含二元Ti質(zhì)粒系統(tǒng)的農(nóng)桿菌的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中農(nóng)桿菌攜帶第一Ti質(zhì)粒和包含至少一種野生型Ti質(zhì)粒的T-DNA邊界的第二嵌合質(zhì)粒、在轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中具有功能且可操作地連接至本發(fā)明多核苷酸或重組DNA構(gòu)建體的啟動(dòng)子。參見(jiàn)例如通過(guò)引用引入的美國(guó)專利5,159,135中描述的二元系統(tǒng)。還參見(jiàn)DeFramond(1983)Biotechnology,1:262-269；andHoekemaetal.,(1983)Nature,303:179。在這種二元系統(tǒng)中，包含一個(gè)或多個(gè)T-DNA邊界的較小質(zhì)?？稍谶m合的選擇性寄主例如大腸桿菌中方便地構(gòu)建和操作，然后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物(特別是作物植物)轉(zhuǎn)化的詳細(xì)程序包括美國(guó)專利5,004,863、5,159,135和5,518,908(棉花)；5,416,011、5,569,834、5,824,877和6,384,301(大豆)；5,591,616和5,981,840(玉米)、5,463,174(蕓苔，包括加拿大油菜)、7,026,528(小麥)和6,329,571(水稻)和美國(guó)專利申請(qǐng)公布2004/0244075(玉米)和2001/0042257A1(甜菜)中公開的程序，所有專利通過(guò)引用特別引入以能夠生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物。美國(guó)專利申請(qǐng)公開2011/0296555在實(shí)施例5中公開了轉(zhuǎn)化載體(包括載體序列)和轉(zhuǎn)化玉米、大豆、加拿大油菜、棉花和甘蔗的詳細(xì)方案，其通過(guò)引用特別引入以能夠生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物。在雙子葉植物和單子葉植物的許多植物品種中已經(jīng)報(bào)道了類似的方法，尤其包括花生(Cheng等(1996)PlantCellRep.,15:653)；蘆筍(Bytebier等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,84:5345)；大麥(WanandLemaux(1994)PlantPhysiol.,104:37)；水稻(Toriyama等(1988)Bio/Technology,6:10；Zhang等(1988)PlantCellRep.,7:379；小麥(Vasil等(1992)Bio/Technology,10:667；Becker等(1994)PlantJ.,5:299)，紫花苜蓿(Masoud等(1996)Transgen.Res.,5:313)；和番茄(Sun等(2006)PlantCellPhysiol.,47:426-431)。還參見(jiàn)通過(guò)引用引入的美國(guó)專利申請(qǐng)公開2003/0167537A1中的載體、轉(zhuǎn)化方法和生產(chǎn)轉(zhuǎn)化的擬南芥(Arabidopsisthaliana)植物的描述，其中轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)CaMV35S啟動(dòng)子組成性表達(dá)。尤其對(duì)茄科植物有用的轉(zhuǎn)化方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如參見(jiàn)番茄(Sharma等(2009),J.Biosci.,34:423-433)、茄子(Arpaia等(1997)Theor.Appl.Genet.,95:329-334)、馬鈴薯(Bannerjee等(2006)PlantSci.,170:732-738；Chakravarty等(2007)Amer.J.PotatoRes.,84:301-311；S.Millam“Agrobacterium-mediatedtransformationofpotato.”Chapter19(pp.257-270),“TransgenicCropsoftheWorld:EssentialProtocols”,IanS.Curtis(editor),Springer,2004)和胡椒(Li等(2003)PlantCellReports,21:785-788)的公開描述的轉(zhuǎn)化方法。穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯、番茄和茄子已經(jīng)商業(yè)化引入各種區(qū)域；參見(jiàn)例如K.Redenbaugh等“SafetyAssessmentofGeneticallyEngineeredFruitsandVegetables:ACaseStudyoftheFLAVRSAVRTMTomato”,CRCPress,BocaRaton,1992，和GM作物數(shù)據(jù)庫(kù)中商業(yè)的轉(zhuǎn)基因作物的廣泛公開可獲得的記錄，參見(jiàn)：CERA.(2012).GMCropDatabase.CenterforEnvironmentalRiskAssessment(CERA),ILSIResearchFoundation,WashingtonD.C.，在www.cera-gmc.org/？action＝gm_crop_database上電子可獲得。其他植物品種的各種轉(zhuǎn)化方法是本領(lǐng)域眾所周知的，例如參見(jiàn)百科全書參考文獻(xiàn)，“CompendiumofTransgenicCropPlants”，由ChittaranjanKole和TimothyC.Hall編輯，BlackwellPublishingLtd.,2008；ISBN978-1-405-16924-0(在mrw.interscience.wiley.com/emrw/9781405181099/hpt/toc電子可獲得)，其描述了谷物和飼草(水稻、玉米、小麥、大麥、燕麥、高粱、珍珠稷、龍爪稷、冷季型飼草和百喜草)、油籽作物(大豆、油籽蕓苔、向日葵、花生、亞麻、芝麻和紅花)、豆類顆粒和飼料(菜豆、豇豆、豌豆、蠶豆、小扁豆、寬葉菜豆、亞洲豆、木豆、野豌豆、鷹嘴豆、羽扇豆、紫花苜蓿和苜蓿)、溫帶水果和堅(jiān)果(蘋果、梨、桃、李、漿果作物、櫻桃、葡萄、橄欖、杏仁和胡桃)、熱帶和亞熱帶水果和堅(jiān)果(柑橘屬果樹、葡萄柚、香蕉和車前草、菠蘿、番木瓜、芒果、鱷梨、奇異果、雞蛋果和柿)、蔬菜作物(番茄、茄子、胡椒、蔬菜蕓苔、蘿卜、胡蘿卜、葫蘆、蔥屬、蘆筍和葉菜)、糖、塊莖和纖維作物(甘蔗、甜菜、甜菊、馬鈴薯、甘薯、木薯和棉花)、種植作物、觀賞植物和草皮草(煙草、咖啡、可可粉、茶、橡膠樹、藥用植物、觀賞植物和草皮草)和森林樹種的轉(zhuǎn)化方案。提供包含穩(wěn)定整合的重組DNA的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)化方法優(yōu)選在培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)物中和在受控環(huán)境中實(shí)踐?！芭囵B(yǎng)基”是指用于體外(即在完整活生物之外)生長(zhǎng)細(xì)胞的多種營(yíng)養(yǎng)素混合物。受體細(xì)胞靶標(biāo)包括但不限于分生組織細(xì)胞、愈傷組織、未成熟胚胎或胚胎部分和配子細(xì)胞例如小孢子、花粉、精子和卵細(xì)胞。可以從其再生可育植物的任何細(xì)胞用作實(shí)踐本發(fā)明的受體細(xì)胞。愈傷組織可以源自各種組織來(lái)源，包括但不限于未成熟胚胎或胚胎部分、幼苗頂端分生組織、小孢子等。像愈傷組織一樣能夠繁殖的那些細(xì)胞可以用作遺傳轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞。用于制備本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物的實(shí)際的轉(zhuǎn)化方法和材料(例如各種培養(yǎng)基和受體靶細(xì)胞、未成熟胚胎的轉(zhuǎn)化和隨后可育轉(zhuǎn)基因植物的再生)例如公開于通過(guò)引用特別引入的美國(guó)專利6,194,636和6,232,526和美國(guó)專利申請(qǐng)公布2004/0216189中。在一般的轉(zhuǎn)化實(shí)踐中，在任何一個(gè)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中僅將DNA引入小百分比的靶細(xì)胞中。標(biāo)記基因通常用于提供鑒別通過(guò)將轉(zhuǎn)基因DNA構(gòu)建體接受和整合入它們的基因組中穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞的有效系統(tǒng)。優(yōu)選的標(biāo)記基因提供賦予對(duì)選擇劑例如抗生素或除草劑的抗性的選擇性標(biāo)志。植物細(xì)胞抵抗的任何抗生素或除草劑可以是用于選擇的有用試劑。將潛在的轉(zhuǎn)化細(xì)胞暴露于選擇劑。在存活細(xì)胞群中存在其中通常整合了抗性賦予基因并以足夠水平表達(dá)以允許細(xì)胞存活的那些細(xì)胞?？梢赃M(jìn)一步測(cè)試細(xì)胞以證實(shí)重組DNA的穩(wěn)定整合。通常使用的選擇性標(biāo)記基因包括賦予對(duì)抗生素例如卡那霉素或巴龍霉素(nptII)、潮霉素B(aphIV)和慶大霉素(aac3和aacC4)的抗性或?qū)Τ輨├绮荻§?bar或pat)和草甘磷(EPSPS)的抗性的那些。有用的選擇性標(biāo)記基因和選擇試劑的實(shí)例闡明于美國(guó)專利5,550,318、5,633,435、5,780,708和6,118,047中，所有專利通過(guò)引用具體引入。也可使用可篩選標(biāo)記或報(bào)道基因，例如提供視覺(jué)鑒別轉(zhuǎn)化體的能力的標(biāo)記。有用的可篩選標(biāo)記包括例如表達(dá)通過(guò)作用于顯色底物產(chǎn)生可檢測(cè)顏色的蛋白的基因(例如β葡糖苷酸酶(GUS)(uidA)或熒光素酶(luc))，或蛋白本身是可檢測(cè)的，例如綠色熒光蛋白(GFP)(gfp)或免疫原性分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可以應(yīng)用許多其他有用的標(biāo)記或報(bào)道基因。檢測(cè)或測(cè)量轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄可以通過(guò)任何適合的方法實(shí)現(xiàn)，包括蛋白質(zhì)檢測(cè)方法(例如蛋白質(zhì)印跡、ELISA、和其他免疫化學(xué)方法)、測(cè)量酶活性或核酸檢測(cè)方法(例如Southern印跡、Northern印跡、PCR、RT-PCR、熒光原位雜交)。其他用于檢測(cè)或測(cè)量植物細(xì)胞中本發(fā)明的靶向昆蟲靶基因的重組多核苷酸的轉(zhuǎn)錄的適合的方法包括測(cè)量與不存在重組多核苷酸情況下觀察的表達(dá)水平相比，作為昆蟲中的靶基因表達(dá)水平的直接或代表指示的任何其他性狀，例如昆蟲的生長(zhǎng)率、死亡率或再生率或補(bǔ)充率，或測(cè)量植物中或受昆蟲侵染的植物田間的損傷(例如根損傷)或產(chǎn)量損失。通常，用于檢測(cè)或測(cè)量植物細(xì)胞中目標(biāo)重組多核苷酸的轉(zhuǎn)錄的適合的方法包括，例如總體或微觀的形態(tài)學(xué)性狀、生長(zhǎng)率、產(chǎn)量、再生率或補(bǔ)充率、對(duì)害蟲或病原體的抗性、或?qū)ι锘蚍巧锩{迫(例如水分不足脅迫、鹽脅迫、營(yíng)養(yǎng)素脅迫、熱或冷脅迫)的抗性。這種方法可以使用表型性狀的直接測(cè)量或代表性分析(例如，在植物中，這些分析包括植物部分分析，例如葉或根分析以測(cè)定非生物脅迫的耐受性)。這種方法包括直接測(cè)量對(duì)無(wú)脊椎害蟲或病原體的抗性(例如對(duì)植物組織的損害)或代表性分析(例如植物產(chǎn)量分析、或無(wú)脊椎害蟲生物學(xué)分析例如西部玉米根蟲(DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte)幼蟲的生物學(xué)分析，如通過(guò)引用特別引入的國(guó)際專利申請(qǐng)公布WO2005/110068A2和美國(guó)專利申請(qǐng)公布US2006/0021087A1中所描述；或如Steeves等(2006)Funct.PlantBiol.,33:991-999所描述的大豆孢囊線蟲病生物學(xué)分析，其中測(cè)量每棵植物的孢囊、每克根的孢囊、每棵植物的蟲卵、每克根的蟲卵和每個(gè)孢囊的蟲卵；或本文工作實(shí)施例中描述的生物學(xué)分析。本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體可以例如通過(guò)表達(dá)或抑制其他基因來(lái)用其他重組DNA堆疊以賦予額外的性狀(例如在轉(zhuǎn)化植物情況下，性狀包括除草劑抗性、抗蟲性、冷萌芽耐受性、水分不足耐受性等)。用于協(xié)調(diào)降低和增加基因表達(dá)的構(gòu)建體公開于通過(guò)引用特別引入的美國(guó)專利申請(qǐng)公布2004/0126845A1中?？梢允斋@可育轉(zhuǎn)基因植物的種子并用于生長(zhǎng)在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物的后代，包括雜合代。因此，除用本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化植物之外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以通過(guò)使具有重組DNA的第一植物與缺乏所述構(gòu)建體的第二植物雜交來(lái)制備。例如，可以將重組DNA引入適合轉(zhuǎn)化的株系以生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，其可以與第二株系雜交以將重組DNA基因滲入由此產(chǎn)生的后代中。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以與具有賦予一種或多種額外性狀(例如但不限于除草劑抗性、害蟲或疾病抗性、環(huán)境脅迫抗性、改變的營(yíng)養(yǎng)含量和產(chǎn)量提高)的其他重組DNA的株系雜交以生產(chǎn)具有賦予期望的靶序列表達(dá)行為和額外性狀兩者的重組DNA的后代植物。在這種組合性狀的育種中，賦予額外性狀的轉(zhuǎn)基因植物可以是雄系(授粉器)，攜帶基本性狀的轉(zhuǎn)基因植物可以是雌系。這種雜交的后代分離，使得一些植物將攜帶兩個(gè)親本性狀的DNA和一些將攜帶一個(gè)親本性狀的DNA；這種植物可以通過(guò)與親本重組DNA有關(guān)的標(biāo)記來(lái)鑒別。攜帶兩個(gè)親本性狀的DNA的后代植物可以與雌性親本系回交多次，例如通常為6到8代，以生產(chǎn)具有與原始轉(zhuǎn)基因親本系基本上相同的基因型以及其他轉(zhuǎn)基因親本系的重組DNA的純合子后代。本發(fā)明的又一方面是由本發(fā)明轉(zhuǎn)基因種子生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明預(yù)期直接由包含重組DNA的轉(zhuǎn)基因種子生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植物以及植物的后代，包括通過(guò)將直接由轉(zhuǎn)基因種子生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植物與不由相同的轉(zhuǎn)基因種子生長(zhǎng)的第二植物雜交制備的近交或雜合株系。雜交例如可包括以下步驟：(a)種植第一親本植物(例如非轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因)和根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)基因的第二親本植物的種子；(b)使第一和第二親本植物的種子生長(zhǎng)為攜帶花的植物；(c)用來(lái)自第二親本的花粉對(duì)來(lái)自第一親本的花授粉；和(d)收獲在攜帶受精花的親本植物上產(chǎn)生的種子。通常期望的是將重組DNA基因例如通過(guò)回交滲入優(yōu)良品種，以將特異性期望性狀從一種來(lái)源轉(zhuǎn)移入缺乏這種性狀的近交種或其他植物。這可以例如通過(guò)首先將高級(jí)近交種(“A”)(回交親本)與攜帶所討論的性狀的適當(dāng)基因(例如根據(jù)本發(fā)明制備的構(gòu)建體)的供體近交種(“B”)(非回交親本)雜交來(lái)實(shí)現(xiàn)。在生成的后代中首先選擇具有待從非回交親本“B”中轉(zhuǎn)移的期望性狀的雜交后代，然后將所選擇的后代與高級(jí)回交親本“A”回交。選擇期望性狀五代或更多代回交代之后，后代的控制待轉(zhuǎn)移特征的基因座基本上是半合子的，但大多數(shù)或幾乎所有的其他基因類均似于高級(jí)親本。將最后的回交代自交以提供待轉(zhuǎn)移基因是純種育種的后代，即一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)化事件。通過(guò)一系列育種操作，可將所選擇的DNA構(gòu)建體從一個(gè)品系移入完全不同的品系中，而無(wú)需進(jìn)一步的重組操作。因此可以生產(chǎn)對(duì)于一個(gè)或多個(gè)DNA構(gòu)建體是真正育種的近交種植物。通過(guò)雜交不同的近交種植物，可以生產(chǎn)大量具有DNA構(gòu)建體的不同組合的不同雜交種。以這種方法，可以生產(chǎn)植物，其具有經(jīng)常與雜交種有關(guān)的期望的農(nóng)學(xué)性質(zhì)(“雜交種優(yōu)勢(shì)”)，以及通過(guò)一個(gè)或多個(gè)DNA構(gòu)建體賦予的期望的特征。在本發(fā)明的某些轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物中，有時(shí)期望同時(shí)表達(dá)目的基因，同時(shí)還調(diào)節(jié)Leptinotarsa靶基因的表達(dá)。因此，在一些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因植物包含進(jìn)一步包括用于表達(dá)至少一種目的基因的基因表達(dá)元件的重組DNA，且本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄優(yōu)選用基因表達(dá)元件的同時(shí)發(fā)生的轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體可以在任何植物細(xì)胞或組織或在任何發(fā)育階段的整個(gè)植物中轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)基因植物可以源自任何單子葉或雙子葉植物，例如但不限于，商業(yè)或農(nóng)學(xué)目的的植物，例如作物植物(尤其是用于人食物或動(dòng)物飼料的作物植物)、生產(chǎn)木材或紙漿的樹、蔬菜植物、水果植物和觀賞植物。目的植物的實(shí)例包括谷類作物植物(例如小麥、燕麥、大麥、玉米、黑麥、黑小麥、水稻、稷、高粱、奎藜籽、莧屬植物和蕎麥)；飼料作物植物(例如飼草和飼料雙子葉植物，包括紫花苜蓿、野豌豆、三葉草等)；油籽作物植物(例如棉花、紅花、向日葵、大豆、加拿大油菜、油菜籽、亞麻、花生和油棕)；木本堅(jiān)果(例如胡桃、腰果、榛子、山核桃、杏仁等)；甘蔗、椰子、海棗、橄欖、甜菜、茶和咖啡；生產(chǎn)木材或紙漿的樹；蔬菜作物植物例如豆科植物(例如豆、豌豆、小扁豆、紫花苜蓿、花生)、萵苣、蘆筍、朝鮮薊、芹菜、胡蘿卜蘿卜、蕓苔(例如卷心菜、羽衣甘藍(lán)、芥末和其他葉狀蕓苔、椰菜、花椰菜、芽甘藍(lán)、蕪菁、甘藍(lán))、食用葫蘆(例如黃瓜、甜瓜、西葫蘆、筍瓜)、食用蔥屬植物(例如洋蔥、大蒜、韭蔥、蔥、細(xì)香蔥)、食用茄科成員(例如番茄、茄子、馬鈴薯、胡椒、酸漿)和食用藜科成員(例如甜菜、君達(dá)菜、菠菜、奎藜籽、莧屬植物)；水果作物植物例如蘋果、梨、柑桔類水果(例如橙、酸橙、檸檬、葡萄柚和其他)、核果(例如杏、桃、李、油桃)、香蕉、菠蘿、葡萄、奇異果、木瓜、鱷梨和漿果；為生物質(zhì)或生物燃料而生長(zhǎng)的植物(例如芒草、柳枝稷、麻風(fēng)樹、油棕、真核微藻例如布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)、小球藻屬(Chlorellaspp.)和鹽藻屬(Dunaliellaspp.)和真核大藻例如江蘺屬(Gracilariaspp.)和馬尾藻屬(Sargassumspp.)；和觀賞植物，包括觀賞開花植物、觀賞樹木、裝飾地被植物和觀賞禾草。本發(fā)明還提供由本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物或種子產(chǎn)生的商品，包括但不限于收獲的葉、根、枝、塊莖、莖、果實(shí)、種子或植物的其他部分、膳食、油、提取物、發(fā)酵或消化產(chǎn)品、植物的壓碎或整?；蚍N子、或包括由本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物或種子產(chǎn)生的這種商品的任何食品或非食品產(chǎn)品。在本文預(yù)期的一種或多種商品或商品產(chǎn)品中檢測(cè)到本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體的一個(gè)或多個(gè)核酸序列事實(shí)上是該商品或商品產(chǎn)品包含或源自于本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物或種子的證據(jù)。通常在其基因組中具有本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出對(duì)昆蟲侵?jǐn)_的增加的抗性。在各種實(shí)施方式中，例如，當(dāng)轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)與賦予額外性狀的其他重組DNA堆疊的本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體時(shí)，相對(duì)于缺乏所述重組DNA構(gòu)建體的植物，轉(zhuǎn)基因植物具有至少一種選自以下的額外改變的性狀：(a)改進(jìn)的非生物脅迫耐受性；(b)改進(jìn)的生物脅迫耐受性；(c)改變的初級(jí)代謝物組成；(d)改變的次級(jí)代謝物組成；(e)改變的微量元素、類胡蘿卜素或維生素組成；(f)提高的產(chǎn)量；(g)改進(jìn)的使用氮、磷酸酯或其他營(yíng)養(yǎng)素的能力；(h)改變的農(nóng)藝性狀；(i)改變的生長(zhǎng)或再生特征；和(j)改進(jìn)的收獲、儲(chǔ)存或加工質(zhì)量。在一些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因植物的特征在于：改進(jìn)的非生物脅迫耐受性(例如水分不足或干旱、熱、冷、非最佳營(yíng)養(yǎng)或鹽水平、非最佳光照水平的耐受性)或改進(jìn)的生物脅迫耐受性(例如群集、植化相克或創(chuàng)傷)；改變的初級(jí)代謝物(例如脂肪酸、油、氨基酸、蛋白質(zhì)、糖或碳水化合物)組成；改變的次級(jí)代謝物(例如生物堿、萜、聚酮化合物、非核糖體肽和混合的生物合成來(lái)源的次級(jí)代謝物)組成；改變的微量元素(例如鐵、鋅)、類胡蘿卜素(例如β葉紅素、番茄紅素、葉黃素、玉米黃素或其他的類胡蘿卜素和葉黃素)或維生素(例如生育酚)組成；提高的產(chǎn)量(例如在非脅迫條件下提高的產(chǎn)量或在生物或非生物脅迫下提高的產(chǎn)量)；改進(jìn)的使用氮、磷酸酯或其他營(yíng)養(yǎng)素的能力；改變的農(nóng)藝性狀(例如延遲成熟；延遲衰老；早熟或晚熟；改進(jìn)的耐陰性；改進(jìn)的對(duì)根或莖倒伏的抗性；改進(jìn)的對(duì)莖“綠色折斷”的抗性；改變的光周期反應(yīng))；改變的生長(zhǎng)或再生特征(例如有意的矮化；例如用于改進(jìn)的雜交程序的有意的雄性不育；改進(jìn)的植物生長(zhǎng)率；改進(jìn)的萌芽；改進(jìn)的雄性或雌性生育力)；改進(jìn)的收獲、儲(chǔ)存或加工質(zhì)量(例如在儲(chǔ)存期間改進(jìn)的抗蟲性、改進(jìn)的抗破裂性、改進(jìn)的對(duì)消費(fèi)者的吸引力)；或這些性狀的任何組合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因種子或由轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子具有改變的初級(jí)代謝物(例如脂肪酸、油、氨基酸、蛋白質(zhì)、糖或碳水化合物)組成、改變的次級(jí)代謝物組成、改變的微量元素、類胡蘿卜素或維生素組成、改進(jìn)的收獲、儲(chǔ)存或加工質(zhì)量或這些的組合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，期望改變轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物的種子的天然組分的水平，例如降低過(guò)敏蛋白或糖蛋白或毒性代謝物的水平。通常，各自從轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞再生的轉(zhuǎn)基因植物的群體進(jìn)行篩選以鑒別發(fā)育成具有期望性狀的轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。分析轉(zhuǎn)基因植物以檢測(cè)增強(qiáng)的性狀，例如增強(qiáng)的水使用效率、增強(qiáng)的耐寒性、增加的產(chǎn)量、增強(qiáng)的氮?dú)馐褂眯省⒃鰪?qiáng)的種子蛋白質(zhì)和增強(qiáng)的植物油。篩選方法包括在溫室或田間試驗(yàn)中直接篩選性狀或篩選代表性狀。