人源化IL?4和IL?4Rα動物的制作方法
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技術領域
本文公開了包含編碼IL-4和/或IL-4Rα蛋白質的核酸序列的非人動物，所述IL-4和/或IL-4Rα蛋白質包含人序列。本文還公開了包含整體或部分為人的IL-4和/或IL-4Rα基因的轉基因非人動物。本發(fā)明還公開了表達人或人源化IL-4和/或IL-4Rα蛋白質的非人動物。另外，本發(fā)明公開了用于制備和使用包含人或人源化IL-4和/或IL-4Rα核酸序列的非人動物的方法。
背景技術：
IL-4和IL-4Rα是用于治療與異常2型T輔助(Th2)細胞相關的各種人疾病、病癥和狀況的治療靶。特異性靶向人IL-4或人IL-4Rα蛋白質的治療分子的藥代動力學(PK)和藥效學(PD)的評估在非人動物例如嚙齒類動物例如小鼠或大鼠中照常規(guī)執(zhí)行。然而，此類治療分子的PD不能在某些非人動物中適當地進行測定，因為這些治療分子不靶向內源IL-4或IL-4Rα蛋白質。
此外，使用與異常Th2細胞相關的各種疾病的非人動物模型評估人特異性IL-4和IL-4Rα蛋白質拮抗劑的治療功效在非人動物中是成問題的，在所述非人動物中，此類物種特異性拮抗劑不與內源IL-4或IL-4Rα蛋白質相互作用。
相應地，存在關于非人動物例如嚙齒類動物例如鼠科動物例如小鼠或大鼠的需要，其中所述非人動物的IL-4和/或IL-4Rα基因是整體或部分人源化的，或分別用包含編碼人或人源化IL-4和/或IL-4Rα蛋白質的序列的人IL-4和/或IL-4Rα基因替換(例如在內源非人基因座處)。
還存在關于包含IL-4和/或IL-4Rα基因(例如人源化或人)的非人動物的需要，在所述非人動物中，IL-4和/或IL-4R基因處于非人調節(jié)元件(例如內源調節(jié)元件)的控制下。
還存在關于人源化非人動物的需要，所述人源化非人動物在血液、血漿或血清中表達人或人源化IL-4蛋白質，其濃度類似于年齡匹配的非人動物的血液、血漿或血清中存在的IL-4蛋白質的濃度，所述年齡匹配的非人動物表達功能IL-4蛋白質，但不含人或人源化IL-4基因，和/或所述人源化非人動物在免疫細胞例如B細胞和T細胞上表達人或人源化IL-4Rα蛋白質，其水平類似于年齡匹配的非人動物的免疫細胞例如B細胞和T細胞上的IL-4Rα蛋白質的水平，所述年齡匹配的非人動物表達功能IL-4Rα蛋白質，但不含人或人源化IL-4Rα基因。
技術實現要素：
本發(fā)明提供了包含編碼IL-4和/或IL-4Rα蛋白質的核酸序列的非人動物，所述IL-4和/或IL-4Rα蛋白質包含人序列。
本發(fā)明提供了包含整體或部分為人的IL-4和/或IL-4Rα基因的轉基因非人動物。
本發(fā)明提供了表達人或人源化IL-4和/或IL-4Rα蛋白質的非人動物。
本發(fā)明提供了具有內源非人動物IL-4和/或IL-4Rα基因的替換(整體或部分)的非人動物。
本發(fā)明提供了包含在內源非人IL-4和/或IL-4Rα基因座處的IL-4和/或IL-4Rα人源化(整體或部分)的非人動物。
本發(fā)明提供了具有人或人源化IL-4基因的非人動物，其中所述非人動物不表達內源IL-4蛋白質，并且其中所述非人動物在血液、血漿或血清中表達人或人源化IL-4蛋白質，其濃度類似于年齡匹配的非人動物的血液、血漿或血清中存在的IL-4蛋白質的濃度，所述年齡匹配的非人動物表達功能內源IL-4蛋白質，但不含人或人源化IL-4基因。
本發(fā)明提供了具有人或人源化IL-4Rα基因的非人動物，其中所述非人動物不表達內源IL-4Rα蛋白質，并且在免疫細胞例如B細胞和T細胞上表達人或人源化IL-4Rα蛋白質，其水平類似于年齡匹配的非人動物的免疫細胞例如B細胞和T細胞上存在的IL-4Rα蛋白質的水平，所述年齡匹配的非人動物表達功能內源IL-4Rα蛋白質，但不含人或人源化IL-4Rα基因。
在一個方面，本發(fā)明提供了包含人或人源化IL-4和/或IL-4Rα核酸序列的非人動物。
在一個方面，本發(fā)明提供了遺傳修飾的非人動物，所述非人動物包含在內源IL-4和/或IL-4Rα基因座處編碼內源IL-4和/或IL-4Rα的基因由編碼人或人源化IL-4和/或IL-4Rα蛋白質的基因的替換。本發(fā)明提供了嚙齒類動物例如小鼠或大鼠，所述嚙齒類動物包含在內源嚙齒類動物IL-4基因座處內源IL-4基因由人IL-4基因的替換，和/或包含在內源嚙齒類動物IL-4Rα基因座處內源IL-4Rα基因由人IL-4Rα基因的替換。在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是大鼠。
在一個方面，本發(fā)明提供了包含內源嚙齒類動物IL-4基因的人源化的遺傳修飾的嚙齒類動物，例如小鼠或大鼠，其中所述人源化包括在內源嚙齒類動物IL-4基因座處包含嚙齒類動物IL-4基因的至少一個外顯子的嚙齒類動物核酸由包含人IL-4基因的至少一個外顯子的核酸序列的替換，以形成經修飾的IL-4基因，其中所述經修飾的IL-4基因的表達處于在內源嚙齒類動物IL-4基因座處的嚙齒類動物調節(jié)元件的控制下。
在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠或大鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是大鼠。
在一個實施例中，經修飾的IL-4基因編碼人或人源化IL-4蛋白質，并且包含人IL-4基因的從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子4。
在一個實施例中，嚙齒類動物是不能表達小鼠IL-4蛋白質的小鼠。
在一個實施例中，嚙齒類動物是表達由內源小鼠IL-4Rα基因編碼的小鼠IL-4Rα蛋白質的小鼠。
在一個實施例中，嚙齒類動物是表達人或人源化IL-4Rα蛋白質的小鼠。
在一個實施例中，人源化IL-4Rα蛋白質包含人IL-4Rα蛋白質的胞外域。
在一個實施例中，人源化IL-4Rα蛋白質包含小鼠IL-4Rα蛋白質的跨膜結構域和細胞質結構域。
在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠，所述小鼠包括在內源小鼠IL-4Rα基因座處包含小鼠IL-4Rα基因的至少一個外顯子的小鼠核酸由包含人IL-4Rα基因的至少一個外顯子的核酸序列的替換，以形成經修飾的IL-4Rα基因，其中所述經修飾的IL-4Rα基因的表達處于在所述內源小鼠IL-4Rα基因座處的小鼠調節(jié)元件的控制下。
在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠，其中包含小鼠IL-4的從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子4的小鼠IL-4序列的連續(xù)基因組片段被替換為包含人IL-4的從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子4的人IL-4序列的連續(xù)基因組片段。
在一個實施例中，編碼人或人源化IL-4Rα蛋白質的經修飾的IL-4Rα基因的表達處于在內源小鼠IL-4Rα基因座處的小鼠調節(jié)元件的控制下。
在一個方面，本發(fā)明提供了包含內源嚙齒類動物IL-4Rα基因的人源化的遺傳修飾的嚙齒類動物，例如小鼠或大鼠，其中所述人源化包括在內源嚙齒類動物IL-4Rα基因座處包含嚙齒類動物IL-4Rα基因的外顯子的嚙齒類動物核酸由編碼人IL-4Rα基因的至少一個外顯子的核酸序列的替換，以形成經修飾的(即，人源化)IL-4Rα基因，其中所述經修飾的、人源化IL-4Rα基因的表達處于在內源嚙齒類動物IL-4Rα基因座處的嚙齒類動物調節(jié)元件的控制下。
在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠或大鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是大鼠。
在一個實施例中，經修飾的IL-4Rα基因編碼人或人源化IL-4Rα蛋白質，并且包含人IL-4Rα基因的從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子5。
在一個實施例中，嚙齒類動物是不能表達小鼠IL-4Rα蛋白質的小鼠。
在一個實施例中，嚙齒類動物是表達由內源小鼠IL-4基因編碼的小鼠IL-4蛋白質的小鼠。
在一個實施例中，嚙齒類動物是表達人或人源化IL-4蛋白質的小鼠。
在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠，所述小鼠包括在內源小鼠IL-4基因座處包含小鼠IL-4基因的外顯子的小鼠核酸由編碼人IL-4基因的至少一個外顯子的核酸序列的替換，以形成經修飾的IL-4基因，其中所述經修飾的IL-4基因的表達處于在所述內源小鼠IL-4基因座處的小鼠調節(jié)元件的控制下。
在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠，并且其中包含IL-4Rα的從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子5的小鼠IL-4Rα序列的連續(xù)基因組片段被替換為包含人IL-4Rα的從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子5的人IL-4Rα序列的連續(xù)基因組片段。
在一個方面，本發(fā)明提供了表達人或人源化IL-4蛋白質的遺傳修飾的嚙齒類動物，例如小鼠或大鼠，其中表達人或人源化IL-4蛋白質的嚙齒類動物包含正常免疫系統(tǒng)，即表達人或人源化IL-4蛋白質的嚙齒類動物的血液、血漿或血清中的免疫細胞例如B細胞和T細胞數目類似于表達功能內源IL-4蛋白質的嚙齒類動物的血液、血漿或血清中的免疫細胞例如B細胞和T細胞數目。在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是大鼠。
在一個方面，本發(fā)明提供了表達來自人或人源化IL-4基因的IL-4蛋白質的遺傳修飾的嚙齒類動物，例如小鼠或大鼠，其中所述嚙齒類動物在其血清中表達人或人源化IL-4蛋白質。在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是大鼠。
在一個實施例中，表達人或人源化IL-4蛋白質的嚙齒類動物的血清具有與表達功能內源IL-4蛋白質的嚙齒類動物，例如野生型小鼠或大鼠大約相同水平的IL-4蛋白質。在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是大鼠。
在一個實施例中，小鼠在血清中表達濃度為年齡匹配的小鼠的血清中存在的IL-4蛋白質水平的至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％的人或人源化IL-4蛋白質，所述年齡匹配的小鼠表達功能內源IL-4蛋白質，但不含在內源小鼠IL-4基因座處內源IL-4基因由人IL-4基因的替換。
在一個實施例中，小鼠在血清中表達濃度為年齡匹配的小鼠的血清中存在的小鼠IL-4蛋白質水平的約10％至約200％、約20％至約150％、或約30％至約100％的人或人源化IL-4蛋白質，所述年齡匹配的小鼠表達功能內源IL-4蛋白質，但不含在內源小鼠IL-4基因座處內源IL-4基因由人IL-4基因的替換。
在一個方面，本發(fā)明提供了表達人或人源化IL-4Rα蛋白質的遺傳修飾的嚙齒類動物，例如小鼠或大鼠，其中所述嚙齒類動物在免疫細胞例如B細胞和T細胞上表達人或人源化IL-4Rα蛋白質，其水平類似于表達功能內源IL-4Rα蛋白質的年齡匹配的嚙齒類動物的免疫細胞例如B細胞和T細胞上存在的IL-4Rα蛋白質的水平。在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是大鼠。
在一個方面，本發(fā)明提供了表達來自人IL-4Rα基因的IL-4Rα蛋白質的遺傳修飾的嚙齒類動物，例如小鼠或大鼠，其中所述嚙齒類動物在免疫細胞例如B細胞和T細胞上表達人或人源化IL-4Rα蛋白質。在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是大鼠。
在一個實施例中，表達人或人源化IL-4Rα蛋白質的嚙齒類動物的免疫細胞例如B細胞和T細胞具有與表達功能內源IL-4Rα蛋白質的嚙齒類動物，例如野生型小鼠或大鼠的免疫細胞例如B細胞和T細胞上大約相同水平的IL-4Rα蛋白質。在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是大鼠。
在一個實施例中，小鼠在免疫細胞例如B細胞和T細胞上表達量為年齡匹配的小鼠的免疫細胞例如B細胞和T細胞上的IL-4Rα蛋白質的量的至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％的人或人源化IL-4Rα蛋白質，所述年齡匹配的小鼠表達功能內源IL-4Rα蛋白質，但不含在內源小鼠IL-4Rα基因座處內源IL-4Rα基因由人IL-4Rα基因的替換。
在一個實施例中，小鼠在免疫細胞例如B細胞和T細胞上表達量為年齡匹配的小鼠的免疫細胞例如B細胞和T細胞上存在的小鼠IL-4Rα蛋白質的量的約10％至約200％、約20％至約150％、或約30％至約100％的人或人源化IL-4Rα蛋白質，所述年齡匹配的小鼠表達功能內源IL-4Rα蛋白質，但不含在內源小鼠IL-4Rα基因座處內源IL-4Rα基因由人IL-4Rα基因的替換。
在一個方面，本發(fā)明提供了包含人源化IL-4Rα基因的遺傳修飾的嚙齒類動物，所述人源化IL-4Rα基因包括嚙齒類動物IL-4Rα胞外域編碼序列由人IL-4Rα胞外域編碼序列的替換，其中所述人源化IL-4Rα基因包含嚙齒類動物IL-4Rα跨膜序列和嚙齒類動物IL-4Rα細胞質序列，其中所述人源化IL-4Rα基因處于在內源IL-4Rα基因座處的內源嚙齒類動物IL-4Rα調節(jié)元件的控制下，并且其中所述嚙齒類動物還包含編碼人或人源化IL-4蛋白質的人源化IL-4基因，其中所述人源化IL-4基因處于在內源IL-4基因座處的內源嚙齒類動物IL-4調節(jié)元件的控制下。
在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠或大鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是大鼠。
在一個實施例中，小鼠不能表達小鼠IL-4蛋白質且不能表達小鼠IL-4Rα蛋白質。
在一個實施例中，在內源嚙齒類動物IL-4基因座和/或嚙齒類動物IL-4Rα基因座處的嚙齒類動物調節(jié)元件或序列來自小鼠或大鼠。
在一個實施例中，嚙齒類動物調節(jié)元件或序列是在嚙齒類動物IL-4基因座和/或嚙齒類動物IL-4Rα基因座處的內源嚙齒類動物調節(jié)元件或序列。
在一個方面，本發(fā)明提供了表達人或人源化IL-4和/或IL-4Rα蛋白質的非人動物例如嚙齒類動物例如小鼠或大鼠，其中所述非人動物表達來自內源非人IL-4Rα基因座和/或內源非人IL-4Rα基因座的人或人源化IL-4和/或IL-4Rα蛋白質。在一個實施例中，非人動物是嚙齒類動物。在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是大鼠。
在一個方面，本發(fā)明提供了表達來自內源小鼠IL-4基因座的人或人源化IL-4蛋白質的遺傳修飾的小鼠，其中所述內源小鼠IL-4基因已整體或部分被替換為人IL-4基因。
在一個實施例中，包括從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子4(包括3'非翻譯區(qū))和外顯子4下游的3'區(qū)域的一部分，在內源小鼠IL-4基因座處約6.3kb的連續(xù)小鼠基因組核酸被缺失且被替換為約8.8kb的人IL-4核酸序列，所述人IL-4核酸序列包括人IL-4基因的從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子4(包括3'非翻譯區(qū))和外顯子4下游的3'區(qū)域的一部分。在一個具體實施例中，替換小鼠基因組核酸的人IL-4核酸序列包括人BAC RP11-17K19的人IL-4基因的從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子4和外顯子4下游的3'區(qū)域的一部分。在一個具體實施例中，經修飾的IL-4基因包括小鼠IL-4 5'調節(jié)元件和從ATG起始密碼子開始的人IL-4外顯子1到外顯子4，即IL-4蛋白質編碼序列。
在一個方面，本發(fā)明提供了包含編碼人或人源化IL-4蛋白質的核苷酸序列的遺傳修飾的小鼠，其中編碼人或人源化IL-4蛋白質的核苷酸序列整體或部分替換編碼內源小鼠IL-4蛋白質的內源核苷酸序列。
在一個方面，本發(fā)明提供了表達來自內源小鼠IL-4Rα基因座的人或人源化IL-4Rα蛋白質的遺傳修飾的小鼠，其中所述內源小鼠IL-4Rα基因已整體或部分被替換為人IL-4Rα基因。
在一個實施例中，包括從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子5和內含子5的一部分，在內源小鼠IL-4Rα基因座處約7.1kb的連續(xù)小鼠基因組核酸被缺失且被替換為約15.6kb的人IL-4Rα核酸序列，所述人IL-4Rα核酸序列包括人IL-4Rα基因的從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子5和內含子5的一部分。在一個具體實施例中，替換小鼠基因組核酸的人IL-4α核酸包括人BAC RP11-16E24的人IL-4α基因的從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子5和內含子5的一部分。在一個具體實施例中，替換小鼠基因組核酸的人IL-4Rα核酸包括完整的人IL-4Rα胞外域編碼序列。
在一個方面，本發(fā)明提供了用于制備人源化IL-4嚙齒類動物的方法，所述方法包括用包含人IL-4基因序列的一個或多個外顯子的人IL-4核酸序列替換編碼嚙齒類動物IL-4蛋白質的嚙齒類動物IL-4基因序列，以形成編碼人或人源化IL-4蛋白質的經修飾的、人源化IL-4基因，其中所述替換在內源嚙齒類動物IL-4基因座處，并且包含人IL-4基因序列的一個或多個外顯子且編碼人或人源化IL-4蛋白質的人源化IL-4基因序列可操作地連接至在內源嚙齒類動物IL-4基因座處的嚙齒類動物調節(jié)元件或序列(例如5'和/或3'調節(jié)元件)。
在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠或大鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是大鼠。
在一個實施例中，嚙齒類動物調節(jié)元件或序列來源于小鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物調節(jié)元件或序列來源于大鼠。
在一個實施例中，嚙齒類動物調節(jié)元件或序列是在嚙齒類動物IL-4基因座處的內源嚙齒類動物調節(jié)元件或序列。在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是大鼠。
在一個實施例中，替換嚙齒類動物IL-4基因序列的人IL-4核酸序列包括人IL-4基因序列的至少一個外顯子。在其他實施例中，替換嚙齒類動物IL-4基因序列的人IL-4核酸序列包括人IL-4基因序列的至少2個或至少3個外顯子。在一個實施例中，替換嚙齒類動物IL-4基因序列的人IL-4核酸序列包括人IL-4基因序列的所有4個外顯子。在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是大鼠。
在一個實施例中，替換嚙齒類動物IL-4基因序列的人IL-4核酸序列編碼與人IL-4(例如由GenBank登錄號NM_000589.3s中所示的核酸編碼的人IL-4蛋白質)約85％、90％、95％、96％、97％、98％或約99％等同的蛋白質。