這種分析涉及檢測(cè)植物的化學(xué)組成、生物質(zhì)、生理特性或形態(tài)的變化?；瘜W(xué)組成例如谷物的營(yíng)養(yǎng)組成的變化通過(guò)分析種子組成和蛋白質(zhì)、游離氨基酸、油、游離脂肪酸、淀粉、生育酚或其他營(yíng)養(yǎng)素的含量來(lái)檢測(cè)。生長(zhǎng)或生物質(zhì)特性的變化通過(guò)測(cè)量株高、莖徑、節(jié)間長(zhǎng)、根和枝干重和(對(duì)于生產(chǎn)谷物的植物例如玉米、水稻或小麥)穗或種子頭長(zhǎng)和直徑來(lái)檢測(cè)。生理特性的變化通過(guò)評(píng)價(jià)對(duì)脅迫條件的響應(yīng)來(lái)鑒別，例如在作用脅迫條件例如水分不足、氮或磷酸酯不足、冷或熱的生長(zhǎng)條件、病原體或昆蟲攻擊、光照不足或增加的植株密度下的分析。其他的選擇性質(zhì)包括開花天數(shù)、花粉脫落天數(shù)、果實(shí)成熟天數(shù)、產(chǎn)生的果實(shí)或塊莖質(zhì)量或含量、玉米抽絲天數(shù)、葉伸長(zhǎng)率、葉綠素含量、葉溫、高度(stand)、幼苗活力、節(jié)間長(zhǎng)、株高、葉數(shù)、葉面積、舵柄、支持根、保持綠色、莖倒伏、根倒伏、植物健康、生育力、綠色折斷和抗蟲性。此外，可以評(píng)估收獲的果實(shí)、種子或塊莖的表型特性。具體實(shí)施方式實(shí)施例1該實(shí)施例闡明了編碼用于控制昆蟲物種和用于制備本發(fā)明組合物和植物的靶基因的DNA序列的非限制性實(shí)施方式，并鑒別了可用于控制昆蟲物種的dsRNA引發(fā)劑序列。從之前沒(méi)有報(bào)告對(duì)經(jīng)口遞送的RNA敏感的昆蟲物種中鑒別了之前在西部玉米根蟲中顯示對(duì)于RNAi-介導(dǎo)的死亡是有效靶標(biāo)的同源基因。這些同源靶基因和dsRNA引發(fā)劑序列的實(shí)例提供于表1。表1*引發(fā)劑序列以5'到3'方向的dsRNA引發(fā)劑的有義鏈提供。被證實(shí)以序列特異性方式有效抑制靶基因的dsRNA引發(fā)劑序列可用于鑒別有效的RNA遞送劑和制劑。包含dsRNA引發(fā)劑的制劑的殺蟲活性可以通過(guò)各種技術(shù)來(lái)優(yōu)化，例如改變制劑中的化學(xué)實(shí)體或改變制劑中化學(xué)組分的比例。遞送劑和制劑的非限制性實(shí)例提供于實(shí)施例6和8。實(shí)施例2該實(shí)施例闡明了可用于抑制或沉默昆蟲細(xì)胞中的靶基因或引起昆蟲發(fā)育障礙或死亡的dsRNA引發(fā)劑序列的非限制性實(shí)施方式和用于確認(rèn)dsRNA引發(fā)劑功效或用于引起昆蟲發(fā)育障礙或死亡的方法。更具體地，該實(shí)施例闡明使用dsRNA引發(fā)劑以序列特異性降低昆蟲細(xì)胞中靶基因mRNA轉(zhuǎn)錄物水平。將培養(yǎng)的草地夜蛾(草地粘蟲)SF9細(xì)胞與dsRNA引發(fā)劑T34640(SEQIDNO:17，靶向V-ATPaseA亞基)、T34642(SEQIDNO:18，靶向COPIcoatomerB(beta)亞基)或T34644(SEQIDNO:19，靶向COPIcoatomerB’(beta主要)亞基)或用對(duì)照引發(fā)劑T35763(SEQIDNO:27,300bpdsRNA引發(fā)劑，靶向綠色熒光性蛋白)(參見(jiàn)表1)一起孵育。用商業(yè)轉(zhuǎn)染劑II(LifeTechnologies,Inc.,GrandIsland,NY14072)配制dsRNA引發(fā)劑。圖1描述了轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，表明昆蟲細(xì)胞中的dsRNA引發(fā)劑引起的靶基因特異性抑制(通過(guò)Quantigene分析測(cè)量的靶基因mRNA水平降低)。對(duì)照dsRNA引發(fā)劑T35763對(duì)昆蟲靶基因mRNA水平?jīng)]有影響。用小菜蛾(菜蛾，DBM)細(xì)胞進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示類似的對(duì)DBM引發(fā)劑的靶基因特異性細(xì)胞毒性響應(yīng)，但對(duì)靶向綠色熒光性蛋白的非特異性引發(fā)劑沒(méi)有靶基因特異性細(xì)胞毒性響應(yīng)。將培養(yǎng)的小菜蛾(菜蛾)PxE-PO#5A3細(xì)胞與dsRNA引發(fā)劑T42017(SEQIDNO:21，靶向V-ATPase亞基A)、T33310(SEQIDNO:29，靶向V-ATPase亞基A)、T32938(SEQIDNO:28，靶向COPIcoatomerbeta亞基)和T32937(SEQIDNO:13，靶向COPIcoatomerbeta主要亞基)或用對(duì)照引發(fā)劑T35763(SEQIDNO:27,300bpdsRNA引發(fā)劑，靶向綠色熒光性蛋白)(參見(jiàn)表1)一起孵育。用商業(yè)轉(zhuǎn)染劑II(LifeTechnologies,Inc.,GrandIsland,NY14072)配制dsRNA引發(fā)劑。圖2描述了轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，表明昆蟲細(xì)胞中的dsRNA引發(fā)劑引起的靶基因特異性抑制(通過(guò)Quantigene分析測(cè)量的靶基因mRNA水平降低)。對(duì)照dsRNA引發(fā)劑T35763對(duì)昆蟲靶基因mRNA水平?jīng)]有影響。在該具體的實(shí)驗(yàn)中，與cellfectinII或cellfectinII+T35763(SEQIDNO:27)處理相比，在所有DBM-特異性引發(fā)劑處理中觀察到mRNA水平的一些降低。T32937(SEQIDNO:13，靶向COPIcoatomerbeta主要亞基)和T32938(SEQIDNO:28，靶向COPIcoatomerbeta亞基)處理出現(xiàn)明顯可見(jiàn)的病理，其中轉(zhuǎn)染48小時(shí)后在轉(zhuǎn)染孔中發(fā)生一些細(xì)胞死亡、變圓和移動(dòng)。用T42017(SEQIDNO:21)和T33310(SEQIDNO:29)處理顯示靶基因V-ATPase亞基AmRNA敲除，但在用那些引發(fā)劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中沒(méi)有明顯可見(jiàn)的病理。實(shí)施例3該實(shí)施例闡明了可用于抑制或沉默昆蟲細(xì)胞中的靶基因或引起昆蟲發(fā)育障礙或死亡的dsRNA引發(fā)劑序列的非限制性實(shí)施方式和用于確認(rèn)dsRNA引發(fā)劑功效或用于引起昆蟲發(fā)育障礙或死亡的方法。更具體地，該實(shí)施例闡明經(jīng)口遞送dsRNA引發(fā)劑以引起昆蟲發(fā)育障礙或死亡。采用以人工飼料為食的Euschistusheros(新熱帶區(qū)褐臭蝽，NBSB)幼蟲的分析用于測(cè)試特異性設(shè)計(jì)為靶向Euschistusheros基因的dsRNA引發(fā)劑的功效。采用該分析，觀察到靶向E.heros泛素C基因的～500個(gè)堿基對(duì)的dsRNA引發(fā)劑T33199在E.heros幼蟲中引起劑量依賴性發(fā)育障礙和死亡響應(yīng)。基于T33199序列設(shè)計(jì)了較短(302bp)的dsRNA引發(fā)劑T44042(SEQIDNO:26)用于配制經(jīng)口或局部遞送。實(shí)施例4該實(shí)施例闡明了可用于抑制或沉默昆蟲細(xì)胞中的靶基因或引起昆蟲發(fā)育障礙或死亡的dsRNA引發(fā)劑序列的非限制性實(shí)施方式和用于確認(rèn)dsRNA引發(fā)劑功效或用于引起昆蟲發(fā)育障礙或死亡的方法。更具體地，該實(shí)施例闡明用于引起昆蟲發(fā)育障礙或死亡的dsRNA引發(fā)劑的實(shí)施方式，并闡明這些引發(fā)劑的系統(tǒng)RNAi功效。表2提供了在豆莢草盲蝽(西部無(wú)澤盲蝽)幼蟲中通過(guò)顯微注射遞送的測(cè)試dsRNA引發(fā)劑。非草盲蝽特異性引發(fā)劑T35763(SEQIDNO:27,300bpdsRNA引發(fā)劑，靶向綠色熒光性蛋白)用作對(duì)照。表2表3顯示在豆莢草盲蝽(西部無(wú)澤盲蝽)幼蟲中通過(guò)顯微注射遞送的測(cè)試dsRNA引發(fā)劑T34617(SEQIDNO:15，靶向豆莢草盲蝽V-ATPase亞基A)和34622(SEQIDNO:16，靶向豆莢草盲蝽COPIcoatomerbeta主要亞基)的死亡率結(jié)果。對(duì)照幼蟲用T35763(靶向綠色熒光性蛋白)或用去離子水顯微注射。在5天觀察期內(nèi)，每天觀察到草盲蝽靶基因特異性處理組(T34617和T34622)與陰性對(duì)照處理組相比百分比死亡率增加。表3表4顯示在豆莢草盲蝽(西部無(wú)澤盲蝽)幼蟲中通過(guò)顯微注射遞送的測(cè)試dsRNA引發(fā)劑T34616(SEQIDNO:14，靶向豆莢草盲蝽核糖體蛋白rpL19)、T34622(SEQIDNO:16，靶向豆莢草盲蝽COPIcoatomerbeta主要亞基)和T42772(SEQIDNO:22，靶向豆莢草盲蝽泛素C)的死亡率結(jié)果。對(duì)照幼蟲用T35763(靶向綠色熒光性蛋白)顯微注射。在6天觀察期內(nèi)，每天觀察到草盲蝽靶基因特異性處理組(T34616、T34622和T42772)與陰性對(duì)照處理組相比百分比死亡率增加。T34622的重復(fù)活性證實(shí)了在較早試驗(yàn)中觀察到的該引發(fā)劑的活性(表3)。表4實(shí)施例5該實(shí)施例公開了與具有包含特定修飾例如核苷酸替換的核苷酸序列的多核苷酸分子有關(guān)的實(shí)施方式。這種修飾的實(shí)施方式包括修飾的dsRNA引發(fā)劑，其提供目標(biāo)蟲害的預(yù)定靶基因和其他非靶標(biāo)物種的遺傳序列之間的改進(jìn)的序列識(shí)別力。表5鑒別了表1提供的靶基因序列和非靶標(biāo)生物(NTO)中鑒定的序列之間的匹配的實(shí)例，其中匹配是至少19個(gè)連續(xù)核苷酸的片斷。表5進(jìn)一步提供了序列修飾(例如，原始靶基因序列中指定位置處核苷酸變化)以消除與非靶標(biāo)生物匹配的序列的實(shí)例。表5表6鑒別了表1提供的dsRNA引發(fā)劑序列和非靶標(biāo)生物(NTO)中鑒定的序列之間的匹配的實(shí)例，其中匹配是至少19個(gè)連續(xù)核苷酸的片斷。表6進(jìn)一步提供了序列修飾(例如，原始dsRNA引發(fā)劑序列中指定位置處核苷酸變化)的實(shí)例，其消除至少19個(gè)連續(xù)核苷酸與非靶標(biāo)生物的具體序列匹配。表6進(jìn)一步提供了修飾的引發(fā)劑序列的非限制性實(shí)施方式，其中已經(jīng)對(duì)表6中記載的給定的初始引發(fā)劑序列的所有的核苷酸進(jìn)行變化以消除至少19個(gè)連續(xù)核苷酸與非靶標(biāo)生物的所有記載的匹配。例如，與具有SEQIDNO:15的原始dsRNA引發(fā)劑相比，具有SEQIDNO:31的修飾的dsRNA引發(fā)劑在213位具有一個(gè)核苷酸變化(A→U)；該單個(gè)變化消除了至少19個(gè)連續(xù)核苷酸與兩種非靶標(biāo)生物熊蜂(Bombusimpatiens)和地熊蜂(Bombusterrestris)的匹配。在另一個(gè)實(shí)施例中，與具有SEQIDNO:20的原始dsRNA引發(fā)劑相比，具有SEQIDNO:35的修飾的dsRNA引發(fā)劑(在42、79、124和194位)具有四個(gè)核苷酸變化；這些變化消除了至少19個(gè)連續(xù)核苷酸與NTO黑脈金斑蝶(Danausplexippus)的四種匹配。在另一個(gè)實(shí)施例中，與具有SEQIDNO:20的原始dsRNA引發(fā)劑相比，具有SEQIDNO:37的修飾的dsRNA引發(fā)劑(在64、72、131和280位)具有四個(gè)核苷酸變化；這些變化消除了至少19個(gè)連續(xù)核苷酸與NTO熊蜂、地熊蜂、智人(Homosapiens)和黑脈金斑蝶的四種匹配。表6實(shí)施例6該實(shí)施例公開了與設(shè)計(jì)用于沉默或抑制目的蟲害的靶基因的多核苷酸分子例如dsRNA引發(fā)劑有關(guān)的實(shí)施方式，以及用于測(cè)定這種分子在抑制靶基因或控制蟲害中的功效的技術(shù)。該實(shí)施例公開了將可攝取組合物形式的多核苷酸例如重組RNA分子或dsRNA引發(fā)劑提供給昆蟲的方法。測(cè)定多核苷酸分子在抑制靶基因或控制害蟲草盲蝽物種的功效的一種方法是蔗糖飼養(yǎng)試驗(yàn)。簡(jiǎn)言之，該試驗(yàn)包括將西部無(wú)澤盲蝽(豆莢草盲蝽)幼蟲與可攝取組合物形式的dsRNA引發(fā)劑接觸，然后用人工飼料維持上并監(jiān)控幼蟲的情況。制備包含2毫升15％蔗糖溶液的石蠟?zāi)ば〈糜陲曫B(yǎng)實(shí)驗(yàn)，其中處理小袋包含500微克/毫升(或百萬(wàn)分之一，ppm)或1000微克/毫升(或百萬(wàn)分之一，ppm)的dsRNA引發(fā)劑。在一些實(shí)驗(yàn)中，蔗糖溶液進(jìn)一步包括5毫克/毫升酵母tRNA以抑制可能的核酸酶活性。還采用包含2毫升西部無(wú)澤盲蝽(豆莢草盲蝽)人工飼料的石蠟?zāi)ば〈苽淙斯わ暳闲〈鋈斯わ暳贤ㄟ^(guò)在表面殺菌的攪拌機(jī)中混合高壓滅菌的沸水(518毫升)和156.3克飼料F9644B(Bio-Serv,Frenchtown,NJ)來(lái)制備。在二氧化碳蒸氣下麻醉三齡豆莢草盲蝽幼蟲并分配在4盎司玻璃罐(40–75個(gè)體/處理)中。將一張紙巾添加至各罐中以吸引蜜露。各實(shí)驗(yàn)進(jìn)行7天。允許幼蟲在蔗糖小袋上進(jìn)食72小時(shí)的周期(3天)，然后在7天觀察期的剩余4天去除蔗糖小袋并用人工飼料小袋替換。在單個(gè)場(chǎng)地觀察單個(gè)處理組的所有昆蟲，在27攝氏度、60％相對(duì)濕度孵育。所有情況下，第0天(72小時(shí)蔗糖飼養(yǎng)階段開始)的初始死亡率是0。從實(shí)驗(yàn)開始第3天(即72小時(shí)蔗糖飼養(yǎng)階段結(jié)束時(shí))到7天記錄死亡率。對(duì)于基因表達(dá)研究，在72小時(shí)蔗糖飼養(yǎng)階段結(jié)束之后立即從各罐移除12只活的幼蟲并立即在單獨(dú)的基質(zhì)管中的干冰上冷凍以作為RNA測(cè)量分析的樣品。進(jìn)行采用上述方案的一系列飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)以評(píng)估dsRNA引發(fā)劑T34616(SEQIDNO:14)、T34617(SEQIDNO:15)、T34619(SEQIDNO:45)、T34622(SEQIDNO:16)、T42772(SEQIDNO:22)、T42768(SEQIDNO:46)和T44045(SEQIDNO:26)對(duì)豆莢草盲蝽的活性。還在美國(guó)牧草盲蝽上測(cè)試dsRNA引發(fā)劑T42772(SEQIDNO:22)和T44045(SEQIDNO:26)。分析中使用對(duì)照引發(fā)劑T35763(SEQIDNO:27,300bpdsRNA引發(fā)劑，靶向綠色熒光性蛋白)。在500微克/毫升(500ppm)，與存在(表7)或不存在酵母tRNA補(bǔ)充(表8)的對(duì)照處理相比，對(duì)所有的草盲蝽特異性dsRNA引發(fā)劑均觀察到增強(qiáng)的死亡率。T34622(SEQIDNO:16)(靶向具有SEQIDNO:6的假定的COPIcoatomerbeta主要亞基基因)和T42772(SEQIDNO:22)(靶向具有SEQIDNO:7的假定的泛素C基因)始終是表現(xiàn)最好的引發(fā)劑。均靶向假定的泛素C基因(SEQIDNO:7)的引發(fā)劑T42772(SEQIDNO:22)和T44045(SEQIDNO:26)在西部無(wú)澤盲蝽豆莢草盲蝽中顯示類似活性(表9A)；兩種引發(fā)劑在相關(guān)的害蟲物種無(wú)澤盲蝽美國(guó)牧草盲蝽中似乎也具有活性(雖然作用較緩慢)(表9B)。三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)在豆莢草盲蝽上以1000微克/毫升(1000ppm)測(cè)試了泛素C引發(fā)劑T44045(SEQIDNO:26)和T42768(SEQIDNO:46)；結(jié)果表明，與用單獨(dú)的15％蔗糖或15％蔗糖加上1000微克/毫升(1000ppm)的對(duì)照引發(fā)劑T35763(SEQIDNO:27)的對(duì)照處理相比，泛素C引發(fā)劑處理在第3、4、5、6和7天的昆蟲死亡率顯示統(tǒng)計(jì)上顯著的差異(表10)。表7：昆蟲死亡率(表示為處理中總昆蟲數(shù)的百分比)，dsRNA引發(fā)劑以500ppm在5mg/mL酵母tRNA的存在下測(cè)試表8：昆蟲死亡率(表示為處理中總昆蟲數(shù)的百分比)，dsRNA引發(fā)劑以500ppm測(cè)試(無(wú)酵母tRNA)表9A：豆莢草盲蝽死亡率(表示為處理中總昆蟲數(shù)的百分比)，dsRNA引發(fā)劑以500ppm在5mg/mL酵母tRNA的存在下測(cè)試表9B：美國(guó)牧草盲蝽死亡率(表示為處理中總昆蟲數(shù)的百分比)，dsRNA引發(fā)劑以500ppm在5mg/mL酵母tRNA的存在下測(cè)試表10：豆莢草盲蝽死亡率(表示為處理中總昆蟲數(shù)的百分比)，dsRNA引發(fā)劑以1000ppm測(cè)試*sd＝平均標(biāo)準(zhǔn)差，以百分比給出通過(guò)Quantigene分析三個(gè)靶基因(COPIcoatomerbeta主要亞基、V-ATPase亞基A和COPIcoatomerbeta亞基)評(píng)估在豆莢草盲蝽中的靶基因抑制。如上所述，采用在15％蔗糖中以500或100ppm測(cè)試的dsRNA引發(fā)劑T34616(SEQIDNO:14)、T34617(SEQIDNO:15)、T34619(SEQIDNO:45)、T34622(SEQIDNO:16)、T42772(SEQIDNO:22)和T44045(SEQIDNO:26)進(jìn)行蔗糖飼養(yǎng)試驗(yàn)。在72小時(shí)蔗糖飼養(yǎng)階段結(jié)束之后立即將幼蟲單獨(dú)冷凍并進(jìn)行Quantigene分析。將所有值根據(jù)兩個(gè)參考基因(EF1α和肌動(dòng)蛋白)的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果(表11A-C)表明三個(gè)測(cè)試的靶基因的每一個(gè)被相應(yīng)的dsRNA引發(fā)劑特異性抑制，這與僅用蔗糖或用對(duì)照GFP引發(fā)劑T35763(SEQIDNO:27)處理相比觀察到的增加的死亡率一致。在六個(gè)引發(fā)劑實(shí)驗(yàn)中的五個(gè)觀察到與蔗糖對(duì)照相比顯著(p＝0.05)的靶基因抑制(靶基因表達(dá)降低)；在第六個(gè)引發(fā)劑實(shí)驗(yàn)(1000ppm的T34622，參見(jiàn)表11A)中，剛好在顯著性水平下觀察到可見(jiàn)抑制。這些結(jié)果支持在15％蔗糖飼料試驗(yàn)中觀察到的死亡率是由RNAi介導(dǎo)的這一結(jié)論。表11A：靶基因：豆莢草盲蝽COPIcoatomerbeta主要亞基(F38E11)，SEQIDNO:6表11B：靶基因：豆莢草盲蝽V-ATPaseA亞基(CG3762)，SEQIDNO:4表11C：靶基因：豆莢草盲蝽COPIcoatomerbeta亞基(CG6223)，SEQIDNO:43n/a＝不適用。實(shí)施例7通常將本發(fā)明多核苷酸設(shè)計(jì)為通過(guò)誘導(dǎo)昆蟲靶基因的調(diào)控或抑制來(lái)調(diào)節(jié)表達(dá)，并設(shè)計(jì)為具有與昆蟲靶基因或cDNA的核苷酸序列(例如SEQIDNOs:1-12和43-44)或與從昆蟲靶基因轉(zhuǎn)錄的RNA序列基本上同一或基本上互補(bǔ)的核苷酸序列，其可以是編碼序列或非編碼序列。這些有效的調(diào)節(jié)表達(dá)的多核苷酸分子在本文中稱為“引發(fā)劑”。該實(shí)施例描述用于設(shè)計(jì)和選擇作為調(diào)節(jié)昆蟲靶基因的表達(dá)的“引發(fā)劑”的多核苷酸的非限制性技術(shù)。通過(guò)“劃分(Tiling)”選擇多核苷酸引發(fā)劑用于本發(fā)明的多核苷酸不需要是全長(zhǎng)的靶基因，且在許多實(shí)施方式中較之靶基因長(zhǎng)度要短得多。用于選擇有效的引發(fā)劑的技術(shù)的實(shí)例是“劃分”，或評(píng)估對(duì)應(yīng)于靶基因的相鄰或部分重疊的片斷的多核苷酸。有效的多核苷酸“引發(fā)劑”可以通過(guò)在選擇的長(zhǎng)度片段(例如長(zhǎng)度為200–300個(gè)核苷酸的片段，其中沿著靶基因的長(zhǎng)度具有例如約25個(gè)核苷酸的部分重疊的區(qū)域)中“劃分”基因靶標(biāo)來(lái)鑒定。為抑制單個(gè)基因，將引發(fā)劑序列設(shè)計(jì)為對(duì)應(yīng)于(與其具有核苷酸同一性或互補(bǔ)性)靶基因獨(dú)特的區(qū)域；選擇的靶基因區(qū)域可以包括編碼序列或非編碼序列(例如啟動(dòng)子區(qū)域、3'非翻譯區(qū)、內(nèi)含子等)或兩者的組合。當(dāng)有興趣設(shè)計(jì)有效抑制多個(gè)靶基因的靶標(biāo)時(shí)，將多個(gè)靶基因序列進(jìn)行比對(duì)，并設(shè)計(jì)多核苷酸引發(fā)劑來(lái)對(duì)應(yīng)于在多個(gè)靶標(biāo)中共有的高序列同源性的區(qū)域。相反，當(dāng)有興趣設(shè)計(jì)有效地選擇性抑制多個(gè)靶序列之一的靶標(biāo)時(shí)，將多個(gè)靶基因序列進(jìn)行比對(duì)，并設(shè)計(jì)多核苷酸引發(fā)劑來(lái)對(duì)應(yīng)于在多個(gè)靶標(biāo)中沒(méi)有或共有的低序列同源性的區(qū)域。在非限制性實(shí)施例中，為表1所列每一個(gè)靶基因設(shè)計(jì)如下反義單鏈RNA引發(fā)劑。設(shè)計(jì)多個(gè)反義單鏈RNA引發(fā)劑，其中每一個(gè)長(zhǎng)度為200–300個(gè)核苷酸且其序列對(duì)應(yīng)于(即，對(duì)于反義引發(fā)劑，與其互補(bǔ))具有選自SEQIDNOs:1-12和43-44的序列的靶基因的片段，使得各引發(fā)劑的序列與下一個(gè)相鄰引發(fā)劑序列的約25個(gè)核苷酸重疊，如此以致多個(gè)引發(fā)劑的組合覆蓋靶基因的全長(zhǎng)。(有義引發(fā)劑以類似的方式設(shè)計(jì)，其中引發(fā)劑序列與靶基因片段相同。類似地，雙鏈引發(fā)劑可以通過(guò)提供有義和反義引發(fā)劑對(duì)來(lái)設(shè)計(jì)，各對(duì)引發(fā)劑與下一對(duì)相鄰的引發(fā)劑重疊)。通過(guò)任何方便的手段測(cè)試多核苷酸引發(fā)劑在沉默昆蟲靶基因中的功效。適合的測(cè)試的實(shí)例包括本文實(shí)施例中描述的生物學(xué)分析。另一個(gè)測(cè)試包括將多核苷酸引發(fā)劑直接局部施用到單個(gè)昆蟲或保護(hù)其免受昆蟲侵?jǐn)_的植物表面。用本發(fā)明多核苷酸處理的一個(gè)期望的結(jié)果是預(yù)防或控制昆蟲侵?jǐn)_，即通過(guò)誘導(dǎo)昆蟲的生理或行為的變化，例如但不限于，生長(zhǎng)遲緩、死亡率增加、生殖能力降低、進(jìn)食行為或運(yùn)動(dòng)降低或停止、或變形階段發(fā)育降低或停止。用本發(fā)明多核苷酸處理的另一個(gè)期望的結(jié)果是提供對(duì)于昆蟲侵?jǐn)_顯示改進(jìn)的抗性的植物。如果需要，劃分程序可以重復(fù)。發(fā)現(xiàn)提供期望活性的多核苷酸引發(fā)劑本身可以進(jìn)行劃分程序。例如，設(shè)計(jì)多個(gè)重疊反義單鏈RNA引發(fā)劑，其中每個(gè)長(zhǎng)度為50–60個(gè)核苷酸，且其序列對(duì)應(yīng)于(即，對(duì)于反義引發(fā)劑，與其互補(bǔ))選自SEQIDNOs:1-12和43-44的序列的靶基因的片段，發(fā)現(xiàn)300個(gè)核苷酸的單個(gè)多核苷酸引發(fā)劑是有效的?？梢赃M(jìn)行額外輪的劃分分析，其中測(cè)試短至18或19個(gè)核苷酸的引發(fā)劑。在本發(fā)明的各種方法中可以單獨(dú)或組合使用任何大小的有效的多核苷酸引發(fā)劑。在一些實(shí)施方式中，單個(gè)多核苷酸引發(fā)劑用于制備本發(fā)明組合物(例如用于局部施用的組合物，或用于制備轉(zhuǎn)基因植物的重組DNA構(gòu)建體)。在其他實(shí)施方式中，使用不同的多核苷酸引發(fā)劑的混合物或組合；在這種情況下，多核苷酸引發(fā)劑可用于單個(gè)靶基因或用于多個(gè)靶基因。在一些實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)多核苷酸引發(fā)劑以靶向靶基因的不同區(qū)域，即引發(fā)劑可以包括對(duì)應(yīng)于靶基因的不同外顯子區(qū)域的多個(gè)片斷；和不對(duì)應(yīng)于靶基因的“間隔基”核苷酸可以任選地用于片斷之間或鄰接片斷。選擇多核苷酸引發(fā)劑中的熱力學(xué)考慮可以設(shè)計(jì)多核苷酸引發(fā)劑或利用熱力學(xué)考慮優(yōu)化它們的序列。例如，可以基于控制一條核酸鏈(例如多核苷酸引發(fā)劑或單個(gè)siRNA)和另一條(例如靶基因轉(zhuǎn)錄物)之間的雜交的熱力學(xué)來(lái)選擇多核苷酸引發(fā)劑。用于預(yù)期在靶基因的RNAi-介導(dǎo)的沉默中可能有效的核苷酸序列的方法和算法是本領(lǐng)域已知的。這種方法和算法的非限制性實(shí)例包括Ichihara等(2007)NucleicAcidsRes.,35(18):123e描述的“i-得分”；可在rna.urmc.rochester.edu/servers/oligowalk上公開地獲得并由Lu等(2008)NucleicAcidsRes.,36:W104-108描述“Oligowalk”；和Khovorova等(2004)NatureBiotechnol.,22:326-330描述的“Reynolds得分”。允許的錯(cuò)配“基本上同一”或“基本上互補(bǔ)”是指引發(fā)劑多核苷酸(或雙鏈多核苷酸的至少一條鏈)與靶基因或由靶基因轉(zhuǎn)錄的RNA(例如轉(zhuǎn)錄物)具有足夠的同一性或互補(bǔ)性以抑制靶基因的表達(dá)(例如，引起靶基因轉(zhuǎn)錄物和/或編碼蛋白的水平或活性降低)。本發(fā)明的多核苷酸不需要與靶基因或由靶基因轉(zhuǎn)錄的RNA具有100％同一性以抑制靶基因的表達(dá)(例如，引起靶基因轉(zhuǎn)錄物或編碼蛋白的水平或活性降低，或提供昆蟲物種的控制)。在一些實(shí)施方式中，多核苷酸或其部分設(shè)計(jì)為與靶基因或由靶基因轉(zhuǎn)錄的RNA中的至少18或19個(gè)連續(xù)核苷酸的序列基本上同一或互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)與內(nèi)源性靶基因或由靶基因轉(zhuǎn)錄的RNA中的18個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的序列相比時(shí)，“基本上同一”的多核苷酸具有100％序列同一性或至少約83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％序列同一性。在某些實(shí)施方式中，當(dāng)與靶基因或由靶基因轉(zhuǎn)錄的RNA中的18個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的序列相比時(shí)，“基本上互補(bǔ)”的多核苷酸具有100％序列互補(bǔ)性或至少約83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％序列互補(bǔ)性。包含與靶基因或轉(zhuǎn)錄物的錯(cuò)配的多核苷酸可用于本發(fā)明組合物和方法的某些實(shí)施方式中。在一些實(shí)施方式中，多核苷酸包括與靶基因或靶基因轉(zhuǎn)錄物的等效長(zhǎng)度的片斷基本上同一或基本上互補(bǔ)的至少18或至少19個(gè)連續(xù)的核苷酸。在某些實(shí)施方式中，與靶基因或靶基因轉(zhuǎn)錄物的等效長(zhǎng)度的片斷基本上同一或基本上互補(bǔ)的19個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸可以具有與靶基因或轉(zhuǎn)錄物的1個(gè)或2個(gè)錯(cuò)配(即多核苷酸的19個(gè)連續(xù)核苷酸和靶基因或靶基因轉(zhuǎn)錄物的等效長(zhǎng)度的片斷之間的1個(gè)或2個(gè)錯(cuò)配)。在某些實(shí)施方式中，包含與靶基因或靶基因轉(zhuǎn)錄物的等效長(zhǎng)度的片斷同一或互補(bǔ)的連續(xù)的19個(gè)核苷酸跨度的20個(gè)或更多個(gè)核苷酸的多核苷酸可以具有與靶基因或轉(zhuǎn)錄物的1或2個(gè)錯(cuò)配。在某些實(shí)施方式中，與靶基因或靶基因轉(zhuǎn)錄物的等效長(zhǎng)度的片斷基本上同一或基本上互補(bǔ)的21個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸可以具有與靶基因或轉(zhuǎn)錄物的1、2或3個(gè)錯(cuò)配。在某些實(shí)施方式中，包含與靶基因或靶基因轉(zhuǎn)錄物的等效長(zhǎng)度的片斷同一或互補(bǔ)的連續(xù)的21個(gè)核苷酸跨度的22個(gè)或更多個(gè)核苷酸的多核苷酸可以具有與靶基因或轉(zhuǎn)錄物的1、2或3個(gè)錯(cuò)配。在設(shè)計(jì)與內(nèi)源性靶基因或由靶基因轉(zhuǎn)錄的RNA具有錯(cuò)配的多核苷酸時(shí)，可以使用更可能被耐受的某些類型和某些位置的錯(cuò)配。在某些示例性的實(shí)施方式中，使用腺嘌呤和胞嘧啶或鳥嘌呤核苷和尿嘧啶殘基之間的錯(cuò)配，如Duetal.(2005)NucleicAcidsRes.,33:1671-1677所描述。在一些實(shí)施方式中，19個(gè)堿基對(duì)重疊區(qū)中的錯(cuò)配位于低耐受性5、7、8或11位(從19個(gè)核苷酸靶標(biāo)的5'端)、位于中等耐受性3、4和12-17位(從19個(gè)核苷酸靶標(biāo)的5'端)、和/或在互補(bǔ)性區(qū)域的任一端的高耐受性位置，即1、2、18和19位(從19個(gè)核苷酸靶標(biāo)的5'端)，如Duetal.(2005)NucleicAcidsRes.,33:1671-1677所描述。耐受的錯(cuò)配可以在常規(guī)試驗(yàn)例如本文實(shí)施例中描述的那些中憑經(jīng)驗(yàn)測(cè)定。在一些實(shí)施方式中，由于穩(wěn)定性原因或?yàn)榱嗽诳寺』蚝铣芍蟹奖?，多核苷酸包括額外的核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，多核苷酸是包括RNA鏈的dsRNA，所述RNA鏈具有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的至少21個(gè)連續(xù)核苷酸的片斷，并進(jìn)一步包括鄰接片斷的額外的5'G或額外的3’C或兩者。在另一個(gè)實(shí)施方式中，多核苷酸是包括額外的核苷酸以形成懸垂的雙鏈RNA，例如包括2個(gè)脫氧核糖核苷酸以形成3'懸垂的dsRNA。將活性引發(fā)劑埋入中性序列在實(shí)施方式中，將生物活性引發(fā)劑(即具有對(duì)應(yīng)于靶基因的序列的多核苷酸且其引起靶基因中觀察到的抑制)埋入“中性”序列，即插入與靶基因不具有同一性或互補(bǔ)性的額外的核苷酸中。中性序列可以是期望的，例如增加多核苷酸的整體長(zhǎng)度。例如，為穩(wěn)定性、制造成本有效或生物活性的理由，可以期望多核苷酸是特定大小。已經(jīng)報(bào)道，在另一種鞘翅類昆蟲物種玉米根蟲(Diabroticavirgifera)中，大于或等于約60個(gè)堿基對(duì)(bp)的dsRNA是人工飼料生物學(xué)分析中的生物活性所需要的；參見(jiàn)Bolognesi等(2012)PLoSONE7(10):e47534.doi:10.1371/journal.pone.0047534。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，將對(duì)應(yīng)于表1中的靶基因且發(fā)現(xiàn)提供昆蟲侵?jǐn)_控制的21個(gè)堿基對(duì)的dsRNA引發(fā)劑埋入額外的39個(gè)堿基對(duì)的中性序列中，由此形成約60個(gè)堿基對(duì)的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)埋入較大部分的中性序列時(shí)(即總多核苷酸長(zhǎng)度為約60到約300個(gè)堿基對(duì))，單個(gè)21個(gè)堿基對(duì)的引發(fā)劑是有效的。在另一個(gè)實(shí)施方式中，將選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的至少21個(gè)連續(xù)核苷酸的至少一個(gè)片斷埋入較大部分的中性序列以提供有效的引發(fā)劑。另一個(gè)實(shí)施方式中，將來(lái)自選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的多個(gè)序列的片斷埋入較大部分的中性序列以提供有效的引發(fā)劑。與由單獨(dú)的重組RNA或單獨(dú)的非多核苷酸殺蟲劑得到的效果相比，預(yù)期本發(fā)明的某些重組RNA(例如具有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的dsRNA引發(fā)劑，或這些引發(fā)劑的活性片段)和一種或多種非多核苷酸殺蟲劑的組合將導(dǎo)致預(yù)防或控制昆蟲侵?jǐn)_的協(xié)同改進(jìn)。常規(guī)的昆蟲生物學(xué)分析例如本文的工作實(shí)施例中描述的生物學(xué)分析可利用本發(fā)明多核苷酸和一種或多種非多核苷酸殺蟲劑(例如馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇蕓金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發(fā)光桿菌屬殺蟲蛋白、側(cè)孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白)的組合來(lái)定義幼蟲死亡率或生長(zhǎng)抑制的劑量響應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在常規(guī)的生物學(xué)分析中測(cè)試多核苷酸和非多核苷酸殺蟲劑的組合以鑒別具有協(xié)同作用和期望用于保護(hù)植物免受昆蟲侵?jǐn)_的生物活性物質(zhì)的組合。實(shí)施例8該實(shí)施例闡明將本發(fā)明多核苷酸用于局部施用的組合物中以預(yù)防或控制昆蟲侵?jǐn)_的非限制性實(shí)施方式。包含本發(fā)明一種或多種多核苷酸的組合物可用作其中期望預(yù)防或控制Leptinotarsa物種侵?jǐn)_的植物、動(dòng)物或環(huán)境的局部處理。在實(shí)施方式中，將有效量的具有選自SEQIDNOs:1-12和43-44的序列的靶基因(即如之前的實(shí)施例所描述的表1中鑒定的靶基因)的多核苷酸引發(fā)劑引入設(shè)計(jì)為直接(例如通過(guò)接觸或攝取)向昆蟲物種、或其中期望預(yù)防或控制昆蟲侵?jǐn)_的植物或環(huán)境提供的組合物中。在實(shí)施方式中，將有效量的具有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的靶基因的多核苷酸引發(fā)劑引入這種組合物中。在實(shí)施方式中，將有效量的含有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的鏈的dsRNA引發(fā)劑或這些引發(fā)劑的活性片段引入這種組合物中。這種組合物根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)配制和制備，并可以為任何方便的形式，例如溶液或溶液混合物、乳劑、懸浮液、可分散粉末、固體或液體誘餌、種子包衣或土壤澆灌。這種組合物的實(shí)施方式包括其中將本發(fā)明多核苷酸提供于活的或死的微生物例如細(xì)菌或真菌或酵母細(xì)胞中，或作為微生物發(fā)酵產(chǎn)品提供，或提供于活的或死的植物細(xì)胞中，或作為合成的重組多核苷酸提供的那些。在實(shí)施方式中，組合物包括包含本發(fā)明多核苷酸的微生物的非致病性菌株；攝取或攝入微生物導(dǎo)致蟲害的發(fā)育障礙或死亡；適合的微生物的非限制性實(shí)例包括大腸桿菌、蘇云金芽胞桿菌(B.thuringiensis)、假單胞細(xì)菌屬、發(fā)光桿菌屬(Photorhabdussp.)、致病桿菌屬、嗜蟲沙雷氏菌(Serratiaentomophila)或和相關(guān)沙雷氏菌屬、球形芽孢桿菌(B.sphaericus)、蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)、側(cè)孢芽孢桿菌(B.laterosporus)、日本甲蟲芽孢桿菌(B.popilliae)、雙酶梭菌和其他梭菌種，或其他形成孢子的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。在實(shí)施方式中，組合物包括包含本發(fā)明多核苷酸的植物病毒載體；通過(guò)用植物病毒載體處理的植物上的昆蟲進(jìn)食導(dǎo)致昆蟲的發(fā)育障礙或死亡。在實(shí)施方式中，組合物包括包含本發(fā)明多核苷酸的桿狀病毒載體；攝取或攝入載體導(dǎo)致昆蟲的發(fā)育障礙或死亡。在實(shí)施方式中，將本發(fā)明多核苷酸包封于合成基質(zhì)例如聚合物中或附著于微粒并局部施用于植物表面；通過(guò)被局部處理的植物上的昆蟲進(jìn)食導(dǎo)致昆蟲的發(fā)育障礙或死亡。在實(shí)施方式中，將本發(fā)明多核苷酸以表達(dá)多核苷酸的植物細(xì)胞形式(例如本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞)提供；通過(guò)昆蟲攝取植物細(xì)胞或植物細(xì)胞內(nèi)容物導(dǎo)致昆蟲的發(fā)育障礙或死亡。組合物的實(shí)施方式任選包括有效葉狀覆蓋所需的適當(dāng)?shù)恼持鴦┖蜐駶?rùn)劑以及保護(hù)多核苷酸例如dsRNA免受UV損傷的UV保護(hù)劑。這種添加劑通常用于生物殺蟲劑工業(yè)并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。向土壤施用的組合物可以包括作為昆蟲幼蟲的誘餌的顆粒制劑。實(shí)施方式包括載體試劑、表面活性劑、有機(jī)硅酮、多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸殺蟲劑、安全劑、誘蟲劑和昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。在實(shí)施方式中，所述組合物進(jìn)一步包括至少一種選自馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇蕓金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發(fā)光桿菌屬殺蟲蛋白、側(cè)孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白的殺蟲劑。這種組合物以任何方便的方式施用，例如，通過(guò)直接向昆蟲噴霧或撒粉，或向其中期望預(yù)防或控制昆蟲侵?jǐn)_的植物或環(huán)境噴霧或撒粉，或通過(guò)向植物表面施用涂層，或通過(guò)向?yàn)榉N子的種植準(zhǔn)備的種子(或種用馬鈴薯)施用涂層，或通過(guò)在期望預(yù)防或控制昆蟲侵?jǐn)_的植物的根周圍施用土壤澆灌。本發(fā)明多核苷酸的有效量是足以提供昆蟲控制或足以預(yù)防昆蟲侵?jǐn)_的量；本發(fā)明多核苷酸的有效量使用常規(guī)試驗(yàn)例如本文工作實(shí)施例中描述的那些來(lái)測(cè)定。盡管用于本文提供的方法和組合物的本發(fā)明多核苷酸的濃度和劑量不存在上限，較低有效濃度和劑量將是效率和經(jīng)濟(jì)所常規(guī)尋求的。多核苷酸的有效量的非限制性實(shí)施方式包括噴霧在植物上的液體形式的約10毫微克每毫升到約100微克每毫升的多核苷酸，或向植物田間施用的約10毫克每英畝到約100克每英畝的多核苷酸，或用于飼養(yǎng)昆蟲的人工飼料中約0.001到約0.1微克每毫升的多核苷酸。當(dāng)向植物局部施用本發(fā)明組合物時(shí)，可以考慮向植物葉片或其他的植物部分表面例如花朵花瓣、莖、塊莖、果實(shí)、花藥、花粉、葉、根或種子施用的噴霧或處理的體積來(lái)調(diào)節(jié)濃度。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用本發(fā)明25聚體多核苷酸的草本植物的有用的處理是約1納摩爾(nmol)的多核苷酸/植物，例如約0.05-1nmol多核苷酸/植物。其他用于草本植物的實(shí)施方式包括約0.05-約100nmol、或約0.1-約20nmol、或約1nmol-約10nmol的多核苷酸/植物的有用范圍。在某些實(shí)施方式中，施用約40-約50nmol的本發(fā)明ssDNA多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，施用約0.5nmol-約2nmol的本發(fā)明dsRNA。在某些實(shí)施方式中，施用包含約0.5-約2.0毫克每毫升、或約0.14毫克每毫升的本發(fā)明dsRNA或ssDNA(21聚體)的組合物。在某些實(shí)施方式中，施用約0.5-約1.5毫克每毫升的約50-約200或更多個(gè)核苷酸的本發(fā)明dsRNA多核苷酸的組合物。在某些實(shí)施方式中，向植物施用約1nmol-約5nmol的本發(fā)明dsRNA。在某些實(shí)施方式中，向植物局部施用的多核苷酸組合物包含至少一種濃度為約0.01-約10毫克每毫升、或約0.05-約2毫克每毫升、或約0.1-約2毫克每毫升的本發(fā)明多核苷酸。非常大的植物、樹或藤本植物可能需要相應(yīng)地較大量的多核苷酸。當(dāng)使用可以加工成多個(gè)寡核苷酸(例如本發(fā)明單個(gè)重組DNA分子編碼的多個(gè)引發(fā)劑)的本發(fā)明的長(zhǎng)dsRNA分子時(shí)，可以使用較低濃度。有效的多核苷酸處理方案的非限制性實(shí)例包括約0.1-約1nmol的多核苷酸分子/植物、或約1nmol-約10nmol的多核苷酸分子/植物、或約10nmol-約100nmol的多核苷酸分子/植物的處理。本發(fā)明組合物的實(shí)施方式包括“轉(zhuǎn)移劑”，即當(dāng)與向生物表面局部施用的包括本發(fā)明多核苷酸的組合物結(jié)合時(shí)，能夠使多核苷酸進(jìn)入該生物的細(xì)胞的試劑。這種轉(zhuǎn)移劑可以作為包括本發(fā)明多核苷酸的組合物的一部分，或可以在施用包括本發(fā)明多核苷酸的組合物之前、同時(shí)或之后施用。在實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)移劑是促進(jìn)昆蟲對(duì)本發(fā)明多核苷酸的吸收的試劑。在實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)移劑是調(diào)節(jié)植物組織例如種子、葉、莖、根、花或果實(shí)的表面以使本發(fā)明多核苷酸滲透進(jìn)入植物細(xì)胞的試劑。在實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)移劑為本發(fā)明多核苷酸穿過(guò)角質(zhì)層蠟質(zhì)屏障、氣孔和/或細(xì)胞壁或膜屏障進(jìn)入植物細(xì)胞提供了一條途徑。適合的轉(zhuǎn)移劑包括增加生物外部對(duì)本發(fā)明多核苷酸的滲透性或增加生物細(xì)胞對(duì)本發(fā)明多核苷酸的滲透性的試劑。適合的轉(zhuǎn)移劑包括化學(xué)試劑、或物理試劑、或其組合。用于調(diào)節(jié)或轉(zhuǎn)移的化學(xué)試劑包括(a)表面活性劑、(b)有機(jī)溶劑或水性溶液或有機(jī)溶劑的水性混合物、(c)氧化劑、(d)酸、(e)堿、(f)油、(g)酶，或其組合。在實(shí)施方式中，施用本發(fā)明組合物和轉(zhuǎn)移劑可以任選地包括孵育步驟、中和步驟(例如，中和酸、堿或氧化劑，或者使酶失活)、沖洗步驟或其組合。適合的轉(zhuǎn)移劑可以是乳劑、反相乳劑、脂質(zhì)體或其它類膠束組合物的形式，或可以引起多核苷酸組合物為乳劑、反相乳劑、脂質(zhì)體或其它類膠束組合物的形式。轉(zhuǎn)移劑的實(shí)施方式包括平衡離子或已知與核酸分子有關(guān)的其它分子，例如無(wú)機(jī)銨離子、烷基銨離子、鋰離子、多胺(諸如精胺、亞精胺或腐胺)及其它陽(yáng)離子。轉(zhuǎn)移劑的實(shí)施方式包括有機(jī)溶劑，例如DMSO、DMF、吡啶、N-吡咯烷、六甲基磷酰胺、乙腈、二噁烷、聚丙二醇，或與水可混溶或?qū)⒘姿岷塑账崛芙庥诜撬到y(tǒng)(諸如用于合成反應(yīng)中)中的其它溶劑。轉(zhuǎn)移劑的實(shí)施方式包括含或不含表面活性劑或乳化劑的天然來(lái)源或合成的油，例如植物來(lái)源的油、作物油(諸如第9版CompendiumofHerbicideAdjuvants中所列的那些，在網(wǎng)絡(luò)的herbicide.adjuvants.com上公開可用)、石蠟油、多元醇脂肪酸酯，或具有用酰胺或多胺(諸如聚乙烯亞胺或N-吡咯烷)修飾的短鏈分子的油。轉(zhuǎn)移劑的實(shí)施方式包括有機(jī)硅酮制劑。例如，適合的轉(zhuǎn)移劑是以SILWET牌表面活性劑可商購(gòu)的有機(jī)硅酮制劑，該表面活性劑具有CAS編號(hào)27306-78-1和EPA編號(hào)：CAL.REG.NO.5905-50073-AA，并且目前可從MomentivePerformanceMaterials，Albany,NewYork獲得。在使用SILWET牌表面活性劑有機(jī)硅酮制劑作為植物葉或其它植物表面的噴霧處理形式的轉(zhuǎn)移劑(與包括本發(fā)明多核苷酸的組合物之前、同時(shí)或之后施用)的實(shí)施方案中，新鮮制備的以重量計(jì)為約0.015到約2％(wt％)范圍內(nèi)(例如約0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.5wt％)的濃度可有效準(zhǔn)備葉或其它植物表面以使本發(fā)明的多核苷酸通過(guò)局部施用于該表面轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。一個(gè)實(shí)施方式包括包含本發(fā)明多核苷酸和包括以重量計(jì)為約0.015到約2％(wt％)范圍內(nèi)(例如約0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.5wt％)的有機(jī)硅酮制劑(例如SilwetL-77)轉(zhuǎn)移劑的組合物。一個(gè)實(shí)施方式包括包含本發(fā)明多核苷酸和包括以重量計(jì)為約0.3到約1％(wt％)或約0.5到約1％(wt％)范圍內(nèi)的SILWET牌表面活性劑的轉(zhuǎn)移劑的組合物。在本發(fā)明中用作轉(zhuǎn)移劑的有機(jī)硅酮化合物包括但不限于，包括以下的化合物：(a)共價(jià)連接的三硅氧烷頭基；(b)共價(jià)連接的烷基連接基，包括但不限于，正丙基連接基；(c)共價(jià)連接的聚二醇鏈；(d)端基。這種有機(jī)硅酮化合物的三硅氧烷頭基包括但不限于，七甲基三硅氧烷。烷基連接基可以包括但不限于，正丙基連接基。聚二醇鏈包括但不限于，聚乙二醇或聚丙二醇。聚二醇鏈可以包含一種提供平均鏈長(zhǎng)度“n”為約“7.5”的混合物。在某些實(shí)施方案中，平均鏈長(zhǎng)度“n”可以在約5到約14間變化。端基可以包括但不限于，烷基，諸如甲基。在本發(fā)明中用作轉(zhuǎn)移劑的有機(jī)硅酮化合物包括但不限于，三硅氧烷乙氧化物表面活性劑或聚環(huán)氧烷改性的七甲基三硅氧烷。用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)移劑的實(shí)例是化合物I：(化合物I：聚環(huán)氧烷七甲基三硅氧烷，平均n＝7.5)。在本發(fā)明中用作轉(zhuǎn)移劑的有機(jī)硅酮化合物例如以新鮮制備的以重量計(jì)為約0.015到約2％(wt％)范圍內(nèi)(例如約0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.5wt％)的濃度使用。轉(zhuǎn)移劑的實(shí)施方式包括一種或多種鹽，例如氯化銨、四丁基溴化磷和硫酸銨，與包括本發(fā)明多核苷酸的組合物一起提供或使用。在實(shí)施方式中，氯化銨、四丁基溴化磷和/或硫酸銨以約0.5％到約5％(w/v)、或約1％到約3％(w/v)、或約2％(w/v)的濃度使用。在某些實(shí)施方式中，包括本發(fā)明多核苷酸的組合物包括濃度大于或等于300毫摩爾的銨鹽。在某些實(shí)施方式中，包括本發(fā)明多核苷酸的組合物包括濃度為約0.015-約2wt％(wt％)的有機(jī)硅酮轉(zhuǎn)移劑以及濃度為約80-約1200mM或約150mM-約600mM的硫酸銨。轉(zhuǎn)移劑的實(shí)施方式包括磷酸鹽。用于包括本發(fā)明多核苷酸的組合物的磷酸鹽包括但不限于，磷酸鈣、鎂、鉀或鈉鹽。在某些實(shí)施方式中，包括本發(fā)明多核苷酸的組合物包括濃度為至少約5毫摩爾、至少約10毫摩爾、或至少約20毫摩爾的磷酸鹽。在某些實(shí)施方式中，包括本發(fā)明多核苷酸的組合物包括約1mM-約25mM或約5mM-約25mM的磷酸鹽。在某些實(shí)施方式中，包括本發(fā)明多核苷酸的組合物包括濃度為至少約5毫摩爾、至少約10毫摩爾、或至少約20毫摩爾的磷酸鈉。在某些實(shí)施方式中，包括本發(fā)明多核苷酸的組合物包括濃度為約5毫摩爾、約10毫摩爾、或約20毫摩爾的磷酸鈉。在某些實(shí)施方式中，包括本發(fā)明多核苷酸的組合物包括約1mM-約25mM或約5mM-約25mM的磷酸鈉。在某些實(shí)施方式中，包括本發(fā)明多核苷酸的組合物包括約10mM-約160mM或約20mM-約40mM的磷酸鈉。在某些實(shí)施方式中，包括本發(fā)明多核苷酸的組合物包括pH為約6.8的磷酸鈉緩沖液。轉(zhuǎn)移劑的實(shí)施方式包括表面活性劑和/或其中所包含的有效分子。表面活性劑和/或其中所包含的有效分子包括但不限于脂肪酸的鈉或鋰鹽(例如牛脂或牛脂胺或磷脂)和有機(jī)硅酮表面活性劑。在某些實(shí)施方式中，包括本發(fā)明多核苷酸的組合物用平衡離子或已知與核酸分子結(jié)合的其它分子來(lái)配制。非限制性實(shí)例包括四烷基銨離子、三烷基銨離子、锍離子、鋰離子和多胺例如精胺、亞精胺或腐胺。在某些實(shí)施方式中，包括本發(fā)明多核苷酸的組合物用非多核苷酸除草劑例如草甘磷、植物生長(zhǎng)素樣苯甲酸除草劑包括麥草畏、草滅平、和TBA、草丁膦、植物生長(zhǎng)素樣除草劑包括苯氧基羧酸除草劑、吡啶羧酸除草劑、喹啉羧酸除草劑、嘧啶羧酸除草劑和草除靈乙基除草劑、磺酰脲、咪唑啉酮、茅草枯(delapon)、環(huán)己二酮(cyclohezanedione)、原卟啉原氧化酶抑制劑、和4-羥苯基-丙酮酸鹽雙加氧酶抑制除草劑配制。在某些實(shí)施方式中，包括本發(fā)明多核苷酸的組合物用非多核苷酸殺蟲劑例如馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇蕓金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發(fā)光桿菌屬殺蟲蛋白、側(cè)孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白配制。本文公開并要求保護(hù)的所有材料和方法可以通過(guò)以上公開按照指示無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)制備和使用。雖然已經(jīng)根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式和說(shuō)明性的實(shí)施例描述了本發(fā)明的材料和方法，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，在不離開本發(fā)明概念、精神和范圍的情況下本文描述的材料和方法可以加以變化。