在一個實施例中，替換在內源嚙齒類動物IL-4基因座處，并且包括人IL-4基因序列的一個或多個外顯子且編碼人或人源化IL-4蛋白質的人源化IL-4基因序列可操作地連接至在內源嚙齒類動物IL-4基因座處的內源嚙齒類動物調節(jié)元件或序列(例如5'和/或3'調節(jié)元件)。
在一個方面，本發(fā)明提供了用于制備人源化IL-4小鼠的方法，所述方法包括將編碼小鼠IL-4蛋白質的小鼠IL-4基因序列替換為人IL-4基因序列，以形成編碼人或人源化IL-4蛋白質的經修飾的、人源化IL-4基因。
在一個實施例中，替換在內源小鼠IL-4基因座處，并且所得到的編碼人或人源化IL-4蛋白質的人源化IL-4基因可操作地連接至在內源小鼠IL-4基因座處的小鼠調節(jié)元件或序列(例如5'和/或3'調節(jié)元件)。
在一個實施例中，替換在內源小鼠IL-4基因座處，并且編碼人或人源化IL-4蛋白質的人源化IL-4基因可操作地連接至在內源小鼠IL-4基因座處的內源小鼠調節(jié)元件或序列(例如5'和/或3'調節(jié)元件)。
在一個方面，本發(fā)明提供了用于制備人源化IL-4Rα嚙齒類動物的方法，所述方法包括用包含人IL-4Rα基因序列的一個或多個外顯子的人IL-4Rα核酸序列替換編碼嚙齒類動物IL-4Rα蛋白質的嚙齒類動物IL-4Rα基因序列，以形成編碼人或人源化IL-4Rα蛋白質的經修飾的、人源化IL-4Rα基因，其中所述替換在內源嚙齒類動物IL-4Rα基因座處，并且包含人IL-4Rα基因序列的一個或多個外顯子且編碼人或人源化IL-4Rα蛋白質的人源化IL-4Rα基因序列可操作地連接至在內源嚙齒類動物IL-4Rα基因座處的嚙齒類動物調節(jié)元件或序列(例如5'和/或3'調節(jié)元件)。
在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠或大鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是大鼠。
在一個實施例中，嚙齒類動物調節(jié)元件或序列來源于小鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物調節(jié)元件或序列來源于大鼠。
在一個實施例中，嚙齒類動物調節(jié)元件或序列是在嚙齒類動物IL-4Rα基因座處的內源嚙齒類動物調節(jié)元件或序列。在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是大鼠。
在一個實施例中，替換嚙齒類動物IL-4Rα基因序列的人IL-4Rα核酸序列包括人IL-4Rα基因序列的至少一個外顯子。在其他實施例中，替換嚙齒類動物IL-4Rα基因序列的人IL-4Rα核酸序列包括人IL-4Rα基因序列的至少2、3、4、5、6、7或8個外顯子。在一個實施例中，替換嚙齒類動物IL-4Rα基因序列的人IL-4Rα核酸序列包括人IL-4Rα基因序列的所有9個外顯子。在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是大鼠。
在一個實施例中，替換嚙齒類動物IL-4Rα基因序列的人IL-4Rα核酸序列編碼與人IL-4Rα(例如由GenBank登錄號NM_000418.3中所示的核酸編碼的人IL-4Rα蛋白質)約85％、90％、95％、96％、97％、98％或約99％等同的蛋白質。
在一個實施例中，替換嚙齒類動物IL-4Rα基因序列的人IL-4Rα核酸序列包括編碼人IL-4Rα蛋白質的胞外域的人IL-4Rα基因序列的至少一個外顯子。在其他實施例中，替換嚙齒類動物IL-4Rα基因序列的人IL-4Rα核酸序列包括編碼人IL-4Rα蛋白質的胞外域的人IL-4Rα基因序列的至少2、3或4個外顯子。在一個實施例中，替換嚙齒類動物IL-4Rα基因序列的人IL-4Rα核酸序列包括編碼人IL-4Rα蛋白質的胞外域的人IL-4Rα基因序列的所有5個外顯子。在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是大鼠。
在一個實施例中，替換嚙齒類動物IL-4Rα基因序列的人或人源化IL-4Rα基因序列編碼與人IL-4Rα蛋白質的胞外域(例如由GenBank登錄號NM_000418.3中所示的核酸編碼的人IL-4Rα蛋白質)約85％、90％、95％、96％、97％、98％或約99％等同的IL-4Rα蛋白質的胞外域。
在一個實施例中，替換在內源嚙齒類動物IL-4Rα基因座處，并且包括人IL-4Rα基因序列的一個或多個外顯子且編碼人或人源化IL-4Rα蛋白質的人源化IL-4Rα基因序列可操作地連接在內源嚙齒類動物IL-4Rα基因座處的內源嚙齒類動物調節(jié)元件或序列(例如5'和/或3'調節(jié)元件)。
在一個方面，本發(fā)明提供了用于制備人源化IL-4Rα小鼠的方法，所述方法包括將編碼小鼠IL-4Rα蛋白質的小鼠IL-4Rα基因序列替換為人IL-4Rα核酸序列，以形成編碼人或人源化IL-4Rα蛋白質的人源化IL-4Rα基因。
在一個實施例中，替換在內源小鼠IL-4Rα基因座處，并且編碼人或人源化IL-4Rα蛋白質的人源化IL-4Rα基因可操作地連接至在內源小鼠IL-4Rα基因座處的小鼠調節(jié)元件或序列(例如5'和/或3'調節(jié)元件)。
在一個實施例中，替換在內源小鼠IL-4Rα基因座處，并且編碼人或人源化IL-4Rα蛋白質的人源化IL-4Rα基因可操作地連接至在內源小鼠IL-4Rα基因座處的內源小鼠調節(jié)元件或序列(例如5'和/或3'調節(jié)元件)。
在各個方面，本文描述的遺傳修飾的非人動物例如嚙齒類動物例如小鼠或大鼠包括在其種系中的遺傳修飾。
在一個方面，本發(fā)明提供了包含如本文描述的遺傳修飾的非人動物例如嚙齒類動物例如小鼠或大鼠胚胎。
在一個方面，本發(fā)明提供了包含供體細胞的非人動物例如嚙齒類動物例如小鼠或大鼠宿主胚胎，所述供體細胞包含如本文描述的遺傳修飾。
在一個方面，本發(fā)明提供了包含如本文描述的遺傳修飾的多能或全能非人動物例如嚙齒類動物例如小鼠或大鼠細胞。在一個實施例中，細胞是嚙齒類動物細胞。在一個實施例中，細胞是小鼠細胞。在一個實施例中，細胞是嚙齒類動物ES細胞。在一個實施例中，細胞是小鼠ES細胞。
在一個方面，本發(fā)明提供了非人動物例如嚙齒類動物例如小鼠或大鼠卵子，其中所述非人動物卵子包含異位非人動物染色體，其中所述異位非人動物染色體包含如本文描述的遺傳修飾。在一個實施例中，非人動物是嚙齒類動物。在一個實施例中，嚙齒類動物是小鼠。在一個實施例中，嚙齒類動物是大鼠。
在一個方面，遺傳修飾為包含人IL-4基因或人IL-4Rα基因的小鼠胚胎、卵子或細胞是選自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL品系的小鼠的。在另一個實施例中，小鼠是選自其為129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如129S1/SV、129S1/Svlm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2的品系的129品系(參見例如Festing等人(1999)Revised nomenclature for strain 129mice,Mammalian Genome 10:836，還參見Auerbach等人(2000)Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv-and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines)。在一個具體實施例中，遺傳修飾的小鼠是上述129品系和上述C57BL/6品系的混合品系(mix)。在另一個具體實施例中，小鼠是上述129品系的混合品系或上述BL/6品系的混合品系。在一個具體實施例中，混合品系的129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在另一個實施例中，小鼠是BALB品系例如BALB/c品系。在另外一個實施例中，小鼠是BALB品系和另一種上述品系的混合品系。在一個實施例中，小鼠是Swiss或Swiss Webster小鼠。
在各個方面，包含人或人源化IL-4R和/或IL-4核酸序列的非人動物選自哺乳動物和鳥類。在一個實施例中，非人動物是哺乳動物。在一個實施例中，哺乳動物是鼠科動物。
在一個方面，本發(fā)明提供了篩選人特異性IL-4或IL-4Rα拮抗劑的方法。該方法可用于鑒定治療候選物且評估治療功效。該方法包括給如本文描述的對于IL-4和IL-4Rα雙重人源化的遺傳修飾的嚙齒類動物施用試劑，測定試劑對由IL-4/IL-4Rα信號傳導途徑介導的生物功能的作用，并且如果試劑在遺傳修飾的嚙齒類動物中拮抗由IL-4/IL-4Rα信號傳導途徑介導的功能，則將其鑒定為人特異性IL-4或IL-4Rα拮抗劑。
在一個實施例中，試劑包含結合IL-4或IL-4Rα的免疫球蛋白可變結構域。在一個實施例中，試劑特異性結合人IL-4或IL-4Rα，而不特異性結合嚙齒類動物IL-4或IL-4Rα。在一個實施例中，試劑是抗體。在一個具體實施例中，試劑是特異性結合人IL-4Rα而不特異性結合嚙齒類動物IL-4Rα的抗體。
在一個實施例中，篩選方法利用表達人IL-4蛋白質和人源化IL-4Rα蛋白質的雙重人源化小鼠，其中所述人源化IL-4Rα蛋白質包括與內源小鼠IL-4Rα蛋白質的跨膜和細胞質結構域連接的人IL-4Rα蛋白質的胞外域，并且其中所述小鼠不表達鼠IL-4或鼠IL-4Rα。
在一些實施例中，篩選方法包括下述步驟：在如本文描述的雙重人源化嚙齒類動物中誘導與IL-4/IL-4Rα信號傳導相關的疾病，給嚙齒類動物施用試劑，測定試劑是否改善疾病，并且如果試劑改善疾病，則將試劑鑒定為適合于治療疾病的人特異性IL-4或IL-4Rα拮抗劑。
在一些實施例中，與IL-4/IL-4Rα信號傳導相關的疾病是氣道炎癥，其可通過以一個或多個劑量鼻內施用變應原(例如房塵螨提取物)一段時間在嚙齒類動物中進行誘導。試劑的作用可通過測量氣道炎癥的程度(通過例如粘液累積、支氣管肺泡灌洗液中的浸潤細胞和/或總循環(huán)IgE水平反映)是否由于試劑施用而減輕進行測定。
在一些實施例中，與IL-4/IL-4Rα信號傳導相關的疾病是皮膚炎癥或特應性皮炎，其可通過制備皮膚損傷且使損傷的皮膚暴露于以一個或多個劑量的變應原(例如細菌毒素或房塵螨提取物)一段時間在嚙齒類動物中進行誘導。試劑的作用可通過測量皮膚炎癥是否由于試劑施用而減輕進行測定。
在一個進一步方面，其IL-4、IL-4Rα和IL-33基因已如本文描述人源化的三重人源化非人動物用于評估化合物或化合物組合的藥效學(PD)和治療功效。
本文描述的方面和實施例各自能夠一起使用，除非根據實施例或方面的上下文明確或清楚排除。
附圖說明
圖1提供了關于IL-4和IL-13信號轉導的受體以及dupilumab的作用機制的并非按比例繪制的圖示，所述dupilumab是與人IL-4受體α鏈(IL-4Rα)特異性結合的中和性全人單克隆抗體。
圖2A-2B提供了關于IL-4(Il4)和IL-4Rα(Il4ra)基因座的人源化策略的并非按比例繪制的圖示。(2A)跨越從在ATG起始密碼子處開始的外顯子1到外顯子4(包括3'非翻譯區(qū))的編碼區(qū)和外顯子4下游的3'區(qū)域的一部分的小鼠IL-4基因(上方的圖)被缺失，且被替換為人IL-4基因的從在ATG密碼子處開始的外顯子1到外顯子4(包括3'非翻譯區(qū))的編碼區(qū)和外顯子4下游的3'區(qū)域的一部分連同兩側加有l(wèi)oxP位點的(floxed)hygro選擇盒l(wèi)oxP(下方的圖)，如所示的。(2B)跨越從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子5的編碼區(qū)和內含子5的一部分的小鼠IL-4Rα基因(上方的圖)被缺失，且被替換為人IL-4Rα基因的從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子5的編碼區(qū)和內含子5的一部分連同兩側加有l(wèi)oxP位點的neo選擇盒(下方的圖)，如所示的。
圖3顯示了在來自雙重人源化IL-4/IL-4Rα(Il4hu/hu/Il4rahu/hu)小鼠的B細胞和T細胞上的人源化IL-4Rα蛋白質的表達。
圖4顯示了使用來源于人源化IL4Rα(Il4rahu/hu)小鼠的原代細胞的IL-4和IL-13配體特異性和受體功能性。
圖5顯示了在野生型而不是人源化IL4Rα(Il4rahu/hu)小鼠體內的IL-4依賴性IgE生產。
圖6顯示了在小鼠B細胞中劑量依賴性IL-4誘導的離體mIgE生產(左圖)被dupilumab以劑量依賴性方式阻斷(右圖)。
圖7顯示了dupilumab以劑量依賴性方式預防人源化IL4Rα(Il4rahu/hu)小鼠體內IL-25誘導的肺病理學。
圖8顯示了用于使用雙重人源化IL-4和IL-4Rα(IL-4hu/hu/IL-4Rhu/hu)小鼠評估dupilumab在房塵螨提取物(HDM)誘導的肺炎癥模型中的治療功效的實驗設計?！癛EGN668”指針對人IL-4Rα的人單克隆抗體，也稱為dupilumab。“REGN129”指小鼠sol IL-13Rα2-Fc，其為小鼠IL-13R2α的胞外域和Fc之間的融合蛋白。
圖9顯示了用于使用雙重人源化IL-4和IL-4Rα(IL-4hu/hu/IL-4Rhu/hu)小鼠和同種型對照抗體評估dupilumab在HDM誘導的肺炎癥模型中的治療功效的實驗設計。
圖10A-10C示出了關于小鼠IL-33基因座的人源化策略。圖10A示出了跨越從在ATG起始密碼子處開始的外顯子2到外顯子8中的終止密碼子的編碼區(qū)的小鼠IL-33基因(上方的圖)被缺失，且被替換為人IL-33基因的從在ATG密碼子處開始的外顯子2到外顯子8(包括3'非翻譯區(qū))的編碼區(qū)(下方的圖)。圖10B顯示了在小鼠ES細胞克隆MAID 7060中的人源化IL-33等位基因，其含有l(wèi)oxP新霉素選擇盒。圖10C顯示了在小鼠ES細胞克隆MAID 7061中的人源化IL-33等位基因，其中新霉素選擇盒已被缺失，而loxP和克隆位點(77bp)保留在人IL-33序列下游，并且小鼠3'UTR保留在loxP位點下游。
具體實施方式
作為治療靶的IL-4和IL-4Rα
變應性病癥是尤其在發(fā)達國家以增加速率出現的疾病譜。特應性皮炎、哮喘和變應性鼻炎是患有變態(tài)反應的患者中最常見的炎性狀況；這些患者通常遭受多重臨床癥狀的發(fā)作。變態(tài)反應的發(fā)病機制與針對外源性抗原的異常免疫應答聯系(常見Mueller等人(2002)Structure,binding,and antagonists in the IL-4/IL-13 receptor system,Biochim Biophys Acta 1592:237-250)。
抗原特異性IgE的過度生產是觸發(fā)變應性炎癥的必需組分。異常2型T輔助細胞(Th2)極化促成增加的IgE應答。
最初由活化T細胞鑒定的白細胞介素-4(IL-4)和白細胞介素-13(IL-13)是在起始且維持變態(tài)反應中的免疫和炎癥反應中起關鍵作用的主要Th2細胞因子。
IL-4和IL-13信號傳導通過具有共享亞基IL-4受體α(IL-4Rα)的兩種不同的受體復合物介導，這可促成這兩種細胞因子之間的重疊生物應答。參見圖1。
關于白細胞介素-4/13信號轉導的受體和dupilumab的作用機制。IL-4Rα形成兩種不同的異二聚受體復合物，以組織和應答特異性方式介導IL-4和IL-13的生物學功能。由IL-4Rα和共同細胞因子受體γ鏈(γC)組成的I型受體對于IL-4是獨特的。在IL-4Rα和IL-13Rα1之間形成的II型受體是關于IL-13的主要受體，但對于IL-4也是有功能的。另外，IL-13與第二高親和力受體IL-13Rα2結合，所述IL-13Rα2一般公認為誘餌受體或在全長形式中具有可能的促纖維化效應。
Dupilumab是針對人IL-4Rα的拮抗性單克隆抗體，其抑制由IL-4和IL-13誘導的生物活性。Dupilumab通過阻止其與受體亞基的結合來阻斷IL-4信號轉導，而對IL-13信號傳導的抑制作用有可能通過干擾二聚受體相互作用來介導。
Dupilumab，針對共享的IL-4Rα亞基的全人單克隆抗體，使用小鼠在Regeneron Pharmaceuticals,Inc.開發(fā)。Dupilumab處于治療中度至重度哮喘和治療中度至重度特應性皮炎的臨床試驗中。
在鼠模型中評估dupilumab的功效提出多重挑戰(zhàn)：(a)dupilumab不識別同源小鼠IL-4受體；和(b)存在小鼠IL-4蛋白質和人IL-4受體之間的功能相互作用的缺乏。
IL-4基因和蛋白質
IL-4基因編碼分泌的IL-4蛋白質，所述IL-4蛋白質在B細胞以及其他細胞類型的活化中起重要作用(參見圖1)。
人IL-4。NCBI基因ID：3565；原始源：HGNC:6014；RefSeq轉錄物：NM_000589.3；UniProt ID：P05112；基因組裝配：GRCh37；位置：chr5:132,009,743-132,018,576+鏈。
人IL-4基因位于染色體5上5q31.1處。人IL-4基因具有4個外顯子且編碼長度153個氨基酸的前體多肽，包括24個氨基酸的信號肽和129個氨基酸的成熟IL-4蛋白質。
小鼠IL-4。NCBI基因ID：16189；原始源：MGI:96556；RefSeq轉錄物：NM_021283.2；UniProt ID：P07750；基因組裝配：GRCm38；位置：chr11:53,612,350-53,618,606–鏈。
小鼠IL-4基因位于染色體11上11 31.97cM處。小鼠IL-4基因具有4個外顯子且編碼長度140個氨基酸的前體多肽，包括20個氨基酸的信號肽和120個氨基酸的成熟IL-4蛋白質。
IL-4Rα基因和蛋白質
IL-4Rα基因編碼跨膜受體IL-4Rα蛋白質，所述IL-4Rα蛋白質主要在B細胞和T細胞上表達，是關于IL-4和IL-13蛋白質的受體(參見圖1)。
人IL-4Rα。NCBI基因ID：3566；原始源：MGI:6015；RefSeq轉錄物：NM_000418.3；UniProt ID：P24394；基因組裝配：GRCh37；位置：chr16:27,351,525-27,367,111+鏈。
人IL-4Rα基因位于染色體16上16p12.1-p11.2處。人IL-4Rα基因具有9個編碼外顯子且編碼825個氨基酸的前體多肽，包括25個氨基酸的信號肽和800個氨基酸的成熟IL-4Rα蛋白質，其中成熟蛋白質的前207個氨基酸殘基構成細胞外結構域。人IL-4Rα蛋白質的細胞外結構域(即胞外域)由人IL-4Rα基因的編碼外顯子1到5編碼。
小鼠IL-4Rα。NCBI基因ID：16190；原始源：MGI:105367；RefSeq轉錄物：NM_001008700.3；UniProt ID：P16382；基因組裝配：GRCm38；位置：chr11:125,565,655-125,572,745+鏈。
小鼠IL-4Rα基因位于染色體7上7 68.94cM處。小鼠IL-4Rα基因具有9個編碼外顯子且編碼810個氨基酸的前體多肽，包括25個氨基酸的信號肽和785個氨基酸的成熟IL-4Rα蛋白質，其中成熟蛋白質的前208個氨基酸殘基構成細胞外結構域。小鼠IL-4Rα蛋白質的細胞外結構域(即胞外域)由小鼠IL-4Rα基因的編碼外顯子1到5編碼。
IL-4和IL-4Rα蛋白質的物種特異性
如本文所示，小鼠而不是人IL-4在野生型小鼠中是有功能的，并且相反，人而不是小鼠IL-4在人源化IL-4Rα(Il4rahu/hu)小鼠中是有功能的。(還參見例如Andrews等人(2001)Reconstitution of a functional human type II IL-4/IL-13 receptor in mouse B cells:demonstration of species specificity,J Immunol.166:1716-1722)。
人IL-4和IL-4Rα抑制劑的物種特異性
靶向IL-4或IL-4Rα蛋白質的候選治療分子通常就在非人動物例如嚙齒類動物例如小鼠或大鼠中的藥代動力學(PK)和藥效學(PD)進行評估。此類治療分子也就在與異常Th2細胞相關的人疾病、病癥和狀況的非人動物例如嚙齒類動物例如小鼠或大鼠模型中的體內治療功效進行測試。
然而，對于人IL-4或IL-4Rα蛋白質特異性的治療分子，例如人特異性IL-4或IL-4Rα抑制劑，不能就嚙齒類動物特別是小鼠中的PD或體內治療功效進行充分評估，因為這些治療分子的靶是缺失的。由于IL-4蛋白質的上述物種特異性，該問題無法使用表達人IL-4或IL-4Rα蛋白質的轉基因非人動物例如嚙齒類動物例如小鼠或大鼠得到克服。