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的所有這種類似的替代和修改被認(rèn)為在如附加的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明精神、范圍和概念內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>MonsantoTechnologyLLCBaum,JamesA.Eads,BrianD.Kroemer,JeremyA.Taylor,ChristinaMarie<120>用于控制蟲害的組合物和方法<130>40-21(70001)0000/WO<150>US61/973,484<151>2014-04-01<160>49<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1125<212>DNA<213>草地夜蛾<400>1ggtgacatggccaccatccaggtatacgaagaaacatcaggtgtaactgtaggtgacccc60gtgctgcgtaccggcaagcccctgtccgtagagctgggtcctggtatcctcggctccatc120tttgacggtatccagcggccactgaaggacatcaacgagctcacacagtccatctacatc180cccaagggtgtcaacgtaccctgccttggacgtgatgtcacctgggaattcaaccccttg240aatgttaaggtcggctcccacatcaccggaggagacttgtacggtatcgtacacgagaac300acattggttaagcataagatgttgatcccacccaaggccaagggtaccgtcacctacatc360gcgccctccggcaactacaaagtcactgacgtagtgttggagacggagttcgacggcgag420aaggagaagtacaccatgttgcaagtatggccggtgcgccagccccgccccgtcactgag480aagctgcccgccaaccaccccctgctcaccggacagagagtgctcgactctctcttccct540tgtgtccagggtggtaccacggccatccccggcgccttcggttgtggcaagactgtcgtc600tcacaggctctgtccaagtactccaactctgacgtcatcatctacgtcggatgcggtgaa660cgtggtaacgagatgtctgaggtactgcgtgacctccccgagctgacggtggagatcgag720ggcatgaccgagtccatcatgaagcgtaccgcgctcgtcgccaacacctccaacatgcct780gtagccgcccgagaggcttccatctacaccggtatcaccctctccgagtacttccgtgat840atgggttacaacgtgtccatgatggctgactccacctctcgttgggccgaagctcttcgt900gagatctcaggtcgtctggctgagatgcctgccgactccggttaccccgcctacctggga960gcccgtctggcctccttctacgagcgtgccggacgtgtgaagtgcctgggtaaccccgac1020agggagggctccgtgtccatcgtgggcgccgtgtcgccgcccggaggtgacttctccgac1080cccgtgacggccgccacgctgggtatcgtgcaggtgttctggggt1125<210>2<211>2724<212>DNA<213>草地夜蛾<400>2aactatgaaacacattcgcagatcaagagattcgaggtatgcgacctaccggtgcgcgcc60gctaagttcgtgcctcgcaagaactgggtgattactggctccgatgacatgcagattcgc120gtgttcaactacaacacgcttgagagagtgcacgcctttgaggcgcattctgactacgtc180aggtgcatcgcgatacatcccacacagccatacatcctcaccagcagcgatgacctattg240atcaagctgtggaactgggaacgcaactgggcatgccagcaagtgttcgagggccacaca300cattatgtgatgcagatcgtcatcaaccctaaagacaacaacacattcgctagtgctagt360ctcgacaccaccgtcaaagtatggcagcttggctcttcaatttccaacttcacattagaa420ggccacgagaaaggcgtgaactgcgtcgactactaccacggcggcgacaagccttacctc480ataagtggtgccgacgatcgcctcgtcaaaatatgggactaccagaataaaacatgtgtc540cagacattggagagtcacacgcagaatgtgacagccgtgtcgttccacccggagctgccg600atcctgatgactggctcagaggacggcaccatcagaatatggcacgcaggcacttacaga660cttgaatcctcgctcaactatggcttcgagagagtctggaccatttcctccatgcacggc720tctaacaacgtagctattggttacgacgagggcacgatcatgatcaaggtgggccgcgaa780gagccggccatttccatggacgtcaatggaggcaagattatttgggcgaagcattctgag840atgcagcaagtcaacctgaaggcgttgccagaaggcacagagataaaagatggagagcgg900gttccagttatggcgaaggacatgggatcctgtgagatttatccacaaactatagcacac960aacccgaacggtcggttcgtggtagtgtgcggggacggcgagtacattatttacacggcc1020atggcacttaggaacaaggcgttcggcactgcacaggagttcgtctgggcgtttgatagc1080tcagagtatgcgacacttgagaactccagcaccatcaaggtgttcaagaacttcaaagag1140agaaagagtttcaagcctgagtatggtgctgaaggaatatacggcggtttcatgttgggc1200gtgaagtccatcagcggtgtggcgttctccttctatgattgggagaacttggagttgatc1260agacggattgagatccagccgcggcacgtgtactggtcggagagcggcaacctggtgtgc1320ctggcggctgatgactcgtactacgtgctcaagtataatgcagctgttgtgacgcgagct1380cgcgaaaccaactccaacatcacagaagacggcatcgaagacgcttttgaggtcgtgggt1440gcagtgaacgaggtggtaaagacaggactatgggtgggcgactgcttcatctacacgaat1500tccttgaacagaataaactactacgtcggcggagagatcgtcaccatatcccacctggac1560cacaccatgtacatcctcggatacgtcgctaaggagaacagactgtacctaaatgacaag1620gagttgaacatagtgtcgtactcgctgctgctgtcggtactggagtaccagacggcggtg1680atgcgcgcagacttcgagacagcagaccgggtgctccccaccataccgcaagagcatcgc1740accagagtcgctcacttcctagagaaacaaggcttcaaacaacaagctctagcagtctct1800acggagcctgaacaccagttcgagctggctctctcactgggagaacttagaagagcaaag1860cagttggccgaggaggcggcattggccgagggttccacctcccgatcctcagcggcacgg1920tggtctcggctgggagcggccgccgccgccgctgcagacacggaactcaccaaggcctgc1980tatcagagcgctaaggactacagtgccctccttctattcgcagctagtactggtgacaaa2040gaactgttgaagagtgtagcacagatgtcctcggaggaaaacgcggagaatatctcattc2100gtggcctactttatgctgaatgatctcgaatcctgtctgaagctgctcatacagcgggac2160aagctgcctgaagccgccttctttgccagatcatacattccatcgaaaatgtcggaagtg2220gtgaagttatggcgcgagtccaccagcgccaccaacacgaagctcggccagtcgctcgcc2280gacccggagcagtatgagaatttgttccccgagtttgcgcaatcattggagttggagaga2340tttcagcgcgagtatgggtacgagcagagttgcttgctagcgaacttgccggtcgactcg2400aagacttgcaaccttgagcgtaaccttgccaccgagaaggaggaggccgagcaacgcggc2460tttaagctgagctccgctgcagtggcgcggtctcctgcacacagctcaaatgatcttggt2520cctgacgaccgagtcacaaacaatgatagtccttcccacccggtgccggagagcacggtg2580gcgaccgcggcgcagcaggatctgaagaaacggcgcgactctctcgacatcatggaggaa2640ctggagcgcgagatcgaagacatcgtcctggacggcacggtcgagagcgtggatctgtcg2700gacgatgtagatttcatggactaa2724<210>3<211>2838<212>DNA<213>草地夜蛾<400>3atgtgtataagagacagctatactctgatcaacttcccgactgattcagagccttacaat60gagatgcagctcaagctggatcttgagaaaggygacacaaagaagaaaatagaagcatta120aagaaggtaataggtatyatcytktctggkgagaagatwccyggtctattgatgatcatc180atccgattygtgctgcccctgcaagaccacaccatcaagaagctgttgctkatcttctgg240gaaatagtgccaaagaccactcctgatggcaagctcatgcaggagatgatccttgtctgt300gatgcttacagaaaggatctgcaacaccccaatgagttcatccgtggctccaccctgcgc360ttcctctgtaaactgaaggagcctgaactcctcgagcctttgatgcccgccatcagagct420tgtcttgaccaccgccactcatatgtcaggaggaatgctgttcttgccatatttactatc480tacaggaactttgaattcctgatccctgatgctccagagctagtagcaaacttcttggag540acagagcaggacatgtcctgcaagaggaatgcatttcttatgctgctccatgctgaccag600gagcgggcactgtcctacctctcatccaggctggataatgtacagggctttggagatatc660cttcagttggttattgtagaacttatttacaaggtttgccacgcgaatccatcagagagg720tctcgtttcatccgtacagtatacggcttactgaacgcgaccagtgccgccgtgcggtac780gaggctgccggtactctcgttacactgtctaacgcgcctgctgctatcaaggcggcggca840gcatgctacatcgacctaatagtgaaggagagcgacaacaacgtgaagctgatagtggtg900ggtcggctgggagcgctgcgcgcggaggcgggcgaggcggcggcgcgcgcgctgcccgag960ctggccatggacgtgctgcgcgtgctggccgcctccgacctggacgtgcgccgacacacg1020ctggcgctggcgctcgacctcgtgtcctcccgccacgccgaggacctcgtgcaggtgctg1080cggaaggaggccgcccgggctaccaacgcagaccacgatgatgctgccaagtacaggcag1140ctacttgttagagctctgcaccgagctgcactcaagttccccgaagtagccggcagtgta1200gccccggcgctgctggagttgctgggcgacggcagtgagccggccgcgcaggatgtcatg1260ctgttcctacggtccgctctacataccttcgtgacctacggatcatatctaccagaaact1320gttggaggcggtgcccggtatcaaagtggtaagatagcgcggtctgcgctgtggctgctg1380gcccagttcgctgagactccggaacgcgccaaggatgccttggatgtactcgccaacgtc1440ataccttcccttagcggacaagaggataaggaagaatccgagtcggcagctaaggcccag1500gacacttcagctccacgacagcttgtcaccagtgatggaacttatgcttcgcagtctgct1560tttaacttgccagttagccaagcggctccaacccacgcgggtctatgggcggcactaggc1620gagggcgagagcttcacggcggcgtgcgcgtgctcggcgctgtgcaagctggcgctgaag1680ctgtcgggccgggccgcgaccgccgcgctgcagctggccgcgcgcctgctggccgcccac1740aagctggccgccggcctcaccgccgacgacgccgagcacggcgcgcgatgtatactggcc1800gcgagacaccgcccgcccgtcgtacaggaagcgctgctgcaacgctcctctgctgcgctc1860gccgcgctgctagcgctgcctgaccgagctactaatctgcttgatgatgctgataaggaa1920cgtgagccaaagaagcaagacaacaaggtggaggtggaacaaggcatcgtgttcgcccag1980ttggctgggaactccgccgcctccacacaccacgacatgttcgagctatcgctcactaag2040gcactgcaaggccgcagtaccggcgtgagcgaggagcgcggcaagctgtggaaggtgacg2100cagctgaccgggttctccgaccccgtgtacgccgaggccatcgtcgccgtcaaccagtac2160gacatcgtgctcgacgtactcgtcgtcaaccagaccgacgacacgctgcagaactgctgc2220gtggagctggcgacgctgggcgacctgcggctggtggagcggcccggggccgtggtgctg2280gcccccagggactacgccaccatcaaggcgcacgtcaaggtcgcctccaccgagaacggc2340atcatcttcgggaacattgtgtacgaggtatcgggcgcgtcgatggaccgcggcgtggtg2400gtcctgaacgacatccacatcgacatcgtggactacatccagcccgccgtctgcaccgac2460gcagacttcaggcagatgtgggccgagttcgagtgggagaataaggtgtccgtgaacacg2520aacatcacggacctgcgcgagtacttacaacatttactagcttccacaaacatgaagtgt2580ttgacgcctgaaaaggcattatcgggtcaatgcgggttcatggcagccaacctgtacgcg2640cggtccatattcggcgaggacgcgctggccaacctgagcatcgagaccccgctgcacaaa2700cccaactcgcccgtcgtcggacatgtcaggatcagggccaagagccagggtatggcgctg2760tctctaggcgacaaaatcaacatgatgcacaagacgccgcaacagaagaccccctccaac2820cccatccccgccgcgtaa2838<210>4<211>2097<212>DNA<213>豆莢草盲蝽<400>4ggttggtggtttggttggactggacgacattctgcgaagttaactttgtctacaaataac60agattcaaccatggctttacccagaatccgtgatgaggagaaagaatccagatttggata120tgtattcgccgtttctggccctgtcgtcactgcggagaagatgtcgggggccgctatgta180cgagctggtgcgcgtcgggtacttcgagttggtcggcgaaatcattcgtcttgaaggaga240catggccaccattcaggtctacgaagaaacatccggtgtaacagttggagatcccgtgtt300gagaactgggaaaccactttcggtggagctcggtccgggtattatgagcagcatttttga360cggtattcagcgacctttgaaagacatttgcgagctgactcagagcatctacatccccaa420gggagtcaacgttccagctctgtccaggtctattgcatgggacttcactccgtccaacaa480tatcaaggtgggagcacacatcactggtggtgatttgtatgccgtcgttcacgaaaacac540gcttgtcaagcaaaaaatgatcatgccggccagaggaaggggtaccgtgaaatacatcgc600tccccctggcaactacactgttgatgacgtcgtaatggaaactgaattcgacggagagaa660aactgaaatcaagatgttgcaagtttggcctgtccgacagccccgtccagttgccgaaaa720actgcctgctaactatccactcttgactggtcaacgagttttggatgccctcttcccgtg780tgtccaaggtggtaccaccgccattcccggtgccttcggctgtggaaaaactgtcatctc840acaagctctgtccaaatactcaaactctgacgtcatcatttacgtcggatgcggtgaacg900tggtaacgaaatgtctgaggtattgagagatttccccgaactcacagttgagattgacgg960tgtaactgagtccatcatgaagcgtactgctctggtcgccaacacatccaacatgcctgt1020agctgctcgagaagcttccatttatactggtatcacattgtccgaatacttccgtgacat1080gggttacaacgtgtcgatgatggctgactccacctctcgatgggccgaagccttgagaga1140aatttcaggtcgtctcgctgaaatgcctgctgacagtggttaccctgcctacttgggagc1200ccgtttggcttccttctacgagcgagctggtcgtgtcaaatgtcttggaagtcccgacag1260agagggctcagtcagtatcgtcggtgccgtgtcgcctcctggtggtgacttttcggatcc1320tgtcacttcagccacccttggtatcgtacaggtcttctggggtctcgacaagaaattggc1380acaaaggaaacacttcccctccatcaactggctcatctcttacagtaagtacatgagagc1440tttggacgacttctatgacaaacggtaccctgaattcgtgcccctgaggaccaaggtcaa1500ggagatcctccaggaggaagaagatttggctgaaattgtgcagctcgtcggtaaaggttc1560gctggccgagtctgataagatcacattggaaatcgctaagatcttgaaagacgatttctt1620gcaacaaaacagctactcgccctacgacagattctgtccgttctacaagacggtcggtat1680gttgaagaacatgatctctttctatgatcttgcgaggcacacggtggaatcaacagcaca1740aagcgacaacaagatcacttggactgtcatcaaagaaagcatgggcaacatcctctacca1800gctgtcctcaatgaaattcaaggaccccgtcaaagacggagaagccaagatcaaaggcga1860cttcgaacagctccacgaagacatgcaacaagctttccgcaacctcgaagactaaacagt1920tttctcgttcgctaccttattgttgacaatagtggcactacagattaacttcagtgcaat1980ttttaacagcaaccgcaaatatcctcctcctcccccccttgaaactcatactatcgttac2040acaatttgtacatataaaaacacgtctgttgtaattacacataattattgtatatct2097<210>5<211>701<212>DNA<213>豆莢草盲蝽<400>5ggtggttctcttcgtccgaccatgagttcgctcaaactgcagaagaggctcgccgcctcg60gtgatgagatgcggcaagaagaaagtgtggttggaccctaatgaaatcaacgaaatcgcc120aacaccaactctaggcaaaacatccgtaagctgatcaaggatggtttgatcatcaaaaag180cctgtggctgtccactccagagcccgcgtccgtaaaaacacagaagccagacggaagggt240cgtcactgtggcttcggtaagaggaagggtaccgccaacgccagaatgcctgtgaaggtc300ctgtgggtcaacagaatgagagtcctgcgacggctccttaaaaaatacagagaagccaag360aagatcgataggcaaatgtaccacgacctttacatgaaagccaaaggtaacgtcttcaaa420aacaagagggtactgatggacttcattcacaagaagaaggctgaaaaggcgagatcaaag480atgttgaaggaccaggcagaggcgagacgtctcaaggtcaaggaggcgaagaagaggcgc540gaggagaggatcgccaccaagaagcaagagatcatgcaggcgtacgcccgagaagacgag600gctgccgtcaaaaagtgatctcgccccctccgtttttaaattttaaacaaaaaacgtatt660ttgtacaaaaatctacaaaaaaattacaaaagagaaaactt701<210>6<211>2817<212>DNA<213>豆莢草盲蝽<400>6atgcctctcaaattggacatcaagagaaagctgtctgctcgatcagaccgtgtgaaatgt60gtcgatctgcacccaactgagccctggatgttggcttctctctacaacggaaacgttcac120atttggaaccacgaaactcaacagcttctgaaatccttcgaagtatgcgagcttccaatc180agggctgcagttttcgtaccgaggaagaactgggtggtcacaggctcggacgacatgcac240gttcgtgtcttcaactacaacactctcgagcgtgtacattccttcgaggcccattctgat300tatttgagatgcatcatcgtacatcctacacagccttacatattgacgtgcagcgatgac360atgctgatcaagctgtggaactgggaaaaaaactggctgtgccagcaagtcttcgaaagc420cacacccattacgtcatgcagatcgtgctgaacccgaaggataacaacactttcgcctct480gcctcgctcgaccacacgctcaaagtgtggcagttgggctcagcagcggccaacttcact540ttggacggacacgaaaaaggagtgaactgcgtcgactactaccacggaggagataagcct600tatctcatctctggcgcggacgatcacatggtcaaaatatgggattaccagaacaaaacg660tgcgtccagactttggagggacacgctcaaaatataactgcagtttgcttccacactgaa720ctaccaatcgcaattactggctcggaagatggaaccgttcgcttgtggcactcagccacc780tatcggttggaatcgtccttgaactacggctttgaaagagtatggaccatacgctgtctc840aaaggctcaaaccacattgctcttgggtacgacgagggttccattatggtcaaagttggt900cgagaagaaccggccatttccatggatgtaaatggagaaaaaattgtttgggctcgacat960tctgaaatccagcaggtcaatttgaagtctctcatgactgacgagagtgaaattcgcgat1020ggggagaaactcccagtagcagctaaagacatgggtccctgcgaagttttcccgcaaagc1080atcgcccacaaccccaatggaagatttgtggttgtttgcggtgatggagaatacatcatc1140tacactgccatggctttgcgtaataaaagtttcggttccgcgcaagagttcgtctgggcg1200caggactcgtccgactacgccatccgcgaagggacgtctacggtccgacttttcaggcag1260ttcaaggaaaggaagaacttcaagcctgaatttggagctgaaggtatttttgggggacag1320cttctcggagttaggactgtaactggactgtccctctacgactgggaaactttggagttg1380atcagaagcatcgacattcaagcgaaagcgctgtactggtccgaagcagggcatctcttg1440gcaatcgttactgacgacagttactatctcttgaaattcgaccagagcgccatctcgacg1500tccacccctggaactgacggctacgaagatgcctttgagctcgtcggtgaagtcaatgat1560actgtcaagaccggattgtgggttggtgactgtttcatctacacaaacgccgtttgtcgg1620atcaactactacgtaggtggtgagatcgtcaccgtggctcacctcgacactacaatgtac1680ctcctaggatacgtggcccgtcagaacctgctgtacctgtgcgacaagcatcataacatc1740atttgttacacgttgcttctgtctgtcctcgaatatcagactgctgtgatgaggagagac1800tttgaaactgctgaccgagttttgcccactattcctgttcagcatcgctcaagagttgct1860catttcctggagaaacagggcttcaaaaggcaagctctggctgtgtccacggatgccgag1920cacaagtttgaacttgcgcttcagctcagtgatttggaagcagcagtcggcctagcgagg1980gaaatcggcagcaaagccaagtgggttcaggtcgccgagttggcgatgtcagaggccaag2040ctcggactcgctcagatgtgcttgcatcaggcacagcactacggaggacttctgctcctg2100tcaacttctgccggaaatgtggacatgatggagaaactggccgaaagctcgctgtccgat2160ggcaaaaacaacgtctcgttcctcacttacttcctgatgggtaacgtggaaaagtgtctc2220caaatcctcatcgatactggaagaattccggaagcagctttcttcgcccggacctatatg2280cctaaagaagtgtcccgcgtggtcgacatgtggaaaactctttctaaggacaagacgggg2340caatcgctcgctgacccagcccaatacccgaatctattccccaagcacaccgaggctctg2400aaagccgaacagttcatgaagaaggaattgactcaaaggattcccgcctcgtcgcacaag2460gatataaaacccaactacgaaaggaatgccattgaagaaatgaaagaagccgaagcaaac2520ggtctgttcacgtatgatcctccagtggctcctgccagtatcaacaatctaattgatgtt2580tctgaaccggcgaatcgatctgagcccagcccgtccgaaatcttctccgaagcgcccgcc2640gtgtccaagatgaccagcgacgctcggccgctggtcgcgccagttccgcctgccgcgaga2700cctcaaaaacggccgtcggccttcgatgatgacgacctcgaattggaaatcgaaaatatg2760aatttggatgacatcgatgctagtgatttgaacgaagaagacctccttatagattag2817<210>7<211>5621<212>DNA<213>豆莢草盲蝽<400>7actcgttctagatcgcgacggacgcgtggacgagaaacgagaacgagctacgttgagcat60caagagcttttgtactattgaaattgtgaaaaatgcagatcttcgttaaaactttgactg120ggaagaccatcaccctcgaggtcgagccttctgataccattgaaaacgtgaaggcgaaaa180ttcaggataaagaaggcatccccccagatcagcagaggttgatctttgccggcaagcagt240tggaagacggacgtactttgtctgactacaacatccaaaaagaatccactctccacctgg300tcttgagattgagaggtggcatgcagatcttcgtgaagaccctcacaggaaagaccatca360ctcttgaggtcgagccttctgacaccatcgaaaacgtcaaggctaaaattcaagacaagg420aaggtattcctccagatcagcagagattgatcttcgccggcaaacaactcgaagatggcc480gtaccctctctgactacaatattcaaaaagagtccacccttcacttggtgttgagattgc540gtggaggtatgcaaatctttgtcaaaacattgactggaaagaccatcacccttgaagtcg600aaccctccgacaccatcgaaaatgtcaaggccaagatccaggacaaggaaggcatccccc660cagatcagcagaggttgattttcgctggcaaacaacttgaagacggacgtaccctctcgg720actacaacatccagaaggagtcgaccctccatcttgtcctccgtctgcgtggtggtatgc780agatttttgtcaaaactctgactggcaagacaatcacccttgaagtagagccctctgaca840ccatcgaaaatgtcaaggcgaaaatccaggacaaagaaggcatccccccagatcagcaga900ggttgatctttgccggtaagcagcttgaagacggccgcaccctctcggactacaacatcc960agaaggagtccacccttcatcttgtcctacgtctgcgtggtggtatgcagattttcgtaa1020agaccttgactggcaagaccatcactcttgaggttgagccctctgacaccatcgaaaacg1080tcaaggccaagatccaggacaaggaaggtatccccccagatcagcagaggttgatcttcg1140ctggcaagcagctcgaagatggtcgtaccctctcggactacaacatccagaaagagtcca1200cccttcatcttgtcctccgtctgcgtggtggtatgcagattttcgtaaagaccttgactg1260gcaagaccatcactcttgaggtcgagccctctgacaccattgaaaacgtcaaggccaaga1320tccaggacaaggaaggtatccccccagatcagcagaggttgatcttcgccggtaagcaac1380ttgaagacggccgtaccctctcggactacaacatccagaaggagtccacccttcatcttg1440tcctccgtctgcgtggtggtatgcagatattcgtaaagaccttgactggcaagaccatca1500ctcttgaggtcgagccctctgacacccttgaaaaccgcaaggccaagatccaggacaagg1560aaggtatccccccagatcagcagaggtgtgatcttcgccggtaagcaacttgaagacggc1620cgtaccctctcggactacaacatccagaaggagtccacccttcatcttgtcctccgtctg1680cgtggtggtatgcagatattcgtaaagaccttgactggcaagaccatcactcttgaggtc1740gagccctctgacaccattgaaaacgtcaaggccaagatccaggacaaggaaggtatcccc1800ccagatcagcagaggttgatcttcgctggcaagcagctcgaagatggtcgtaccctctcg1860gactacaacatccagaaagagtccacccttcatcttgtcctccgtctgcgtggtggtatg1920cagattttcgtaaagaccttgactggcaagaccatcactcttgaggtcgagccctctgac1980accattgaaaacgtcaaggccaagatccaggacaaggaaggtatccccccagatcagccg2040aggttgatcttcgctggcaagcagctcgaagatggtcgtaccctctcggactacaacatc2100cagaaagagtccacccttcatcttgtcctccgtctgcgtggtggtatgcagattttcgta2160aagaccttgactgggaagaccatcactcttgaggtcgagccctctgacaccattgaaaac2220gtcaaggccaagatccaggacaaggaaggtatccccccagatcagcagaggcagatcttc2280gccggtatgcaacttgaagacggccgtaccccgagaaacgagaacgggctacgttgagca2340tcaagagcttttgtactattgaaattgtgaaaaatgcagatcttcgttaaaactttgact2400gggaagaccatcaccctcgaggtcgaaccttctgataccattgaaaacgtgaaggcgaaa2460attcaggataaagaaggcatccccccagatcagcagaggttgatcttcgccggtaagcag2520cttgaggatggacgtactctctcggattacaacatccagaaggagtcaaccctccacctt2580gtcctccgtctgcgtggtggtatgcagatcttcgtcaagaccttgactggcaagacgatc2640actttggaagtcgagccctctgacaccattgagaatgtcaaagccaaaatccaagataag2700gaaggcatccccccagatcagcagaggttgatcttcgccggtaagcagcttgaagacggc2760cgtactctctctgattacaacatccagaaggagtcgaccctccaccttgtcctccgtctt2820cgtggtggtatgcagattttcgtaaagaccttgactggcaagaccatcacccttgaggtc2880gagccctccgacaccatcgaaaacgtcaaggccaagatccaagataaggaaggcatcccc2940ccagatcagcagaggttgatcttcgccggtaagcagcttgaggatggacgtaccctgtca3000gactacaacatccaaaaggagtccaccctgcacttggtgttgagattgcgtggtggtatg3060cagatcttcgtcaagaccttgactggcaagacgatcactttggaagtcgagccctctgac3120accattgagaatgtcaaagccaaaatccaagataaggaaggcatccccccagatcagcag3180aggttgatcttcgctggtaagcaacttgaagacggccgcaccctctctgactacaacatc3240cagaaggagtcgaccctccatcttgtcctccgtctgcgtggtggtatgcagattttcgtg3300aagaccttgactggcaagaccatcacccttgaagtcgagccctctgacaccattgagaat3360gttaaagccaagatccaggacaaggaaggtatccccccagatcagcagaggttgatcttc3420gccggtaagcagcttgaagacggccgtactctttcggattacaacatccagaaggagtcg3480accctccaccttgtcctccgtctgcgtggtggtatgcagatcttcgtcaagaccttgaca3540ggcaagaccatcacccttgaagtcgagccctctgacaccatcgaaaacgtcaaggctaag3600atccaggacaaggaaggcatccccccagatcagcagaggttgatcttcgccggtaaacag3660cttgaagacggacgtaccctctcggactacaacatccaaaaggagtccactcttcacttg3720gtgttgagattgcgtggtggtatgcagatcttcgtcaagaccttgacaggcaagaccatc3780acccttgaagtcgagccctctgacacaattgaaaacgtcaaggccaagatccaggacaag3840gaaggtatccccccagatcagcagaggttgatcttcgccggtaagcagcttgaagacggc3900cgtactctctctgattacaacatccagaaggagtcgaccctccaccttgtactccgtctg3960cgtggtggtatgcaaattttcgtgaagaccttgactggcaagaccatcactcttgaggtc4020gagccctctgacaccattgaaaacgtcaaggccaagatccaggacaaggaaggtatcccc4080ccagatcagcagaggttgatcttcgccggcaagcagctcgaagacggccgtactctctct4140gattacaacatccagaaggagtccacccttcatcttgtcctccgtctgcgtggtggtatg4200cagattttcgtgaagaccttgactggcaagaccatcactcttgaggtcgagccctctgac4260accattgaaaacgtcaaggccaagatccaggacaaggaaggtatccccccagatcagcag4320aggttgatcttcgctggcaagcagctcgaagatggtcgtaccctctcggactacaacatc4380cagaaagagtccaccctccaccttgtccttcgtctgcgtggtggtatgcagattttcgta4440aagaccttgactggcaagaccatcactcttgaggtcgagccctctgacaccattgaaaac4500gtcaaggctaagatccaggacaaggaaggcatccccccagatcagcagaggttgatcttc4560gccggtaagcagcttgaagacggccgtactctctctgattacaacatccagaaggagtcg4620accctccaccttgtcctccgtcttcgtggtggtatgcagattttcgtgaagaccttgact4680ggcaagaccatcacccttgaggtcgagccctccgacaccatcgaaaacgtcaaggccaag4740atccaagataaggaaggcatccccccagatcagcagaggttgatcttcgccggtaagcag4800cttgaggatggacgtactctctcggattataacatccagaaggagtcaaccctccacctt4860gtcctccgtctgcgtggtggtatgcagatcttcgtcaagaccttgactggcaagacgatc4920actttggaagtggagccctctgaccccattgagaatgtcaaagccaaaatccaagataag4980gaaggcatccccccagatcagcagaggttgatcttcgccggtaagcaacttgaagacggc5040cgcaccctctctgactacaacatccagaaggagtccaccctccatcttgtccttcggctg5100cgtggtggtatgcagatcttcgtcaagaccttgacaggcaagaccatcacccttgaagtc5160gagccttctgacaccatcgagaacgtcaaggccaagatccaggacaaggaaggtatccct5220ccagatcagcaaagattgatcttcgccggcaaacagctcgaagatggccgtaccctctca5280gactacaacattcaaaaggagtcaactcttcatctcgttctgaggctccgtggcggtcgt5340tattgatcacaattccaaacttaaaaattgcattccgattttccttctttatttggcaaa5400aaatacataccctagttaattaaaatgacttgaaatttgattttttaagaatgcttcaaa5460tttttttatagatggtttgttacatagacaatacacaacatgttgaaagcataaaaaaaa5520aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaccaaaaaaaaaaaaagggggggcccgttcaa5580aaggaccaaagttaacgaccgcgggatggcaacgcattact5621<210>8<211>1927<212>DNA<213>Euschistusheros<400>8gtttgttgtagttacaggttttaatttggttcacatcctaagttcggcaattcagatgtc60tacttccaaaacagaagaaaagcccttgtgggacgaaagaatggagcaagctttaggtga120agaaatcatgagaatgtctacggatgaaattgtcagtcgtattaggcttcttgataatga180aattaaaatcatgaaaagtgaagtcatgcgagtcagtcatgagttgcaggcacaaacaga240aaaaattaaggaaaatacagaaaagatcaaagtgaacaaaactttaccatatttagtatc300taatgtgatagagttgcttgatgttgatccagaggaaactgaggaagatggtgctgttgt360tgaccttgatgcccgtcgtaaaggaaaatgtgctgtcattaaaacatcaacgaggcagac420ttattttttgccagtaataggcttagttgatgctgaaaagttaaagccaggtgatctggt480tggagtaaacaaagattcttatttaattcttgaaaccttgcctgctgagtatgatgcacg540agttaaagcaatggaagttgatgaaagacctactgagcagtattctgatatcggtgggct600tgataagcagattcaagaattaatagaagccgttgttcttcctatgacacacaaagaaaa660atttgaaaatctaggaattcatcctcctaaaggtgtattgctctatggacctcctggaac720aggaaagactttactggctagagcgtgtgcagctcaaactaaatcaacttttttgaaact780agctggaccccaacttgttcagatgtttataggagatggagccaaacttgtcagagatgc840ttttgctcttgctaaggaaaaatctcctgctattatctttattgacgagttggatgctat900tggaacaaaaagatttgattctgaaaaagctggtgatcgagaagttcaaagaactatgtt960agaactgctcaaccagttagatggatttagctcaacagctgatattaaggttattgcagc1020tacaaatagagtagatattttggatcccgcccttttgcgttcaggtcgactagacagaaa1080aattgaattcccacatcctaacgaagatgcccgagcacgtataatgcaaattcattctcg1140taagatgaatattagtgttgatgttaattttgaagaacttgctcgttcaactgatgattt1200caatggagctcaatgcaaagcggtttgtgtggaagcaggtatgatagcattgcgaagagg1260agctggagttgtcactcatgaagatttcatggatgcaatattagaagtgcaggcaaagaa1320gaaagccaacttaaactattatgcttaaatatctattgataaagatttttttaataatgc1380agaaactcacttgcattcttcttttcgggagtgccaataactgtgattgattttgtattg1440ttattaacttgtaaatatgccactctttgaaaaacaaatgtgtaagtaaaccaacaagta1500aaatagcacattataattttattaaattcttaaagtcgcattaactccagttaaaaaagt1560tttgttaattcatatatatatatatatttttgcctgtttaattttaaaaagattatattt1620tctgtatcaattattagtttgactaatttgattactagtttgaaatgagtttctgccaga1680tttaatatttaatttttatttttataatcattttcaaaattaattatttgttggttcaca1740gtttattgaatatattctaatctcaaatttgttttttaatttattttttcattgcattta1800atattttttggattaaattgaaaggagattaaacttcctgttgcaaaattttttttcagt1860gattctttatattatttgtatatttataaatttgggaaacatttaataatatcatgttat1920gtttgtt1927<210>9<211>2170<212>DNA<213>Euschistusheros<400>9ttacattagaagttgagccttctgacacaatagaaaatgtcaaggccaaaatccaagaca60aagaaggaatccctccagaccaacagaggttgtatttttgctggtaaacagcttgaagat120ggccgtactctttcagattacaatattcaaaaagaatctactttacatttagtacttcgg180ttgagaggaggcatgcaaatttttgtgaagaccttgactggtaaaaccatcaccttggaa240gtggagccatctgatacaattgaaaatgttaaagctaaaattcaagataaagaaggaatt300cctccagaccaacagaggttgatttttgcaggtaaacagctcgaagatggtcgtacattg360tctgactataatattcaaaaggaatctactcttcatcttgtcctacgtttaagaggaggc420atgcagatctttgtcaagacacttactggtaaaacaatcacacttgaagttgagccttca480gacacaattgaaaatgtgaaagctaaaattcaagataaagaaggaattcctccagatcag540cagaggttgatttttgcaggtaaacagctcgaagatggtcgtacattgtctgactataat600attcaaaaggaatctactctgcatttggtccttcgtctgagaggaggaatgcaaattttt660gtaaaaaccttgactgggaaaactattacattagaagtggaaccttctgacactattgaa720aatgttaaagctaaaattcaagataaggaaggaattccaccagatcagcagcgattgatc780tttgctggaaaacagttggaagatggtcgtactttatctgattataacattcagaaggaa840tcaacactacatttagtattacgtttaagaggtggaatgcagatttttgttaagacgctt900actggaaaaaccataactttagaagttgaaccgtcagataccattgaaaatgtaaaagcc960aaaattcaagataaggaaggaattccgccagatcagcaaaggctgatctttgcaggaaaa1020cagttagaagatgggcgtactctttctgattacaacatccaaaaggaatctactttacat1080cttgtacttagacttcgaggaggcatgcagatctttgtcaagactttaacagggaagacc1140atcaccttagaagttgaaccatctgatactattgagaacgtaaaagcaaaaatccaggac1200aaagaaggaattccaccagaccagcaacgtttgatctttgctggaaaacaacttgaagat1260ggccgtaccctttcagattataatattcaaaaagagtctactcttcatcttgtacttcgc1320ttgagaggtggcatgcagatttttgtaaagactctaactggtaagaccataaccttggaa1380gttgagccttcagatactattgagaatgttaaagccaaaattcaagataaagaaggaata1440ccaccagaccaacagaggcttatttttgctggaaagcagctggaagatggccgaactttg1500tctgattacaacattcaaaaggaatcaacactgcatttggtgcttcgtctaagaggaggc1560atgcagatctttgtgaagactttgacaggtaaaaccattaccttggaagtagagccatct1620gatacaattgagaatgtaaaagctaaaattcaggataaagaaggaattcctcccgaccag1680cagcgtttgatctttgctggaaaacaactcgaagatggccgtaccctttcagattataat1740atccagaaggaatctacactacatctggtccttcgattgagaggtggtatgcagatcttt1800gtcaagaccctcacaggcaagactattaccttagaagttgagccatctgacactattgaa1860aatgttaaagccaaaattcaggacaaagaaggaatacctccagatcagcagaggcttatt1920tttgctggaaaacaattagaggatggtcgtaccctatctgattataacatccagaaggaa1980tcaactctgcatttagtgttgcgtcttaggggcggatattaaggctacttatcatttcat2040tccatcaaaattccatatcagtaaattgcttttgatatttttattagcattttcattatt2100atatttataattatttcataaatacaatgtaactaaactagaaataaacagtttctttaa2160gttcaaaaaa2170<210>10<211>2360<212>DNA<213>小菜蛾<400>10atgagtcacgggttgaagaggattgccgacgaggacaatgaaacccagttcggttatgtc60ttcgctgtgtccggtcccgtggtcacagcggagaagatgtccggctcggccatgtacgag120ctggtgcgcgtcggctacaacgagctggtcggcgagatcatccgtctggagggggacatg180gccaccatccaggtgtacgaagagacctcaggcgtgaccgtcggcgaccccgtgctgcgc240accggcaagcctctctctgtagaactgggacccggcatcctcggctccatcttcgacggc300atccagcggccgctgaaggacatcaacgagctcacgcagagcatctacatccccaagggg360gggaacgtgcccgcgctggcccgcgacaccgagtgggagttccacccgcagtacatcaag420agcgatgtctcggctggtatccgaaccccggtctccgccgggcgcgtcctcggctccatc480tccgacggcatccagcggccgctgaaggacatcaacgagctcacgcagagcatctacacc540cccaagggggtgaacgtgcccgcgctggcccgcgacaccgagtgggagttccacccgcag600tacatcaagagcgatgtctcggccggtattcgaaccccggtctccgccgggcgcgtcctc660ggctccatctccgacggcatccagcggccgctgaaggaaatcaacgagctcacgcagagc720atctacatccccaaggcggtgaacgtgcccgcgctggcccgcgacaccgagtgggagttc780cacccgcagtacatcaagcgttgtcctgtctctgccggtattcgaaccccggtctccgcc840gggcacgtcctcggctccatctccgacggcatccagcggccgctaaaggacatcaacgag900ctcacgcagagcatctacatccccaagggggtgaacgtgcccgcgctggcccgcgacacc960gagtggcagttcaacccgcagtacatcaaggtcggcacccacatcaccggcggagacttg1020tacgggatcgtgcacgagaacacgctggtgaagcaccgcatgctggtgccgcccaaggcc1080aagggcaccgtcacctacatcgcgcccgaggggaactacaaagtcactgacgtggtccta1140gagaccgagttcgacggcgagaagtcctcctacaccatgcttcaagtgtggccggtgaga1200cagccgcggccgtgcaccgagaaactacccgccaaccaccccctgctgaccgggcagaga1260gtgctcgactcactgttccccaacagtgactgcatggagaaactagccaatcacccgctg1320ctgatcggccagagagtgctcgaatcactgttcccttgcgtccagggcggcaccacggcc1380atccccggggccttcggttgcggcaagaccgtcatctcgcaggcgttgtccaagtactcc1440aactctgacgtcatcgtctatgtcgggtgtggggagcgtggtaacgagatgtccgaagta1500ctgcgtgacttccccgagctgacagtcgagatcgacggcgtgaccgagtccatcatgaag1560cgcacggcgctcgtggccaacacctccaacatgccagtggccgcccgagaggcctccatc1620tacaccggaattaccctatccgaatacttccgtgacatgggctacaacgtgtccatgatg1680gccgactcgacctcccgttgggccgaagcgctgcgtgagatctcgggtcgtctggccgag1740atgcccgctgactctggttaccccgcgtacttgggagctagactggcgagcttctacgag1800agggctggcagggtcaagtgtctgggtaacccggagagggaaggttcggtctccatcgtg1860ggcgccgtgtcgccgcccggaggagacttctctgaccccgtgacggcggccacgctcggt1920attgttcaggtgttctgggggctggacaagaagctggcgcagaggaagcacttcccctcc1980atcaactggcttatttcttacagtaagtacatgcgcgcgctggacgacttctacgacaag2040aactaccccgagttcgtgccgctcaggaccaagacagttactcgaactacgaccgtttct2100gcccgttctacaagacgaccggcatgctgaagaacatcatcacgttctacgacatgtcgc2160gacacgccgtcgagtccaccgcgcagtccgacaacaaggtgacgtggaacacgatccgtg2220acgccatgggacccgtgctctaccagctgtccagcatgaagttcaaggaccccgtgaaag2280atggagaagccaagatcaaggctgacttcgaccagatcgtcgaggacatggccgctgcct2340tccgtaacctagaggactaa2360<210>11<211>2030<212>DNA<213>小菜蛾<400>11atgccgttgagattggatatcaagaggaagctgacggctcgctcggaccgcgtgaagtgc60gtggaccagcacccctcggagccctggctgctatgctccctgtacaatggggatgtcaac120atatggaactacgagacacagctgcaaataaaaagatttgaggtaagtgtatgcgacttg180ccagtccgtgcggccaagtttgtgccgaggaagttctgggtgatcaccggctccgatgac240atgcaaattcgtgtcttcaactacaacacactggaacgtgtacacaattttgaagctcat300tcagactatgtgaggtgtattgcggttcaccccacccagccatacatcttgaccagcagt360gatgatcttctgataaagctttggaactgggatcgcaactggacttgccagcaagtgttc420gagggacacacgcactatgtgatgcagattgtcatcaaccccaaagacaacaacactttt480gccagtgccagtcttgacagaaccgtcaaggtatggcagctgggctcttccatcccgaac540ttcactctggaaggtcacgagaagggagtcaactgcgtggactactaccacggcggggac600aagccgtacctcatcagtggagctgatgaccgcctcgtcaagatatgggactaccagaac660aagacttgtgttcagaccttggaaggtcacgcccagaatgtgtcagcagtgtccttccac720cccgagctaccgatcctgctgactggctcagaggacggcacggtgcgcatctggcacgcc780ggcacctaccggctcgagagctcgctgaactacggcttcgagcgagtctggactatatcc840tccatgcatgggtccaataatgtcgctgttggttacgacgaagggactataatgataaaa900gtaggacgggaggagccggctatttccatggacgtcaacggcggcaaaatcatctgggcc960aaacactcagagatgcaacaagtcaacttgaaagctttaccagaaggtacacacataaag1020gatggcgagaggctgccattggtggtaaaagacatgggttcttgcgagatctatccacag1080acgatagcccacaacccgaacggcagattcgtggtagtctgcggagatggggaatacatc1140atctacacagccatggctttgaggaataaggctttcggcaatgcgcaggagtttgtgtgg1200acgtttgacagctcggagtatgccacactggagaactccagcactatcaaagtgttcaag1260aacttcaaggagcggaagagcttcaaaccggagtatggggctgaaggaatatttggcggt1320ttcatgctgggcgtgaagtcaatcagtggggtttccttctccatctacgactgggaacat1380ctggagctcatcagacgcatcgagatccagccccgccacgtgttctggtcggagagcggc1440agtctagtctgtctggcgacggacgaaagctactacattctgcgctacaacgccgccgtc1500gtcaccaaggcgcgcgagactaacaccaacatcacagaggacggcattgaggatgccttt1560gaggtggtcggcgaagtgaacgagacagtaaagacgggcatctggatcggggactgcttc1620atctacaccaactctctcaacagaataaactactatgtcggcggcgagatcgtcacgata1680tcgcatctcgatcacaccatgtacatacttggatacgtagctaaggaaaacagactatac1740ctgaacgacaaggagctcaacgtggtctcctattccctcctgctgccggtgctggagtac1800cagacggcggtcatgcgaggggacttcgagacggcggacaaggtgctgccggtcataccg1860cacgagcaccggacgagagtcgcgcacttcctcgagaaacagggcttcaagcagcaagcg1920ctagccgtgtccacggagccggaacaccagttcgagctggccctagctttaggcgagctc1980cgaagagcccgccaactagccgaggaggcgacggcggctggaggggctcc2030<210>12<211>3621<212>DNA<213>小菜蛾<400>12atggggggcgtggagcaatcctgttacactctcatcaacttcccaaccgatgcagagcca60tacaatgaactgcaactcaagattgacttggagagaggtgacatcaagaagaagattgag120gctctaaagaaggtgattggtatcatcctctccggggagaagatacctggtatcctcatg180gtcatcatcaggtttgtgctgccgctgcaggaccataccatcaagaagctgctactgatc240ttctgggagatcgtcccgaagaccacccccgacggcaagctgctgcaggagatgatcctc300gtctgtgactcgtacaggaaggacctgcaacaccctaacgagttcatccgcggctccacc360ctccggttcctgtgcaagctgaaggagcccgagctgctggagccgctgatgccggcgatc420agggcctgcctcgagcaccgccactcgtatgtgcggaggaacgccgtgctggccatcttt480accatctaccgactccggttcctgtgcaagctgaaggagcccgagctgctgaagccgctg540atgccggcgatcagggcctgcctcgagcaccggcactcgtatgtgcggaggaacgccgtg600ctggctatatttaccatctaccgaaacttcgacttcctcatcccggacgctccggaactg660atcggcaagttcttagagacggaacaggacatgtcgtgcaagcggaacgctttcctgatg720ttgctacatgctgagcaggagcgtgcattgagctacctggctgatagattggacagtgtg780gcgggcttcggggatatactgcaactggtcattgtggagcttatttataaggtgtgccac840gcgaacccgtccgaacgctcgcgcttcatccgcacagtgtatgggctgctcaacgcgccc900agcgccgcggtccggtacgaggcggccggcacgctggtcacgctgtctactgcgcctgcc960gctattaaggcggcagcatcctgctacatcgacctcatagtcaaagaatctgacaacaac1020gtgaagctaatcgttctctcccgtctcggagccctacgacagggcgaggcggcggcgcgc1080gcgctgcccgcgctggctatggacgtgctgagggtgctgcaatcggctgatttggatgtc1140cgtgctcaggctttacaactggtgaagctgatagtgctctctcggctcggagccctacga1200caaggcgaggcggcggcgcgcgcgctgcccgccctcgccatggacgtgcttagggtgctg1260cagtctgcggatttggatgtgcgtgctcaggccctacagttagccctggacctcgtaacc1320ccccggcacgcggacgagctagtacaagtgctgcgcaaggaggcggcgcgcgccaccagc1380gccgacagcgaccacgccgcccagtaccgccagctgctggtgcgcgcgctgcacaaggcc1440gcgctgcagttcccagaagtggccggcagcgtggcgcccgcgctgctggagctgctcggg1500gacggcagcgagccggccgcgcccgacgtgctgctgttcactagagaggccctgcagacc1560ttcccggacctccgggggcagatctaccagtgtcatatatgtctgtggtctggtactacc1620gatggtggtctggtggatctgtccggtgactatatcacacagggacagatctgtccagta1680ctagagccggccgcgcccgacgtgctgctgttcactagagaggctctacagaccttcccg1740gacctccgcgggcagatctaccagcgtctcctagactcgatcggcaacttcaagggcaag1800cgtctgctagactcgatcggcaacatcaaggtgggcaaggtggcccgctcagctctgtgg1860ctactcgcccagttcgcggacacggaggcgcgcgccgaggccgccctggctgccgtggcc1920gcctgcgtgcccactgtagggggggagcaggagacggatgattccgcagcgaagcaagaa1980gcgacggcggcgccgcggcagctggtcaccagcgacggcacttacgcgtcgcagtccgcc2040ttcaacctgccctcgtccgcgtccaccgcgtcaacatccaccaacaacctccgctcagcc2100ctcacctcgggcgactcgttcacggccgcctgcgcctgctccgcgctggccaagctgtcg2160ctcaagcaggccactgtgagggacgccaacagggcgctgcacctcgctgctaggctactg2220gctcattataagattaatgctggcaacggcacaaccctcacagcggacgacatagagcac2280gcggctctctgcgccaggctcagctcgcgacgccccaaggctcttctaggagccgccatc2340gatggtagtggggaggcgcttaaagcactgctgaaggaaactgcggctgatgatgtggct2400gccaaggctctactaggagccgccatcgacggcagcggagaggcgcttaaagcactgctg2460aaggaaactgctgctgatgatgtggctgccaagacagcggttatagtagagctagcaggt2520ctatgtaagtggctgagctcgcgacgccccaaggctctactaggagccgccatcgatggt2580agtggggaggcgcttaaagcactgctgaaggaaactgctgctgatgacgtagctgctaag2640gagcgcgaagcagcgtcagccaagcgcacagtggatgtagaagaaggcatcgtgttctcg2700caactggcgggcgcgggcgccgccaacacgcaccacgacatcttcgaggtgtcgctgtcc2760aaggcactggatggtcgttccggccaaggcgaggacaaaggcaagctgtccaaggtgacg2820cagctgacaggcttctccgatccagtctacgcggaggccatcgtggccgtcaaccagtac2880gacatcgtgctcgacgtgctggtggttaaccagaccgacgatacgctccagaactgcaca2940gtggagctagccacgctcggagacctgcgattggtcgagcggcccgcgtcggtggtgtta3000gccccgcgagactacgccaccataaaggcacacgtcaaggtggcgtccacggagaatggg3060atcatatttgggaatattgtgtacgaagtgacgggcgcatccatggaccgaggagtcgtg3120gttctaaacgacatccacatcgacatcgtggactacatccagccggccgcgtgcagcgac3180gccgacttccgctccatgtgggccgagttcgagcgggagaacaagccggccgcgggcagc3240gacgccgacttccgctcaatgtgggccgcgttcgagtgggagaacaaggtttccgtgaac3300acaaacatcacagacctgaaggaatacctgcagcacctcctcgcttctaccaacatgaag3360tgtctcacgccagaaaaggcgctttccggtcaatgcggcttcatggcggccaacatgtac3420gctagatccatcttcggcgaagacgctctagccaacctgagcattgagcgagcgctcaac3480aagccggacgcaccggtcgtgggtcacgtcaggatacgagctaagagccagggtatggca3540ttaagcctcggcgacaagatcaacatgatgcagaaggccgcccacaagccgtcggcctcc3600ccgccgacgcccgccgcctga3621<210>13<211>302<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>13gugccguugagauuggauaucaagaggaagcugacggcucgcucggaccgcgugaagugc60guggaccagcaccccucggagcccuggcugcuaugcucccuguacaauggggaugucaac120auauggaacuacgagacacagcugcaaauaaaaagauuugagguaugcgacuugccaguc180cgugcggccaaguuugugccgaggaaguucugggugaucaccggcuccgaugacaugcaa240auucgugucuucaacuacaacacacuggaacguguacacaauuuugaagcucauucagac300uc302<210>14<211>298<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>14ggcaaaacauccguaagcugaucaaggaugguuugaucaucaaaaagccuguggcugucc60acuccagagcccgcguccguaaaaacacagaagccagacggaagggucgucauuguggcu120ucgguaagaggaaggguaccgccaacgccagaaugccugugaagguccugugggucaaca180gaaugagaguccugcgacggcuccuuaaaaaauacagagaagccaagaagaucgauaggc240aaauguaccacgaccuuuacaugaaagccaaagguaacgucuucaaaaacaagagggu298<210>15<211>300<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>15ggugccuucggcuguggaaaaacugucaucucacaagcucuguccaaauacucaaacucu60gacgucaucauuuacgucggaugcggugaacgugguaacgaaauguuugagguauugaga120gauuuccccgaacucacaguugagauugacgguguaacugaguccaucaugaagcguacu180gcucuggucgccaacacauccaacaugccuguagcugcucgagaagcuuccauuuauacu240gguaucacauuguccgaauacuuccgugacauggguuacaacgugucgaugauggcugac300<210>16<211>300<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>16gacaucaagagaaagcugucugcucgaucagaccgugugaaaugugucgaucugcaccca60acugagcccuggauguuggcuucucucuacaacggaaacguucacauuuggaaccacgaa120acucaacagcuucugaaauccuucgaaguaugcgagcuuccaaucagggcugcaguuuuc180guaccgaggaagaacuggguggucacaggcucggacgacaugcacguucgugucuucaac240uacaacacucucgagcguguacauuccuucgaggcccauucugauuauuugagaugcauc300<210>17<211>300<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>17ggaggagacuuguacgguaucguacacgagaacacauugguuaagcauaagauguugauc60ccacccaaggccaaggguaccgucaccuacaucgcgcccuccggcaacuacaaagucacu120gacguaguguuggagacggaguucgacggcgagaaggagaaguacaccauguugcaagua180uggccggugcgccagccccgccccgucacugagaagcugcccgccaaccacccccugcuc240accggacagagagugcucgacucucucuucccuuguguccagggugguaccacggccauc300<210>18<211>301<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>18ggaucauaucuaccagaaacuguuggaggcggugcccgguaucaaagugguaagauagcg60cggucugcgcuguggcugcuggcccaguucgcugagacuccggaacgcgccaaggaugcc120uuggauguacucgccaacgucauaccuucccuuagcggacaagaggauaaggaagaaucc180gagucggcagcuaaggcccaggacacuucagcuccacgacagcuugucaccagugaugga240acuuaugcuucgcagucugcuuuuaacuugccaguuagccaagcggcuccaacccacgcg300c301<210>19<211>301<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>19ggcguucuccuucuaugauugggagaacuuggaguugaucagacggauugagauccagcc60gcggcacguguacuggucggagagcggcaaccuggugugccuggcggcugaugacucgua120cuacgugcucaaguauaaugcagcuguugugacgcgagcucgcgaaaccaacuccaacau180cacagaagacggcaucgaagacgcuuuugaggucgugggugcagugaacgaggugguaaa240gacaggacuaugggugggcgacugcuucaucuacacgaauuccuugaacagaauaaacua300c301<210>20<211>302<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>20gcguccagggcggcaccacggccauccccggggccuucgguugcggcaagaccgucaucu60cgcaggcguuguccaaguacuccaacucugacgucaucgucuaugucggguguggggagc120gugguaacgagauguccgaaguacugcgugacuuccccgagcugacagucgagaucgacg180gcgugaccgaguccaucaugaagcgcacggcgcucguggccaacaccuccaacaugccag240uggccgcccgagaggccuccaucuacaccggaauuacccuauccgaauacuuccgugaca300uc302<210>21<211>301<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>21ggccgcuaaaggacaucaacgagcucacgcagagcaucuacauccccaagggggugaacg60ugcccgcgcuggcccgcgacaccgaguggcaguucaacccgcaguacaucaaggucggca120cccacaucaccggcggagacuuguacgggaucgugcacgagaacacgcuggugaagcacc180gcaugcuggugccgcccaaggccaagggcaccgucaccuacaucgcgcccgaggggaacu240acaaagucacugacgugguccuagagaccgaguucgacggcgagaaguccuccuacacca300c301<210>22<211>257<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>22gcauccccccagaucagcagagguugaucuuugccggcaagcaguuggaagacggacgua60cuuugucugacuacaacauccaaaaagaauccacucuccaccuggucuugagauugagag120guggcaugcagaucuucgugaagacccucacaggaaagaccaucacucuugaggucgagc180cuucugacaccaucgaaaacgucaaggcuaaaauucaagacaaggaagguauuccuccag240aucagcagagauugauc257<210>23<211>300<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>23gcaggcacaaacagaaaaaauuaaggaaaauacagaaaagaucaaagugaacaaaacuuu60accauauuuaguaucuaaugugauagaguugcuugauguugauccagaggaaacugagga120agauggugcuguuguugaccuugaugcccgucguaaaggaaaaugugcugucauuaaaac180aucaacgaggcagacuuauuuuuugccaguaauaggcuuaguugaugcugaaaaguuaaa240gccaggugaucugguuggaguaaacaaagauucuuauuuaauucuugaaaccuugccugc300<210>24<211>300<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>24guugauuuuugcagguaaacagcucgaagauggucguacauugucugacuauaauauuca60aaaggaaucuacucugcauuugguccuucgucugagaggaggaaugcaaauuuuuguaaa120aaccuugacugggaaaacuauuacauuagaaguggaaccuucugacacuauugaaaaugu180uaaagcuaaaauucaagauaaggaaggaauuccaccagaucagcagcgauugaucuuugc240uggaaaacaguuggaagauggucguacuuuaucugauuauaacauucagaaggaaucaac300<210>25<211>302<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>25gacacuuacugguaaaacaaucacacuugaaguugagccuucagacacaauugaaaaugu60gaaagcuaaaauucaagauaaagaaggaauuccuccagaucagcagagguugauuuuugc120agguaaacagcucgaagauggucguacauugucugacuauaauauucaaaaggaaucuac180ucugcauuugguccuucgucugagaggaggaaugcaaauuuuuguaaaaaccuugacugg240gaaaacuauuacauuagaaguggaaccuucugacacuauugaaaauguuaaagcuaaaau300uc302<210>26<211>302<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>26gaccuugacuggcaagaccaucacucuugaggucgagcccucugacaccauugaaaacgu60caaggccaagauccaggacaaggaagguauccccccagaucagcagagguugaucuucgc120uggcaagcagcucgaggauggucguacccucucggacuacaacauccagaaggaguccac180ccuucaucuuguccuccgucugcguggugguaugcagauuuucgucaagaccuugacugg240caagacgaucacuuuggaagucgagcccucugacaccauugagaaugucaaagccaaaau300cc302<210>27<211>300<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>27gagaagaacucuucacuggaguuggucccaguucuuguugaauuagauggcgauguuaau60gggcaaaaauucucugucaguggagagggugaaggugaugcaacauacggaaaacuuacc120cuuaauuuuauuugcacuacugggaagcuaccuguuccauggccaacacuugucacuacu180uucucuuaugguguucaaugcuucucaagauacccagaucauaugaaacagcaugacuuu240uucaagagugccaugcccgaagguuauguacaggaaagaacuauauuuuucaaagaugac300<210>28<211>302<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>28ggcgugccuacuauagggggggagcaagagcagacugaggauuccgcagcgaagcaggag60gcgacggcggcgccgcggcagcuggucaccagcgacgggacuuacgccucgcaguccgcc120uucaaccugcccucguccgccgccaccgcaucaacauccaccaacgggcuccgcucagcg180cucaccucgggcgacucguucacggccgccugcgccugcuccgcgcuggccaagcugucg240cucaagcaggccacugugagggacgccaacagggcgcugcaccucgcugcuaggcuacug300gc302<210>29<211>300<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>29gcaucuacauccccaagggggugaacgugcccgcgcuggcccgcgacaccgagugggagu60uccacccgcaguacaucaaggucggcacccacaucaccggcggagacuuauacgggaucg120ugcacgagaacacgcuggugaagcaccgcaugcuggugccgcccaaggccaagggcaccg180ucaccuacaucgcgcccgaggggaacuacaaagucacugacgugguccuagagaccgagu240ucgacggcgagaaguccuccuacaccaugcuucaaguguggccggugagacagccgcggc300<210>30<211>302<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>30gugccguugagauuggauaucaagaggaagcugacggcucgcucggaccgcgugaagugc60guggaccagcaccccucggagcccuggcugcuaugcucccuguacaauggggaugucaac120auauggaacuacgagacacagcugcaaauaaaaagauuugagguaugcgacuugccaguc180cgugcggccaaguuugugccgaggaaguucugggugaucaccggcuccgaugacauguaa240auucgugucuucaacuacaacacacuggaacguguacacaauuuugaagcucauucagac300uc302<210>31<211>300<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>31ggugccuucggcuguggaaaaacugucaucucacaagcucuguccaaauacucaaacucu60gacgucaucauuuacgucggaugcggugaacgugguaacgaaauguuugagguauugaga120gauuuccccgaacucacaguugagauugacgguguaacugaguccaucaugaagcguacu180gcucuggucgccaacacauccaacaugccuguugcugcucgagaagcuuccauuuauacu240gguaucacauuguccgaauacuuccgugacauggguuacaacgugucgaugauggcugac300<210>32<211>300<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>32gacaucaagagaaagcugucugcucgaucaggccgugugaaaugugucgaucugcaccca60acugagcccuggauguuggcuucucucuacaacggaaacguucacauuuggaaccacgaa120acucaacagcuucugaaauccuucgaaguaugcgagcuuccaaucagggcugcaguuuuc180guaccgaggaagaacuggguggucacaggcucggacgacaugcacguucgugucuucaac240uacaacacucucgagcguguacauuccuucgaggcccauucugauuauuugagaugcauc300<210>33<211>300<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>33ggaggagacuuguacgguaucguacacgagaacacauugguuaagcauaagauguugauc60ccacccaaggccaaggguaccgucaccuacaucgcgcccuccggcaacuacaaagucacu120gacguaguguuggagacgguguucgacggcgagaaggagaaguacaccauguugcaagua180uggccggugcgccagccccgccccgucacugagaagcugcccgccaaccacccccugcuc240accggacagagagugcucgacucucucuucccuuguguccagggugguaccacggccauc300<210>34<211>301<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>34ggaucauaucuaccagaaacuguuggaggcggugcccgguaucaaagugguaagauagcg60cggucugcgcuguggcugcuggcccaguucgcugagacuccggaacgcgccaaggaugcc120uuggauguacucgccaacgucauaccuucccuuagcggacaagaggauaaagaagaaucc180gagucggcagcuaaggcccaggacacuucagcuccacgacagcuugucaccagugaugga240acuuaugcuucgcagucugcuuuuaacuugccaguuagccaagcggcuccaacccacgcg300c301<210>35<211>302<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>35gcguccagggcggcaccacggccauccccggggccuucgguagcggcaagaccgucaucu60cgcaggcguuguccaaguucuccaacucugacgucaucgucuaugucggguguggggagc120gugauaacgagauguccgaaguacugcgugacuuccccgagcugacagucgagaucgacg180gcgugaccgaguccaacaugaagcgcacggcgcucguggccaacaccuccaacaugccag240uggccgcccgagaggccuccaucuacaccggaauuacccuauccgaauacuuccgugaca300uc302<210>36<211>257<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>36gcauccccccagaucagcagagguuaaucuuugccggcaagcaguuggaagacggacgua60cuuugucugauuacaacauccaaaaagaauccacucuccaccuggucuugagauugagag120guggcaugcagaucuucaugaagacccucacaggaaagaccaucacucuugaggucgagc180cuucugacaccaucgaaaacgucaaggcuaaaauucaaggcaaggaagguauuccuccag240auuagcagagauugauc257<210>37<211>300<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>37gcaggcacaaacagaaaaaauuaaggaaaauacagaaaagaucaaagugaacaaaacuuu60accguauuuagaaucuaaugugauagaguugcuugauguugauccagaggaaacugagga120agauggugcuauuguugaccuugaugcccgucguaaaggaaaaugugcugucauuaaaac180aucaacgaggcagacuuauuuuuugccaguaauaggcuuaguugaugcugaaaaguuaaa240gccaggugaucugguuggaguaaacaaagauucuuauuugauucuugaaaccuugccugc300<210>38<211>300<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>38guugauuuuugcagguaaacagcucgaagauggucguacauugucugacuauaauauuca60aauggaaucuacucugcauuugguccuucgucugagagcaggaaugcaaauauuuguaaa120aaccuugacugggaaaacuauuacauuagaaguggaaccuucugacacuauugaauaugu180uaaagcuaaaacucaggauaagguaggaauucuaccagaucaguagcgauugaucuuugc240uagaaaacaguuggaagauggucauacuuuaucugauuauaacauucagauggaaucaac300<210>39<211>302<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>39gacacuuacugguaaaacaaucacacuugaaguugagccuucagacacaauugaaaaugu60gaaaguuaaaauucaagauaaaguaggaauuccuccaguucagcagagguugauuuuugc120agguaaacagcucgaagauggucguacauugucugacuauaauauucuaaaggaaucuac180ucugcauuugguccuucgucugagaagaggaaugcaaauuguuguaaaaaccuugacugg240gaaaacuauuacauuagaaguggaaccuucugacacuauugaaauuguuaaagcuaaaau300uc302<210>40<211>302<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>40gaccuugacuggcaagaccaucacucuugaggucgagcccucugacaccauugaaaacgu60caaggccaagauccagaacaaggaagguauccccccagaucagcagagguuggucuucgc120uggcaagcagcucgaggauggucguacccucucggacuacaacaucuagaaggaguccac180ccuucaucuuguccuccgucugcgugguggcaugcagauuuucgucaagaccuugacugg240caagacgaucacuuuggaagucgagcccucugacaccauugagagugucaaagccaaaau300cc302<210>41<211>300<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>41gagaagaacucuucacuggaguuggucccaguucuuguugaauuagauggcgauguuaau60gggcaaaaauucucugucaguggugagggugaaggugaugcaacauacggaaaacuuacc120cuuaauuuuauuugcacuacugggaagcuaccuguuccauggccaacacuugucacuacu180uucucuuaugguguucaaugcuucucaagauacccagaucauaugaaacagcaugacuuu240uucaagagugccaugcccgaagguuauguacaggaaagaacuauauuuuucaaagaugac300<210>42<211>302<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>42ggcgugccuacuauagggggggagcaagagcagacugaggauuccgcagcgaagcaggag60gcgacggcggcgccgcggcagcuggucaccagcgacgggacuuacgccucgcaguccgcc120uucaaccugcccucguccgccgccaccgcaucaacauccaccaacgggcuccgcucagcg180cucaccucgggcgacucguucacggccgccugcgccugcuccgcgcuggcaaagcugucg240cucaagcaggccacugugagggacgccaacagggcgcugcaccucgcugccaggcuacug300gc302<210>43<211>3005<212>DNA<213>豆莢草盲蝽<400>43agcacagctcagaaagttgaagctctcaagaaaacgattcacatgatttccaacggcgag60cgtttaccgggtcttctgatgcatatcatcagattcattctgccttcccaggaccacacg120atcaaaaagttgctgctaatattctgggagatcgttcctaaaacttaccccgatggaaaa180ctgcttcaagaaatgatacttgtttgcgacgcctacagaaaggatttacaacaccccaat240gagttcgtgcgcgggtcgactttgagattcctctgcaaattgaaggagccagaacttctg300gaaccgctgatgcctgccattcggtcgtgcctcgagcacagagtgtcttacgtccgcagg360aacgctgtccttgccattttcacgatctacaagaatttcgaatttctaatccctgatgct420cccgaactcattgccaatttcctcgacggagagcaagatatgtcttgcaaaaggaatgcc480ttcttgatgctcctccacgctgaccaagacagagcactctcctatcttgcttcttgtctg540gaccaagtcaccagctttggtgacatcctccagcttgtcatcgttgaattgatttacaag600gtttgtcatgcgaatccctcagaacgttctcggttcataaggtgcatatacaacctattg660aattcaagcagccctgctgtccgatatgaagctgctggtacgctgataaccctgtccaac720gcacctactgccatcaaggctgctgcatcatgctacattgatctaatcatcaaggaaagc780gataacaacgtcaaactgatcgtcctcgatcgcctggtcgccctcaaagacatcccgacg840tacgaaagagtcttgcaggatctcgtcatggacatcctccgcgtcttggccagcccggat900atggaagtcaggaagaaggctttgaatctcgctcttgatcttacaacttcgcgttgtgtc960gaagaagtagttttgatgctgaagaaagaggttgccaaaactcataacttgtccgagcac1020gaggaaacaggaaaatataggcaactccttgtgagaactctgcactcttgcagtatgaaa1080ttccctgatgtggctgcttccgtcatcccagtgctcatggaatttttgtctgactccaac1140gagctcgcttcccaagacgtccttattttcgtaagggaagccattcacaaatttgaaaat1200ctgaggaacacaatcattgagaaattgcttgaagcttttccgtccataaagttcgtcaaa1260gtccatcgtgctgcgttgtggatattaggagagtacgctgcttccatcgatgacgtcaga1320gctgtcatgaaacaaatcaaacagaatttgggtgaggttcctatggtggaagatgaaatg1380aagcgggccgctggagagaagacagaagagtcatctgaacagaacagcgggggtgcaatg1440ccgtcaagcgcttccaaactagtaacgtctgatgggacctatgcttctcagtctgtgttc1500agcactgtatccacatccaaaaaagaggaccgaccacctttgaggcagtatctgattgat1560ggtgattattttattggctccaccatcgcgtccactttggtgaaactttctctgaagttt1620gacaacttggaatccaacacggctgcgcagaacgaattctgcaatgaatgcatgctgatc1680atcgcctgcaccctccatcttggaagatctggcctttgcacaaagaatttgaataacgac1740gacgctgagaggatgctgttttgtcttcgagttctttgggatggaagcccaaccattgag1800aagatttttactcaagaatgccgagaagctcttgcgtctatgcttaccgctcaacaccat1860gaggaaatcgccttgaataaggccaaagaaaagaccgcacatctcatccacgtagacgac1920ccagtctcattcctgcaattatcatctctgagaaactctgaacttggttctgaaaacgtg1980ttcgagctaagtcttactcaggcgcttggtggtcccaccagtggtggctcctccaactcg2040gacctcttcttctctgccagcaagctcaacaaagtcacgcagcttactggcttttctgac2100cctgtctacgctgaagcttacgtccaagtcaaccagtatgatatcgtcttggacgtactc2160attgtcaaccagacagctgacactcttcaaaattgcactctggaattggctacacttggc2220gacctgaaattggtcgagaagccgcaaccctgcgttttggcgcctcatgacttctgtaac2280ataaaagctaacgtcaaagtggcttccactgaaaacggaattatttttggcaacattgtt2340tacgacgttagtggagcagcttccgaccgaaacgtcgtcgtcctcaatgacattcacatc2400gatattatggactacatagttcctgcatcttgttctgacactgaattccgccaaatgtgg2460gctgaattcgaatgggaaaacaaggtatctgtcaacaccaacctcacggacttgcacgag2520tatttggcccatttggtcaggagcaccaacatgaagtgcttgacaccagagaaagcgctc2580tgcggtcaatgtgggttcatggctgccaacatgtatgcgcgctcgattttcggagaagat2640gcgttggcgaacctgagcatcgagaaacccttcaacaagcctgatgcacctgtcactgga2700cacatccgcatccgagccaaaagccagggaatggcactcagtctgggagacaaaatcaac2760atgacccagaagagaccgcagaaaatgtacggtgcctaagccctcatagatcccaccacc2820tcggttcaactctccatctcctttgtgagagcaccctactgcttacctgcgccacactgc2880aagtaaacttggcttcggcctcctatttatcatattttacggtattctttgttatcgaaa2940tatttatgcatattatattattggtatttcgttatcccaattcattcaataaatatatag3000attaa3005<210>44<211>1623<212>DNA<213>豆莢草盲蝽<400>44gccattagagcttcagacgagaaacgagaacgagctacgttgagcatcaagagcttttgt60actattgaaattgtgaaaaatgcagatcttcgttaaaactttgactgggaagaccatcac120cctcgaggtcgagccttctgataccattgaaaacgtgaaggcgaaaattcaggataaaga180aggcatccccccagatcagcagaggttgatctttgccggcaagcagttggaagacggacg240tactttgtctgactacaacatccaaaaagaatccactctccacctggtcttgagattgag300aggtggcatgcagatcttcgtgaagaccctcacaggaaagaccatcactcttgaggtcga360gccttctgacaccatcgaaaacgtcaaggctaaaattcaagacaaggaaggtattcctcc420agatcagcagagattgatcttcgccggcaaacaactcgaagatggccgtaccctctctga480ctacaatattcaaaaagagtccacccttcacttggtgttgagattgcgtggaggtatgca540aatctttgtcaaaacattgactggaaagaccatcacccttgaagtcgaaccctccgacac600catcgaaaatgtcaaggccaagatccaggacaaggaaggcatccccccagatcagcagag660gttgattttcgctggcaaacaacttgaagacggacgtaccctctcggactacaacatcca720gaaggagtcgaccctccatcttgtcctccgtctgcgtggtggtatgcagatttttgtcaa780aactctgactggcaagacaatcacccttgaagtagagccctctgacaccatcgaaaatgt840caaggcgaaaatccaggacaaagaaggcatccccccagatcagcagaggttgatctttgc900cggtaagcagcttgaagacggccgcaccctctcggactacaacatccagaaggagtccac960ccttcatcttgtcctccgtctgcgtggtggtatgcagatcttcgtcaagaccttgactgg1020caagacgatcactttggaagtcgagccctctgacaccattgagaatgtcaaagccaaaat1080ccaagataaggaaggcatccccccagatcagcagaggttgatcttcgctggtaagcaact1140tgaagacggccgcaccctctctgactacaacatccagaaggagtcgaccctccatcttgt1200cctccgtctgcgtggtggtatgcagatcttcgtcaagaccttgacaggcaagaccatcac1260ccttgaagtcgagccctctgacaccatcgaaaacgtcaaggctaagatccaggacaagga1320aggtatccccccagatcagcaaagattgatcttcgccggcaaacagctcgaagatggccg1380taccctctcagactacaacattcaaaaggagtcaactcttcatctcgttctgaggctccg1440tggcggtcgttattgatcacaattccaaacttaaaaattgcattccgattttccttcttt1500atttggcaaaaaatacataccctagttaattaaaatgacttgaaatttgattttttaaga1560atgcttcaaatttttttatagatggtttgttacatagacaatacacaacatgttgaaagc1620aat1623<210>45<211>301<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>45guugcugcuaauauucugggagaucguuccuaaaacuuaccccgauggaaaacugcuuca60agaaaugauacuuguuugcgacgccuacagaaaggauuuacaacaccccaaugaguucgu120gcgcgggucgacuuugagauuccucugcaaauugaaggagccagaacuucuggaaccgcu180gaugccugccauucggucgugccucgagcacagagugucuuacguccgcaggaacgcugu240ccuugccauuuucacgaucuacaagaauuucgaauuucuaaucccugaugcucccgaacu300c301<210>46<211>255<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>46gacguacuuugucugacuacaacauccaaaaagaauccacucuccaccuggucuugagau60ugagagguggcaugcagaucuucgugaagacccucacaggaaagaccaucacucuugagg120ucgagccuucugacaccaucgaaaacgucaaggcuaaaauucaagacaaggaagguauuc180cuccagaucagcagagauugaucuucgccggcaaacaacucgaagauggccguacccucu240cugacuacaauauuc255<210>47<211>701<212>DNA<213>豆莢草盲蝽<400>47aagttttctcttttgtaatttttttgtagatttttgtacaaaatacgttttttgtttaaa60atttaaaaacggagggggcgagatcactttttgacggcagcctcgtcttctcgggcgtac120gcctgcatgatctcttgcttcttggtggcgatcctctcctcgcgcctcttcttcgcctcc180ttgaccttgagacgtctcgcctctgcctggtccttcaacatctttgatctcgccttttca240gccttcttcttgtgaatgaagtccatcagtaccctcttgtttttgaagacgttacctttg300gctttcatgtaaaggtcgtggtacatttgcctatcgatcttcttggcttctctgtatttt360ttaaggagccgtcgcaggactctcattctgttgacccacaggaccttcacaggcattctg420gcgttggcggtacccttcctcttaccgaagccacagtgacgacccttccgtctggcttct480gtgtttttacggacgcgggctctggagtggacagccacaggctttttgatgatcaaacca540tccttgatcagcttacggatgttttgcctagagttggtgttggcgatttcgttgatttca600ttagggtccaaccacactttcttcttgccgcatctcatcaccgaggcggcgagcctcttc660tgcagtttgagcgaactcatggtcggacgaagagaaccacc701<210>48<211>1927<212>DNA<213>Euschistusheros<400>48aacaaacataacatgatattattaaatgtttcccaaatttataaatatacaaataatata60aagaatcactgaaaaaaaattttgcaacaggaagtttaatctcctttcaatttaatccaa120aaaatattaaatgcaatgaaaaaataaattaaaaaacaaatttgagattagaatatattc180aataaactgtgaaccaacaaataattaattttgaaaatgattataaaaataaaaattaaa240tattaaatctggcagaaactcatttcaaactagtaatcaaattagtcaaactaataattg300atacagaaaatataatctttttaaaattaaacaggcaaaaatatatatatatatatgaat360taacaaaacttttttaactggagttaatgcgactttaagaatttaataaaattataatgt420gctattttacttgttggtttacttacacatttgtttttcaaagagtggcatatttacaag480ttaataacaatacaaaatcaatcacagttattggcactcccgaaaagaagaatgcaagtg540agtttctgcattattaaaaaaatctttatcaatagatatttaagcataatagtttaagtt600ggctttcttctttgcctgcacttctaatattgcatccatgaaatcttcatgagtgacaac660tccagctcctcttcgcaatgctatcatacctgcttccacacaaaccgctttgcattgagc720tccattgaaatcatcagttgaacgagcaagttcttcaaaattaacatcaacactaatatt780catcttacgagaatgaatttgcattatacgtgctcgggcatcttcgttaggatgtgggaa840ttcaatttttctgtctagtcgacctgaacgcaaaagggcgggatccaaaatatctactct900atttgtagctgcaataaccttaatatcagctgttgagctaaatccatctaactggttgag960cagttctaacatagttctttgaacttctcgatcaccagctttttcagaatcaaatctttt1020tgttccaatagcatccaactcgtcaataaagataatagcaggagatttttccttagcaag1080agcaaaagcatctctgacaagtttggctccatctcctataaacatctgaacaagttgggg1140tccagctagtttcaaaaaagttgatttagtttgagctgcacacgctctagccagtaaagt1200ctttcctgttccaggaggtccatagagcaatacacctttaggaggatgaattcctagatt1260ttcaaatttttctttgtgtgtcataggaagaacaacggcttctattaattcttgaatctg1320cttatcaagcccaccgatatcagaatactgctcagtaggtctttcatcaacttccattgc1380tttaactcgtgcatcatactcagcaggcaaggtttcaagaattaaataagaatctttgtt1440tactccaaccagatcacctggctttaacttttcagcatcaactaagcctattactggcaa1500aaaataagtctgcctcgttgatgttttaatgacagcacattttcctttacgacgggcatc1560aaggtcaacaacagcaccatcttcctcagtttcctctggatcaacatcaagcaactctat1620cacattagatactaaatatggtaaagttttgttcactttgatcttttctgtattttcctt1680aattttttctgtttgtgcctgcaactcatgactgactcgcatgacttcacttttcatgat1740tttaatttcattatcaagaagcctaatacgactgacaatttcatccgtagacattctcat1800gatttcttcacctaaagcttgctccattctttcgtcccacaagggcttttcttctgtttt1860ggaagtagacatctgaattgccgaacttaggatgtgaaccaaattaaaacctgtaactac1920aacaaac1927<210>49<211>2170<212>DNA<213>Euschistusheros<400>49ttttttgaacttaaagaaactgtttatttctagtttagttacattgtatttatgaaataa60ttataaatataataatgaaaatgctaataaaaatatcaaaagcaatttactgatatggaa120ttttgatggaatgaaatgataagtagccttaatatccgcccctaagacgcaacactaaat180gcagagttgattccttctggatgttataatcagatagggtacgaccatcctctaattgtt240ttccagcaaaaataagcctctgctgatctggaggtattccttctttgtcctgaattttgg300ctttaacattttcaatagtgtcagatggctcaacttctaaggtaatagtcttgcctgtga360gggtcttgacaaagatctgcataccacctctcaatcgaaggaccagatgtagtgtagatt420ccttctggatattataatctgaaagggtacggccatcttcgagttgttttccagcaaaga480tcaaacgctgctggtcgggaggaattccttctttatcctgaattttagcttttacattct540caattgtatcagatggctctacttccaaggtaatggttttacctgtcaaagtcttcacaa600agatctgcatgcctcctcttagacgaagcaccaaatgcagtgttgattccttttgaatgt660tgtaatcagacaaagttcggccatcttccagctgctttccagcaaaaataagcctctgtt720ggtctggtggtattccttctttatcttgaattttggctttaacattctcaatagtatctg780aaggctcaacttccaaggttatggtcttaccagttagagtctttacaaaaatctgcatgc840cacctctcaagcgaagtacaagatgaagagtagactctttttgaatattataatctgaaa900gggtacggccatcttcaagttgttttccagcaaagatcaaacgttgctggtctggtggaa960ttccttctttgtcctggatttttgcttttacgttctcaatagtatcagatggttcaactt1020ctaaggtgatggtcttccctgttaaagtcttgacaaagatctgcatgcctcctcgaagtc1080taagtacaagatgtaaagtagattccttttggatgttgtaatcagaaagagtacgcccat1140cttctaactgttttcctgcaaagatcagcctttgctgatctggcggaattccttccttat1200cttgaattttggcttttacattttcaatggtatctgacggttcaacttctaaagttatgg1260tttttccagtaagcgtcttaacaaaaatctgcattccacctcttaaacgtaatactaaat1320gtagtgttgattccttctgaatgttataatcagataaagtacgaccatcttccaactgtt1380ttccagcaaagatcaatcgctgctgatctggtggaattccttccttatcttgaattttag1440ctttaacattttcaatagtgtcagaaggttccacttctaatgtaatagttttcccagtca1500aggtttttacaaaaatttgcattcctcctctcagacgaaggaccaaatgcagagtagatt1560ccttttgaatattatagtcagacaatgtacgaccatcttcgagctgtttacctgcaaaaa1620tcaacctctgctgatctggaggaattccttctttatcttgaattttagctttcacatttt1680caattgtgtctgaaggctcaacttcaagtgtgattgttttaccagtaagtgtcttgacaa1740agatctgcatgcctcctcttaaacgtaggacaagatgaagagtagattccttttgaatat1800tatagtcagacaatgtacgaccatcttcgagctgtttacctgcaaaaatcaacctctgtt1860ggtctggaggaattccttctttatcttgaattttagctttaacattttcaattgtatcag1920atggctccacttccaaggtgatggttttaccagtcaaggtcttcacaaaaatttgcatgc1980ctcctctcaaccgaagtactaaatgtaaagtagattctttttgaatattgtaatctgaaa2040gagtacggccatcttcaagctgtttaccagcaaaaatacaacctctgttggtctggaggg2100attccttctttgtcttggattttggccttgacattttctattgtgtcagaaggctcaact2160tctaatgtaa2170權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)1.一種用于控制植物的昆蟲侵?jǐn)_的方法，包括用dsRNA接觸侵?jǐn)_植物的昆蟲，其中所述dsRNA包括18個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的至少一個(gè)片斷，所述片斷的序列與所述昆蟲的靶基因的片段具有約95％到約100％的互補(bǔ)性，和其中所述靶基因的DNA序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44。2.權(quán)利要求1的方法，其中：(a)所述昆蟲選自夜蛾屬、草盲蝽屬、美洲蝽屬和菜蛾屬；(b)所述昆蟲是：(i)草地夜蛾(草地粘蟲)和所述靶基因包含選自SEQIDNOs:1-3的DNA序列；(ii)豆莢草盲蝽(西部無(wú)澤盲蝽)和所述靶基因包含選自SEQIDNOs:4-7、43和44的DNA序列；(iii)Euschistusheros(新熱帶區(qū)褐臭蝽)和所述靶基因包含選自SEQIDNOs:8-9的DNA序列；或(iv)小菜蛾(菜蛾)和所述靶基因包含選自SEQIDNOs:10-12的DNA序列；或(c)所述昆蟲是：(i)草地夜蛾(草地粘蟲)和所述dsRNA包含選自SEQIDNOs:17-19的序列；(ii)豆莢草盲蝽(西部無(wú)澤盲蝽)和所述dsRNA包含選自SEQIDNOs:14-16、22、26、45和46的序列；(iii)Euschistusheros(新熱帶區(qū)褐臭蝽)和所述dsRNA包含選自SEQIDNOs:23-25的序列；或(iv)小菜蛾(菜蛾)和所述dsRNA包含選自SEQIDNOs:13、20-21和28-29的序列。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述dsRNA：(a)包含18個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的多個(gè)片斷，所述片斷的序列與所述昆蟲的靶基因的片段具有約95％到約100％的互補(bǔ)性；(b)包含至少一條其序列與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％同一性或互補(bǔ)性的RNA鏈；(c)是(i)平端的或(ii)在至少一端具有懸垂；(d)是(i)化學(xué)合成的或(ii)通過(guò)在微生物中表達(dá)、通過(guò)在植物細(xì)胞中表達(dá)、或通過(guò)微生物發(fā)酵來(lái)制備；或(e)是化學(xué)修飾的。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述接觸：(a)包括向所述昆蟲表面或被所述昆蟲侵?jǐn)_的所述植物表面施用包含所述dsRNA的組合物；(b)包括向所述昆蟲表面或被所述昆蟲侵?jǐn)_的所述植物表面施用包含所述dsRNA的組合物；其中所述組合物包含固體、液體、粉末、懸浮液、乳劑、噴霧、包封劑、微珠、載體微粒、薄膜、基質(zhì)或種子處理；(c)包括在組合物中提供所述dsRNA，所述組合物進(jìn)一步包含一種或多種選自載體試劑、表面活性劑、有機(jī)硅酮化合物、多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸殺蟲劑、安全劑、誘蟲劑和昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的組分；(d)包括在組合物中提供所述dsRNA，所述組合物進(jìn)一步包含至少一種選自馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇蕓金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發(fā)光桿菌屬殺蟲蛋白、側(cè)孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白的殺蟲劑；(e)包括在被所述昆蟲攝取的組合物中提供所述dsRNA；(f)包括在被所述昆蟲攝取的組合物中提供所述dsRNA，其中所述被攝取的組合物進(jìn)一步包含一種或多種選自載體試劑、表面活性劑、有機(jī)硅酮化合物、多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸殺蟲劑、安全劑、誘蟲劑和昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的組分；(g)包括在被所述昆蟲攝取的組合物中提供所述dsRNA，其中所述被攝取的組合物進(jìn)一步包含至少一種選自馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇蕓金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發(fā)光桿菌屬殺蟲蛋白、側(cè)孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白的殺蟲劑；(h)是處于幼蟲或蛹階段的昆蟲、成蟲或昆蟲卵；或(i)導(dǎo)致所述昆蟲的死亡或發(fā)育障礙。5.一種包含殺蟲有效量的重組RNA分子的殺蟲組合物，其中所述重組RNA分子包括18個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的至少一個(gè)片斷，所述片斷的序列與侵?jǐn)_植物的昆蟲的靶基因的片段具有約95％到約100％的互補(bǔ)性，和其中所述靶基因的DNA序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44。6.權(quán)利要求5的殺蟲組合物，其中所述重組RNA分子：(a)包含至少一條其序列與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％同一性或互補(bǔ)性的RNA鏈；(b)是包含具有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的RNA鏈的dsRNA；或(c)是包含具有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的RNA鏈的dsRNA，其中所述dsRNA的長(zhǎng)度為至少50個(gè)堿基對(duì)。7.權(quán)利要求5的殺蟲組合物，其中：(a)所述昆蟲選自夜蛾屬、草盲蝽屬、美洲蝽屬和菜蛾屬；(b)所述昆蟲是：(i)草地夜蛾(草地粘蟲)和所述靶基因包含選自SEQIDNOs:1-3的DNA序列；(ii)豆莢草盲蝽(西部無(wú)澤盲蝽)和所述靶基因包含選自SEQIDNOs:4-7、43和44的DNA序列；(iii)Euschistusheros(新熱帶區(qū)褐臭蝽)和所述靶基因包含選自SEQIDNOs:8-9的DNA序列；或(iv)小菜蛾(菜蛾)和所述靶基因包含選自SEQIDNOs:10-12的DNA序列；(c)所述昆蟲是：(i)草地夜蛾(草地粘蟲)和所述重組RNA分子包括至少一條RNA鏈，所述RNA鏈的序列與選自SEQIDNOs:17-19的序列具有約95％到約100％同一性或互補(bǔ)性；(ii)豆莢草盲蝽(西部無(wú)澤盲蝽)和所述重組RNA分子包括至少一條RNA鏈，所述RNA鏈的序列與選自SEQIDNOs:14-16、22、26、45和46的序列具有約95％到約100％同一性或互補(bǔ)性；(iii)Euschistusheros(新熱帶區(qū)褐臭蝽)和所述重組RNA分子包括至少一條RNA鏈，所述RNA鏈的序列與選自SEQIDNOs:23-25的序列具有約95％到約100％同一性或互補(bǔ)性；或(iv)小菜蛾(菜蛾)和所述重組RNA分子包括至少一條RNA鏈，所述RNA鏈的序列與選自SEQIDNOs:13、20-21和28-29的序列具有約95％到約100％同一性或互補(bǔ)性；或(d)所述昆蟲是：(i)草地夜蛾(草地粘蟲)和所述重組RNA分子是包含具有選自SEQIDNOs:17-19的序列的RNA鏈的dsRNA；(ii)豆莢草盲蝽(西部無(wú)澤盲蝽)和重組RNA分子是包括具有選自SEQIDNOs:14-16、22、26、45和46的序列的RNA鏈的dsRNA；(iii)Euschistusheros(新熱帶區(qū)褐臭蝽)和重組RNA分子是包括具有選自SEQIDNOs:23-25的序列的RNA鏈的dsRNA；或(iv)小菜蛾(菜蛾)和重組RNA分子是包括具有選自SEQIDNOs:13、20-21和28-29的序列的RNA鏈的dsRNA。8.權(quán)利要求5的殺蟲組合物，其中所述組合物：(a)進(jìn)一步包含一種或多種選自載體試劑、表面活性劑、有機(jī)硅酮化合物、多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸殺蟲劑、安全劑、誘蟲劑和昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的組分；(b)進(jìn)一步包含至少一種選自馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇蕓金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發(fā)光桿菌屬殺蟲蛋白、側(cè)孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白的殺蟲劑；或(c)為選自固體、液體、粉末、懸浮液、乳劑、噴霧、包封劑、微珠、載體微粒、薄膜、基質(zhì)或種子處理的形式。9.用權(quán)利要求5的殺蟲組合物處理的植物或所述植物的種子，其中所述植物對(duì)所述昆蟲表現(xiàn)出改進(jìn)的抗性。10.一種提供對(duì)昆蟲抗性改進(jìn)的植物的方法，包括在植物中表達(dá)含有編碼RNA的DNA的重組DNA構(gòu)建體，所述RNA包括至少一個(gè)與所述昆蟲的靶基因序列的片段基本上同一或基本上互補(bǔ)的沉默元件，其中所述靶基因序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44，和其中通過(guò)所述昆蟲攝取所述RNA導(dǎo)致所述昆蟲的死亡或發(fā)育障礙。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述沉默元件的序列與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％同一性或互補(bǔ)性。12.權(quán)利要求10的方法，其中所述重組DNA構(gòu)建體進(jìn)一步包含與編碼包括至少一個(gè)沉默元件的RNA的所述DNA可操作地連接的異源啟動(dòng)子，其中所述異源啟動(dòng)子在植物細(xì)胞中具有功能。13.權(quán)利要求10的方法，其中通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或通過(guò)引入重組植物病毒載體或重組桿狀病毒載體將所述重組DNA構(gòu)建體提供給植物。14.權(quán)利要求10的方法，其中所述表達(dá)借助于轉(zhuǎn)基因表達(dá)或瞬時(shí)表達(dá)。15.權(quán)利要求10的方法，進(jìn)一步包含在所述植物中表達(dá)至少一種選自馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇蕓金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發(fā)光桿菌屬殺蟲蛋白、側(cè)孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白的殺蟲劑。16.由權(quán)利要求10的方法提供的對(duì)昆蟲的抗性改進(jìn)的植物、或植物的果實(shí)、種子或可繁殖部分。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3