相應地，在各個實施例中，為了評價人特異性IL-4或IL-4Rα蛋白質拮抗劑或抑制劑在非人動物例如嚙齒類動物例如小鼠或大鼠中的PD和體內治療功效，期望用人IL-4和/或IL-4Rα蛋白質替換內源IL-4和/或IL-4Rα蛋白質。
此外，在各個實施例中，為了避免人IL-4和/或IL-4Rα蛋白質的過度表達或表達不足的潛在問題，期望將人IL-4和/或IL-4Rα基因插入在內源IL-4和/或IL-4基因基因座處的非人動物例如嚙齒類動物例如小鼠或大鼠的基因組內，并且在非人動物例如嚙齒類動物例如小鼠或大鼠中表達至少部分處于內源IL-4和/或IL-4Rα調節(jié)元件的控制下的人IL-4和/或IL-4Rα蛋白質。
遺傳修飾的非人動物
本文提供了遺傳修飾的非人動物，其內源IL-4基因和/或IL-4Rα基因已在內源IL-4基因座和/或IL-4Rα基因座處整體或部分被替換為人IL-4核酸和/或人IL-4Rα核酸，以形成編碼人或人源化IL-4和/或人或人源化IL-4Rα蛋白質的經修飾的IL-4基因和/或經修飾的IL-4Rα基因。
如本文使用的，短語“非人動物”指并非人的任何脊椎動物生物。在一些實施例中，非人動物是哺乳動物。在具體實施例中，非人動物是嚙齒類動物例如大鼠或小鼠。
在一個方面，本發(fā)明提供了遺傳修飾的嚙齒類動物，例如小鼠或大鼠，其內源嚙齒類動物IL-4基因已在內源IL-4基因座處整體或部分被替換為人IL-4核酸。
替換涉及嚙齒類動物IL-4基因的至少一個外顯子即一個或多個外顯子由包含人IL-4基因的至少一個外顯子的人核酸的替換。在一些實施例中，包括嚙齒類動物IL-4基因的從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子4的連續(xù)嚙齒類動物基因組片段已被替換為包括人IL-4基因的從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子4的連續(xù)人基因組片段。在一個具體實施例中，嚙齒類動物是小鼠，并且包括從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子4(包括3'非翻譯區(qū))和外顯子4下游的3'區(qū)域的一部分，在內源小鼠IL-4基因座處約6.3kb的連續(xù)小鼠基因組片段被缺失且被替換為約8.8kb的人IL-4核酸序列，所述人IL-4核酸序列包括人IL-4基因的從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子4(包括3'非翻譯區(qū))和外顯子4下游的3'區(qū)域的一部分。
在一些實施例中，替換導致在內源IL-4基因基因座處的經修飾的、人源化IL-4基因，其中所述經修飾的IL-4基因的表達處于在內源IL-4基因座處的內源調節(jié)元件的控制下。如本文使用的，術語“調節(jié)元件”指轉錄調節(jié)序列，包括5'轉錄調節(jié)序列例如啟動子、增強子和抑制元件，以及3'轉錄調節(jié)序列例如轉錄終止序列。在一些實施例中，經修飾的IL-4基因的表達處于內源5'調節(jié)元件的控制下。在其他實施例中，經修飾的IL-4基因的表達處于內源3'調節(jié)元件的控制下。在某些實施例中，經修飾的IL-4基因的表達處于內源5'和3'調節(jié)元件的控制下。
在內源IL-4基因座處形成的經修飾的、人源化IL-4基因編碼人或人源化IL-4蛋白質。術語“人源化”指核酸或蛋白質，所述核酸或蛋白質包括在非人動物(例如嚙齒類動物例如小鼠或大鼠)中發(fā)現的基因或蛋白質的部分或序列，并且還包括不同于在非人動物中發(fā)現的那些而是對應于(等同于)配對人基因或蛋白質的部分或序列的部分或序列。經修飾的、人源化IL-4基因可編碼與人IL-4蛋白質(例如由GenBank登錄號NM_000589.3中所示的核酸編碼的人IL-4蛋白質)至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％等同，或100％等同的IL-4蛋白質。
具有在內源IL-4基因座處的內源嚙齒類動物IL-4基因整體或部分由人IL-4核酸的替換的遺傳修飾的嚙齒類動物就替換而言可為純合或雜合的。在一些實施例中，遺傳修飾的嚙齒類動物就替換而言是雜合的，即內源嚙齒類動物IL-4基因的兩個拷貝中僅一個已被替換為人IL-4核酸。在其他實施例中，遺傳修飾的嚙齒類動物就替換而言是純合的，即內源嚙齒類動物IL-4基因的兩個拷貝均已被替換為人IL-4核酸。
遺傳修飾的嚙齒類動物在血清中表達人或人源化IL-4蛋白質。在一些實施例中，遺傳修飾的嚙齒類動物不表達內源嚙齒類動物IL-4蛋白質。在一個實施例中，表達人或人源化IL-4蛋白質的嚙齒類動物的血清具有與表達功能內源IL-4蛋白質的嚙齒類動物例如野生型嚙齒類動物(例如表達功能內源IL-4蛋白質，但不含在內源IL-4基因座處內源IL-4基因整體或部分由人IL-4核酸的替換的嚙齒類動物)大約相同水平的IL-4蛋白質?！按蠹s相同的水平”意指落入在野生型嚙齒類動物中的水平的任一方向上(即大于或小于)25％、20％、15％、10％、5％或更少內的水平。在其他實施例中，嚙齒類動物在血清中表達濃度為年齡匹配的嚙齒類動物的血清中存在的IL-4蛋白質水平的至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％的人或人源化IL-4蛋白質，所述年齡匹配的嚙齒類動物表達功能內源IL-4蛋白質，但不含在內源IL-4基因座處內源IL-4基因整體或部分由人IL-4核酸的替換。
在一些實施例中，具有內源嚙齒類動物IL-4基因整體或部分由人IL-4核酸的替換且在血清中表達人或人源化IL-4蛋白質的遺傳修飾的嚙齒類動物具有正常免疫系統(tǒng)，即表達人或人源化IL-4蛋白質的嚙齒類動物的血液、血漿或血清中的免疫細胞例如B細胞和T細胞數目類似于表達功能內源IL-4蛋白質且不具有內源嚙齒類動物IL-4基因整體或部分由人IL-4核酸的替換的嚙齒類動物的血液、血漿或血清中的免疫細胞例如B細胞和T細胞數目。
在另外的實施例中，具有內源嚙齒類動物IL-4基因整體或部分由人IL-4核酸的替換且表達人或人源化IL-4蛋白質的遺傳修飾的嚙齒類動物還包括在內源IL-4Rα基因座處內源嚙齒類動物IL-4Rα基因整體或部分由人IL-4Rα核酸的替換，并且因此還表達人或人源化IL-4Rα蛋白質。
在另一個方面，本發(fā)明提供了遺傳修飾的嚙齒類動物例如小鼠或大鼠，其內源嚙齒類動物IL-4Rα基因已在內源IL-4Rα基因座處整體或部分被替換為人IL-4Rα核酸。
替換涉及嚙齒類動物IL-4Rα基因的至少一個外顯子即一個或多個外顯子由包含人IL-4Rα基因的至少一個外顯子的人核酸的替換。在一些實施例中，替換涉及編碼嚙齒類動物胞外域的嚙齒類動物IL-4Rα基因的外顯子中的至少一個由編碼人胞外域的人IL-4Rα基因的外顯子中的至少一個的替換。在一些實施例中，替換涉及由包含編碼人IL-4Rα基因的胞外域的5個外顯子中的至少2、3或4個的人核酸的替換。在其他實施例中，包括嚙齒類動物IL-4Rα基因的從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子5的連續(xù)嚙齒類動物基因組片段已被替換為包括人IL-4Rα基因的從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子5的基因組片段。在一個具體實施例中，嚙齒類動物是小鼠，并且包括從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子5和內含子5的一部分，在內源小鼠IL-4Rα基因座處約7.1kb的連續(xù)小鼠基因組片段被缺失且被替換為約15.6kb的人IL-4Rα核酸序列，所述人IL-4Rα核酸序列包括人IL-4Rα基因的從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子5和內含子5的一部分。
在一些實施例中，替換導致在內源IL-4Rα基因基因座處的經修飾的、人源化IL-4Rα基因，其中所述經修飾的IL-4Rα基因的表達處于在內源IL-4Rα基因座處的內源調節(jié)元件的控制下。
在內源IL-4Rα基因座處形成的經修飾的、人源化IL-4Rα基因編碼人或人源化IL-4Rα蛋白質。在一些實施例中，經修飾的、人源化IL-4Rα基因編碼與人IL-4Rα蛋白質(例如由GenBank登錄號NM_000418.3中所示的核酸編碼的人IL-4Rα蛋白質)至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％等同，或100％等同的IL-4Rα蛋白質。在其他實施例中，經修飾的IL-4Rα基因編碼包括胞外域的人源化IL-4Rα蛋白質，所述胞外域與人IL-4Rα蛋白質(例如由GenBank登錄號NM_000418.3中所示的核酸編碼的人IL-4Rα蛋白質)的胞外域至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％等同，或100％等同。在具體實施例中，人源化IL-4Rα蛋白質的跨膜和細胞質結構域與內源嚙齒類動物IL-4Rα蛋白質的跨膜和細胞質結構域等同。
具有在內源IL-4Rα基因座處的內源嚙齒類動物IL-4Rα基因整體或部分由人IL-4Rα核酸的替換的遺傳修飾的嚙齒類動物就替換而言可為純合或雜合的。在一些實施例中，遺傳修飾的嚙齒類動物就替換而言是雜合的，即內源嚙齒類動物IL-4Rα基因的兩個拷貝中僅一個已被替換為人IL-4Rα核酸。在其他實施例中，遺傳修飾的嚙齒類動物就替換而言是純合的，即內源嚙齒類動物IL-4Rα基因的兩個拷貝均已被替換為人IL-4Rα核酸。
本文公開的遺傳修飾的嚙齒類動物在免疫細胞例如B細胞和T細胞上表達人或人源化IL-4Rα蛋白質。在一些實施例中，遺傳修飾的嚙齒類動物不表達內源嚙齒類動物IL-4Rα蛋白質。在一個實施例中，表達人或人源化IL-4Rα蛋白質的嚙齒類動物的免疫細胞具有與在野生型嚙齒類動物(所述野生型嚙齒類動物表達功能內源IL-4Rα蛋白質，而不表達人或人源化IL-4Rα蛋白質)的免疫細胞上表達功能內源IL-4Rα蛋白質的嚙齒類動物在免疫細胞上大約相同水平的IL-4Rα蛋白質。在其他實施例中，嚙齒類動物在免疫細胞上表達量為年齡匹配的嚙齒類動物的免疫細胞上存在的IL-4Rα蛋白質的量的至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％的人或人源化IL-4Rα蛋白質，所述年齡匹配的嚙齒類動物表達功能內源IL-4Rα蛋白質，但不含內源IL-4Rα基因整體或部分由人IL-4Rα核酸的替換。
在一些實施例中，具有內源嚙齒類動物IL-4Rα基因整體或部分由人IL-4Rα核酸的替換且表達人或人源化IL-4Rα蛋白質的遺傳修飾的嚙齒類動物具有正常免疫系統(tǒng)，即表達人或人源化IL-4Rα蛋白質的嚙齒類動物的血液、血漿或血清中的免疫細胞例如B細胞和T細胞數目類似于野生型嚙齒類動物(例如表達功能內源IL-4Rα蛋白質，且不具有內源嚙齒類動物IL-4Rα基因整體或部分由人IL-4Rα核酸的替換的嚙齒類動物)的血液、血漿或血清中的免疫細胞例如B細胞和T細胞數目。
在一些實施例中，具有內源嚙齒類動物IL-4Rα基因整體或部分由人IL-4Rα核酸的替換且表達人或人源化IL-4Rα蛋白質的遺傳修飾的嚙齒類動物能夠介導IL-4依賴性信號傳導和IL-13依賴性信號傳導，并且在介導IL-4依賴性信號傳導和IL-13依賴性信號傳導中有功能。例如，在遺傳修飾的嚙齒類動物的免疫細胞上表達的具有人IL-4Rα蛋白質的胞外域的人源化IL-4Rα蛋白質與人IL-4相互作用，并且經由形成I型受體介導人IL-4依賴性信號傳導(參見圖1)。此類具有人IL-4Rα蛋白質的胞外域的人源化IL-4Rα蛋白質還與人和小鼠IL-13相互作用，并且經由形成II型受體介導IL-13依賴性信號傳導(參見圖1)。在遺傳修飾的嚙齒類動物中表達的人源化IL-4Rα蛋白質的功能性可在本領域已知的各種測定中進行評估，所述測定包括在下文實例中具體描述的那些，例如使用來源于遺傳修飾的嚙齒類動物的原代B細胞測量IL-4誘導的IgE類別轉換的測定。
在另外的實施例中，具有內源嚙齒類動物IL-4Rα基因整體或部分由人IL-4Rα核酸的替換且表達人或人源化IL-4Rα蛋白質的遺傳修飾的嚙齒類動物還包括在內源IL-4基因座處內源嚙齒類動物IL-4基因整體或部分由人IL-4核酸的替換，并且因此還表達人或人源化IL-4。
在一個進一步方面，本發(fā)明提供了雙重人源化嚙齒類動物例如小鼠或大鼠，其內源嚙齒類動物IL-4基因已在內源IL-4基因座處整體或部分被替換為人IL-4核酸，并且其內源嚙齒類動物IL-4Rα基因已在內源IL-4Rα基因座處整體或部分被替換為人IL-4Rα核酸。此類雙重人源化嚙齒類動物就每種人源化替換而言可為純合或雜合的。在一個具體實施例中，雙重人源化嚙齒類動物就人源化IL-4和人源化IL-4Rα兩者而言是純合的。
在雙重人源化嚙齒類動物中對內源嚙齒類動物IL-4基因的遺傳修飾包括上文對于遺傳修飾的嚙齒類動物描述的那些修飾或替換，所述遺傳修飾的嚙齒類動物具有內源嚙齒類動物IL-4基因整體或部分由人IL-4核酸的替換。類似地，在雙重人源化嚙齒類動物中對內源嚙齒類動物IL-4Rα基因的遺傳修飾包括上文對于遺傳修飾的嚙齒類動物描述的那些修飾或替換，所述遺傳修飾的嚙齒類動物具有內源嚙齒類動物IL-4Rα基因整體或部分由人IL-4Rα核酸的替換。因此，上文就嚙齒類動物IL-4基因的人源化而言和就嚙齒類動物基因的人源化而言分別公開的特征對于雙重人源化嚙齒類動物特別并入本文。
在具體實施例中，本發(fā)明提供了雙重人源化嚙齒類動物例如小鼠或大鼠，其表達人IL-4蛋白質和人源化IL-4Rα蛋白質，其中所述人源化IL-4Rα蛋白質包括人IL-4Rα蛋白質的胞外域，且包括嚙齒類動物的內源IL-4Rα蛋白質的跨膜和細胞質結構域。在特定實施例中，人IL-4蛋白質和人源化IL-4Rα蛋白質的表達分別處于在內源嚙齒類動物IL-4基因座和嚙齒類動物IL-4Rα基因座處的內源嚙齒類動物調節(jié)序列的控制下。
在一些實施例中，雙重人源化嚙齒類動物具有正常免疫系統(tǒng)(即免疫細胞的數目與野生型嚙齒類動物大約相同)具有在血清中大約相同水平的IL-4蛋白質，并且在免疫細胞上表達與野生型嚙齒類動物大約相同量的IL-4Rα蛋白質，野生型嚙齒類動物是表達功能內源IL-4蛋白質和IL-4Rα蛋白質且不表達人或人源化IL-4蛋白質或IL-4Rα蛋白質的嚙齒類動物。
在特定實施例中，雙重人源化嚙齒類動物顯示出功能IL-4信號傳導途徑。“功能IL-4信號傳導途徑”意指人或人源化IL-4蛋白質和人或人源化IL-4Rα蛋白質兩者在雙重人源化嚙齒類動物中表達，并且在雙重人源化嚙齒類動物中彼此相互作用，以便有效介導下游信號轉導且進行正常IL-4信號傳導途徑的生物活性。正常IL-4信號傳導途徑的生物活性在上文描述且在圖1中示出，包括通過I型受體介導的那些例如Th2分化的起始和維持、B細胞的活化和生長、類別轉換為IgE和IgG4，以及通過II型受體信號傳導介導的那些例如杯狀細胞增生、亞上皮纖維化和組織重塑。例如，在雙重人源化嚙齒類動物中的功能IL-4信號傳導途徑通過炎性表型反映，所述炎性表型的特征在于例如響應房塵螨攻擊在循環(huán)中增加的IgE、氣道炎癥和/或嗜酸性浸潤細胞，所述表型還在不含雙重人源化的野生型嚙齒類動物中觀察到。
制備遺傳修飾的非人動物的方法
遺傳修飾的非人動物例如嚙齒類動物可使用本領域已知的方法進行制備。例如，可制備含有側面為非人動物同源上游和下游區(qū)的人核酸(例如整體或部分的人IL-4或IL-4Rα基因)的靶向載體。靶向構建體還可含有位于人核酸3’的藥物選擇盒(例如隨后可通過瞬時Cre表達載體去除的兩側加有l(wèi)oxP位點的hygro選擇盒)。靶向載體可例如通過電穿孔引入非人動物細胞，例如胚胎干(ES)細胞(例如小鼠ES細胞)的基因組內。正確靶向的ES細胞克隆隨后可引入早期胚胎(例如8細胞期小鼠胚胎)內。完全來源于正確靶向的ES細胞的非人動物基于例如等位基因分析進行鑒定。對于其中合適的遺傳修飾的ES細胞無法容易獲得的非人動物，其他方法可用于制備包含如本文描述的遺傳修飾的非人動物。此類方法包括例如修飾非ES細胞基因組(例如成纖維細胞或誘導的多能細胞)且采用核轉移以將經修飾的基因組轉移至合適細胞例如卵母細胞，且在合適的條件下在非人動物中孕育經修飾的細胞(例如經修飾的卵母細胞)，以形成胚胎。
采用遺傳修飾的非人動物的方法
在一個方面，本文公開的遺傳修飾的IL-4和/或IL-4Rα非人動物用于評估人特異性IL-4和/或IL-4Rα拮抗劑，例如中和性抗IL-4和/或抗IL-4Rα抗體(例如dupilumab)在各種疾病模型中的藥效學(PD)和治療功效，如下文實例中進一步示出的。
在一些實施例中，本發(fā)明提供了使用本文公開的雙重人源化IL-4和IL-4Rα小鼠篩選人特異性IL-4或IL-4Rα拮抗劑的方法。
“IL-4或IL-4Rα拮抗劑”意指阻斷、壓制或抑制由IL-4或IL-4Rα介導的一種或多種生物學功能的分子(例如抗體)?！叭颂禺愋訧L-4或IL-4Rα拮抗劑”指對人IL-4或IL-4Rα特異性且基本上不作用于嚙齒類動物IL-4或IL-4Rα的拮抗劑。
在具體實施例中，篩選方法利用表達人IL-4蛋白質和人源化IL-4Rα蛋白質的雙重人源化小鼠，其中所述人源化IL-4Rα蛋白質包括與內源小鼠IL-4Rα蛋白質的跨膜和細胞質結構域連接的人IL-4Rα蛋白質的胞外域，并且其中所述小鼠不表達小鼠IL-4或小鼠IL-4Rα。
在一些實施例中，關于人特異性IL-4或IL-4Rα拮抗劑的篩選方法包括給如本文描述的對于IL-4和IL-4Rα雙重人源化的遺傳修飾的嚙齒類動物施用試劑，測定試劑對由IL-4/IL-4Rα信號傳導途徑介導的生物功能的作用，并且如果試劑在遺傳修飾的嚙齒類動物中拮抗由IL-4/IL-4Rα信號傳導途徑介導的功能，則將其鑒定為人特異性IL-4或IL-4Rα拮抗劑。
在一個實施例中，試劑包含結合IL-4或IL-4Rα的免疫球蛋白可變結構域。在一個實施例中，試劑特異性結合人IL-4或IL-4Rα，而不特異性結合嚙齒類動物IL-4或IL-4Rα。在一個實施例中，試劑是抗體。在一個具體實施例中，試劑是特異性結合人IL-4Rα而不特異性結合嚙齒類動物IL-4Rα的抗體。
在一個實施例中，篩選方法利用表達人IL-4蛋白質和人源化IL-4Rα蛋白質的雙重人源化小鼠，其中所述人源化IL-4Rα蛋白質包括與內源小鼠IL-4Rα蛋白質的跨膜和細胞質結構域連接的人IL-4Rα蛋白質的胞外域，并且其中所述小鼠不表達鼠IL-4或鼠IL-4Rα。
在一些實施例中，篩選方法包括下述步驟：在如本文描述的雙重人源化嚙齒類動物中誘導與IL-4/IL-4Rα信號傳導相關的疾病，給嚙齒類動物施用試劑，測定試劑是否改善疾病，并且如果試劑改善疾病，則將試劑鑒定為適合于治療疾病的人特異性IL-4或IL-4Rα拮抗劑。
“與IL-4/IL-4Rα信號傳導相關的疾病”意指其中牽涉由IL-4/IL-4Rα信號傳導介導的生物學功能的疾病。與IL-4/IL-4Rα信號傳導相關的疾病的例子包括例如炎性疾病或病癥，如哮喘、特應性皮炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)(其可至少部分起因于香煙煙霧)、炎性腸病、多發(fā)性硬化、關節(jié)炎、過敏性鼻炎、嗜酸細胞性食管炎和牛皮癬。哮喘可為嗜酸性或非嗜酸性哮喘和類固醇敏感性或類固醇抵抗性哮喘。
在一些實施例中，與IL-4/IL-4Rα信號傳導相關的疾病是氣道炎癥，其可通過以一個或多個劑量鼻內施用變應原(例如房塵螨提取物)一段時間在嚙齒類動物中進行誘導。試劑的作用可通過測量氣道炎癥的程度(通過例如粘液累積、支氣管肺泡灌洗液中的嗜酸性浸潤細胞、總循環(huán)IgE水平和/或可通過微陣列表達分析測量的表達譜中的改變反映)是否由于試劑施用而減少進行測定。用于誘導氣道炎癥的變應原和被測試的試劑可同時或在不同時間施用。在一些實施例中，變應原在一個或多個劑量中給予嚙齒類動物，并且被測試的試劑在變應原的至少一個劑量已給予嚙齒類動物后施用于嚙齒類動物。
在一些實施例中，與IL-4/IL-4Rα信號傳導相關的疾病是皮膚炎癥或特應性皮炎，其可通過制備皮膚損傷且使損傷的皮膚暴露于以一個或多個劑量的變應原(例如細菌毒素或房塵螨提取物)一段時間在嚙齒類動物中進行誘導。試劑的作用可通過測量皮膚炎癥是否由于試劑施用而減輕進行測定。
在一個進一步方面，三重人源化非人動物，即其IL-4、IL-4Rα和IL-33基因已人源化的非人動物，用于評估候選化合物例如人特異性IL-4和/或IL-4Rα拮抗劑和人特異性IL-33拮抗劑的藥效學(PD)和治療功效。
“IL-33拮抗劑”意指阻斷、壓制或抑制由IL-33介導的一種或多種生物學功能或信號傳導的分子(例如抗體)?！叭颂禺愋訧L-33拮抗劑”指對人IL-33特異性且基本上不作用于嚙齒類動物IL-33的拮抗劑。已知IL-33刺激通過ST2和IL-1RAcP的信號轉導，所述信號轉導在拮抗劑例如IL-33抗體的存在下減少。通過ST2和IL-1RAcP的IL-33信號轉導的抑制可通過在體外或體內測定中測定IL-33信號轉導進行測定，所述體外或體內測定例如美國公開申請2014/0271658A1中所述的那些，所述美國公開申請的完整內容以引用的方式并入本文。例如，測定例如美國公開申請2014/0271658A1中所述的那種可用于評價針對IL-33的抗體對變應原致敏動物中的肺炎癥的作用，所述變應原致敏動物對于人IL-33的表達是純合的。作為IL-33拮抗劑有效的IL-33抗體應證實朝向肺中的炎癥細胞減少的趨勢，以及朝向細胞因子例如IL-4和IL-5中的減少的趨勢。
在具體實施例中，三重人源化非人動物在本文中用于評估候選化合物，其中所述三重人源化動物是表達人IL-4蛋白質、人源化IL-4Rα蛋白質(其包括與小鼠IL-4Rα蛋白質的跨膜和細胞質結構域連接的人IL-4Rα蛋白質的胞外域)、以及人IL-33蛋白質的三重人源化小鼠，其中所述小鼠不表達小鼠IL-4、小鼠IL-4Rα或小鼠IL-33。
在一些實施例中，三重人源化非人動物用于評估候選化合物例如人特異性IL-4和/或IL-4Rα拮抗劑或人特異性IL-33拮抗劑的藥效學(PD)和治療功效。例如，人特異性IL-4抗體、人特異性IL-4Rα抗體和人特異性IL-33抗體可在三重人源化動物(例如嚙齒類動物，例如小鼠或大鼠)中個別進行測試，并且可評估且比較其PD譜和治療功效。
在其他實施例中，三重人源化非人動物用于評估與化合物個別使用時的功效相比較，化合物組合例如人特異性IL-4和/或IL-4Rα拮抗劑抗體與人特異性IL-33拮抗劑抗體的組合的功效，以測定例如化合物組合是否顯示出協同治療功效。在具體實施例中，人特異性IL-4抗體和人特異性IL-33抗體的組合在三重人源化非人動物中進行測試。在其他具體實施例中，人特異性IL-4Rα抗體和人特異性IL-33抗體的組合在三重人源化非人動物中進行測試。
為了評估候選化合物或化合物組合，與IL-4/IL-4Rα信號傳導和IL-33信號傳導相關的疾病可在三重人源化動物中進行誘導。與IL-4/IL-4Rα信號傳導和IL-33信號傳導相關的疾病的例子包括例如炎性疾病或病癥，如哮喘、特應性皮炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)(其可至少部分起因于香煙煙霧)、炎性腸病、多發(fā)性硬化、關節(jié)炎、過敏性鼻炎、嗜酸細胞性食管炎和牛皮癬。哮喘可為嗜酸性或非嗜酸性哮喘和類固醇敏感性或類固醇抵抗性哮喘?；衔锘蚧衔锝M合的效應可與如上所述的IL-4/IL-4Rα雙重人源化動物類似地進行評價。
本發(fā)明還通過下述非限制性實例進行舉例說明。
實例1
內源小鼠IL-4基因由人IL-4基因的替換
含有人IL-4基因的從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子4(包括3'非翻譯區(qū))的編碼部分和外顯子4下游的3'區(qū)域的一部分的8.8kb人IL-4基因替換跨越從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子4(包括3'非翻譯區(qū))的編碼部分和外顯子4下游的3'區(qū)域的一部分的6.3kb鼠IL-4基因基因座。參見圖2A。
使用基因工程技術(參見Valenzuela等人(2003)High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis,Nature Biotech,21(6):652-659)，在單個靶向步驟中構建用于將小鼠替換為人IL-4基因的靶向構建體。小鼠和人IL-4DNA分別得自細菌人工染色體(BAC)克隆bMQ-41A12和RP11-17K19。簡言之，通過缺口修復克隆生成的SbfI線性化靶向構建體被電穿孔到F1H4小鼠胚胎干(ES)細胞(C57BL/6x129 F1雜種)內，所述SbfI線性化靶向構建體含有小鼠IL-4上游和下游同源臂和兩側加有l(wèi)oxP位點的hygro選擇盒，所述小鼠IL-4上游和下游同源臂在從外顯子1中的ATG密碼子延伸到外顯子4(包括3'非翻譯區(qū))和外顯子4下游的3'區(qū)域的一部分的8.8kb人IL-4序列(基因組坐標：GRCh37:chr5:132,009,743-132,018,576(+鏈))側面。正確靶向的ES細胞(MAID 879)還用瞬時Cre表達載體進行電穿孔，以去除藥物選擇盒。不含藥物盒的靶向ES細胞克隆(MAID 1553)通過方法(參見美國專利號7,294,754、7,576,259、7,659,442，以及Poueymirou等人(2007)F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses,Nature Biotech.25(1):91-99)引入8細胞期SW小鼠胚胎內。使用等位基因測定(參見Valenzuela等人(2003))的修飾，通過就小鼠等位基因的喪失和人等位基因的獲得進行基因分型，來鑒定荷有人源化IL-4基因的(完全來源于供體ES細胞的F0小鼠)。
正確靶向的ES細胞克隆通過天然等位基因喪失(LONA)測定(Valenzuela等人2003)進行鑒定，其中通過對于靶向用于缺失的小鼠IL-4基因中的序列特異性的兩種TaqManTM定量聚合酶鏈反應(qPCR)，來測定天然、未經修飾的IL-4基因的拷貝數。qPCR測定包括下述引物-探針組(從5'到3'書寫)：上游正向引物，CATGCACGGA GATGGATGTG(SEQ ID NO:1)；上游反向引物，GACCCCTCAG GTCCACTTAC C(SEQ ID NO:2)；上游探針，FAM-AACGTCCTCA CAGCAACGA-MGB(SEQ ID NO:3)；下游正向引物，GTGCCCAGGT GTGCTCATG(SEQ ID NO:4)；下游反向引物，CGCCTGCCTC CTCACTTTAT C(SEQ ID NO:5)；下游探針，FAM-ATCTGCTTCA CCATCCACT-MGB(SEQ ID NO:6)；其中FAM指5'羧基熒光素熒光探針，并且BHQ指黑洞淬滅型熒光淬滅劑(Biosearch Technologies)。根據制造商的建議，由已吸收靶向載體且摻入其基因組內的ES細胞克隆純化的DNA與TaqManTM Gene Expression Master Mix(Life Technologies)在384孔PCR板(MicroAmpTM Optical 384-Well Reaction Plate,Life Technologies)中組合，并且在Applied Biosystems Prism 7900HT中循環(huán)，所述Applied Biosystems Prism 7900HT收集在PCR過程期間的熒光數據，且測定閾值循環(huán)(Ct)，即累積的熒光在其下達到預置閾值的分數PCR循環(huán)。對于每種DNA樣品運行上游和下游IL-4特異性qPCR以及關于非靶向參考基因的兩種qPCR。計算在每種IL-4特異性qPCR和每種參考基因qPCR之間的Ct值中的差異(ΔCt)，并且隨后計算對于測定的所有樣品在每個ΔCt和中值ΔCt之間的差異，以獲得關于每種樣品的ΔΔCt值。由下式計算每種樣品中的IL-4基因的拷貝數：拷貝數＝2×2-ΔΔCt。已喪失其天然拷貝之一的正確靶向的克隆具有等于一的IL-4基因拷貝數。在人源化等位基因中人IL-4基因序列替換缺失的小鼠IL-4基因序列的證實通過TaqManTM qPCR測定加以證實，所述TaqManTM qPCR測定包括下述引物-探針組(從5'到3'書寫)：人正向引物，GCCTGGACCA AGACTCTGT(SEQ ID NO:7)；人反向引物，ACCGTGGGAC GGCTTCTTAC(SEQ ID NO:8)；人上游探針，FAM-CACCGAGTTG ACCGTAACAG ACATC-BHQ(SEQ ID NO:9)。hygro選擇盒與人IL-4基因序列一起插入人源化等位基因的證實通過TaqManTM qPCR測定加以證實，所述TaqManTM qPCR測定包括下述引物-探針組(從5'到3'書寫)：hygro正向引物，TGCGGCCGAT CTTAGCC(SEQ ID NO:10)；hygro反向引物，TTGACCGATT CCTTGCGG(SEQ ID NO:11)；hygro探針，FAM-ACGAGCGGGT TCGGCCCATT C-BHQ(SEQ ID NO:12)。
相同LONA測定用于測定由來源于靶向ES細胞的小鼠的尾部活組織檢查純化的DNA，以測定其IL-4基因型且證實人源化IL-4等位基因已通過種系傳遞。進行對于替換雜合的兩只幼鼠的育種，以生成對于內源小鼠IL-4基因被人IL-4基因的替換純合的小鼠。對于替換純合的幼鼠用于表型分型。
鼠IL-4基因座和含有人IL-4基因的序列的上游連接設計為在
內，其中人IL-4序列是斜體的，并且IL-4編碼序列是圓括號內的。含有人IL-4基因的序列和兩側加有l(wèi)oxP位點的hygro選擇盒的下游連接設計為在
內，其中人IL-4序列是斜體的，并且IL-4編碼序列是圓括號內的。兩側加有l(wèi)oxP位點的hygro選擇盒的序列和鼠IL-4基因座的下游連接設計為在
內，其中hygro盒序列是斜體的。
實例2
內源小鼠IL-4Rα胞外域基因序列由人IL-4Rα胞外域基因序列的替換
含有人IL-4Rα基因的從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子5和內含子5的一部分的15.6kb人IL-4Rα基因替換跨越從ATG起始密碼子開始的外顯子1到外顯子5和內含子5的一部分的7.1kb鼠IL-4Rα基因基因座。小鼠外顯子6到9被保留；僅外顯子1到5(即胞外域)是人源化的。參見圖2B。
使用基因工程技術(參見Valenzuela等人(2003)High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis,Nature Biotech,21(6):652-659)，在單個靶向步驟中構建用于將小鼠替換為人IL-4Rα基因的靶向構建體。小鼠和人IL-4RαDNA分別得自細菌人工染色體(BAC)克隆RP23-136G14和RP11-166E24。簡言之，通過缺口修復克隆生成的NotI線性化靶向構建體被電穿孔到F1H4小鼠胚胎干(ES)細胞(C57BL/6x129 F1雜種)內，所述NotI線性化靶向構建體含有小鼠IL-4Rα基因上游和下游同源臂和兩側加有l(wèi)oxP位點的neo選擇盒，所述小鼠IL-4Rα基因上游和下游同源臂在從外顯子1中的ATG密碼子延伸到外顯子5和內含子5的一部分的15.6kb人IL-4Rα序列(基因組坐標：GRCh37:chr16:27,351,525-27,367,111(+鏈))側面。正確靶向的ES細胞(MAID 803)還用瞬時Cre表達載體進行電穿孔，以去除藥物選擇盒。不含藥物盒的靶向ES細胞克隆(MAID 1444)通過方法(參見美國專利號7,294,754、7,576,259、7,659,442，以及Poueymirou等人(2007)F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses,Nature Biotech.25(1):91-99)引入8細胞期SW小鼠胚胎內。使用等位基因測定(參見Valenzuela等人(2003))的修飾，通過就小鼠等位基因的喪失和人等位基因的獲得進行基因分型，來鑒定荷有人源化IL-4Rα基因的(完全來源于供體ES細胞的F0小鼠)。
正確靶向的ES細胞克隆通過天然等位基因喪失(LONA)測定(Valenzuela等人2003)進行鑒定，其中通過對于靶向用于缺失的小鼠IL-4Rα基因中的序列特異性的兩種TaqManTM定量聚合酶鏈反應(qPCR)，來測定天然、未經修飾的IL-4Rα基因的拷貝數。qPCR測定包括下述引物-探針組(從5'到3'書寫)：上游正向引物，CCGCTGGCAT GTGTATTGTG(SEQ ID NO:16)；上游反向引物，TGAGTGTGGG ACCCTCAAGA G(SEQ ID NO:17)；上游探針，FAM-TGACCCAAGC CCTACATGGC CACT-BHQ(SEQ ID NO:18)；下游正向引物，TGAGGAGAGC TCACGGGAAT C(SEQ ID NO:19)；下游反向引物，ACCCATCTCC TGCGTTTCTG(SEQ ID NO:20)；下游探針，FAM-TTGACACGCC AGCTACACTG CTCCA-BHQ(SEQ ID NO:21)；其中FAM指5'羧基熒光素熒光探針，并且BHQ指黑洞淬滅型熒光淬滅劑(Biosearch Technologies)。根據制造商的建議，由已吸收靶向載體且摻入其基因組內的ES細胞克隆純化的DNA與TaqManTM Gene Expression Master Mix(Life Technologies)在384孔PCR板(MicroAmpTM Optical 384-Well Reaction Plate,Life Technologies)中組合，并且在Applied Biosystems Prism 7900HT中循環(huán)，所述Applied Biosystems Prism 7900HT收集在PCR過程期間的熒光數據，且測定閾值循環(huán)(Ct)，即累積的熒光在其下達到預置閾值的分數PCR循環(huán)。對于每種DNA樣品運行上游和下游IL-4Rα特異性qPCR以及關于非靶向參考基因的兩種qPCR。計算在每種IL-4Rα特異性qPCR和每種參考基因qPCR之間的Ct值中的差異(ΔCt)，并且隨后計算對于測定的所有樣品在每個ΔCt和中值ΔCt之間的差異，以獲得關于每種樣品的ΔΔCt值。由下式計算每種樣品中的IL-4Rα基因的拷貝數：拷貝數＝2×2-ΔΔCt。已喪失其天然拷貝之一的正確靶向的克隆具有等于一的IL-4Rα基因拷貝數。在人源化等位基因中人IL-4Rα基因序列替換缺失的小鼠IL-4Rα基因序列的證實通過TaqManTM qPCR測定加以證實，所述TaqManTMqPCR測定包括下述引物-探針組(從5'到3'書寫)：人正向引物，ACCTGCGTCT CCGACTACAT G(SEQ ID NO:22)；人反向引物，GAGCTCGGTG CTGCAATTG(SEQ ID NO:23)；人探針，FAM-TGGGACCATT CATCTTCCAC TCGCA-BHQ(SEQ ID NO:24)。neo選擇盒與人IL-4Rα基因序列一起插入人源化等位基因的證實通過TaqManTM qPCR測定加以證實，所述TaqManTM qPCR測定包括下述引物-探針組(從5'到3'書寫)：neo正向引物，GGTGGAGAGG CTATTCGGC(SEQ ID NO:25)；neo反向引物，GAACACGGCG GCATCAG(SEQ ID NO:26)；neo探針，FAM-TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG-BHQ(SEQ ID NO:27)。
相同LONA測定用于測定由來源于靶向ES細胞的小鼠的尾部活組織檢查純化的DNA，以測定其IL-4Rα基因型且證實人源化IL-4Rα等位基因已通過種系傳遞。進行對于替換雜合的兩只幼鼠的育種，以生成對于內源小鼠IL-4Rα基因被人IL-4Rα基因的替換純合的小鼠。對于替換純合的幼鼠用于表型分型。
鼠IL-4Rα基因座和含有人IL-4Rα基因的序列的上游連接設計為在
內，其中人IL-4Rα序列是斜體的，并且IL-4Rα編碼序列是有下劃線的。含有人IL-4Rα基因的序列和兩側加有l(wèi)oxP位點的neo選擇盒的下游連接設計為在
內，其中人IL-4Rα序列是斜體的，并且盒序列是小寫字母。兩側加有l(wèi)oxP位點的neo選擇盒的序列和鼠IL-4Rα基因座的下游連接設計為在
內，其中小鼠IL-4Rα編碼序列是圓括號內的，并且neo盒序列是小寫字母。
實例3
雙重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠的生成
如下生成雙重人源化IL-4/IL-4Ra(Il4hu/hu/Il4rahu/hu)小鼠。包括人源化IL-4Rα基因和兩側加有l(wèi)oxP位點的neo盒的ES細胞克隆MAID 803用Cre表達載體進行電穿孔，以去除兩側加有l(wèi)oxP位點的neo盒，以生成包括人源化IL-4Rα基因不含藥物選擇盒的ES細胞克隆MAID 1444(參見實例2)。用于生成包括人源化IL-4基因和兩側加有l(wèi)oxP位點的hygro盒(參見實例1)的ES細胞克隆MAID 879的相同靶向構建體被電穿孔到ES細胞克隆MAID 1444內，以生成879Het/1444Het(Il4+/hu/Il4ra+/hu)ES細胞，所述細胞隨后用Cre表達載體進行電穿孔，以去除兩側加有l(wèi)oxP位點的hygro盒，以生成包括人源化IL-4和IL-4Rα基因的ES細胞克隆(MAID 1553/1444)。將不含藥物盒的ES細胞克隆MAID 1553/1444引入8細胞期SW小鼠胚胎內，以生成雙重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠。
實例4
Dupilumab，全人IL-4RαmAb在具有人IL-4和IL4Rα基因替換的小鼠中的功效評估
方法
使用技術制備基因工程小鼠，以用8.8kb人IL-4基因組序列(參見實例1和圖2A)替換小鼠全長IL-4基因座和用相應的人IL-4Rα基因組DNA的15.6kb片段替換小鼠IL-4Rα(CD124)基因的細胞外結構域(即胞外域)(參見實例2和圖2B)。
具有純合人源化IL-4Rα基因的小鼠就人基因的表達和功能加以驗證。為了測定通過人源化小鼠的人IL-4Rα表達，收集來自野生型和人源化小鼠的脾細胞且加工用于熒光激活細胞分選(FACS)分析，使用針對小鼠CD3、小鼠CD19、人CD124和小鼠CD124的熒光標記的抗體。(參見例如Blaeser等人(2003)Targeted inactivation of the IL-4 receptor a chain I4R motif promotes allergic airway inflammation,J Exp Med 198(8):1189-1200)。
為了證實配體特異性和受體功能性，使用來源于人源化IL-4Rα小鼠的原代細胞。使用在DMEM中的來自野生型和人源化IL-4Rα小鼠的股骨骨髓細胞培養(yǎng)骨髓衍生的巨噬細胞共7天，所述DMEM含有10％胎牛血清加上20％L細胞條件化培養(yǎng)基。
細胞隨后用20ng/ml在培養(yǎng)基中稀釋的小鼠IL-4、小鼠IL-13、人IL-4、人IL-13或媒介物個別處理20小時。收獲來自每種條件的一式四份樣品用于基因表達分析。
提取來自這些樣品的總RNA且通過摻入Cy3-CTP擴增成cRNA。來自每種樣品的Cy3標記的cRNA隨后與由覆蓋小鼠轉錄組的43,538種60聚體寡核苷酸組成的定制Agilent陣列雜交。使用Agilent Feature Extraction Software 9.5從掃描陣列圖像中提取數據。
使用斯氏t檢驗鑒定在實驗組之間差異表達的基因((p<0.05，倍數變化≥1.5)。使用來自GeneSpring GX7.3的皮爾遜相關聚類算法生成這些基因的表達簇。
使用體外IgE類別轉換測定連同從人源化IL-4Rα(Il4rahu/hu)小鼠中分離的原代B細胞，評估dupilumab針對IL-4的中和效應。
野生型(WT)和人源化IL-4Rα(Il4rahu/hu)小鼠接受高體積(水動力)驅動的裸露質粒DNA溶液的基因遞送，用于在體內表達小鼠IL-25。(參見例如Liu等人(1999)Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA,Gene Therapy 6:1258-1266.)。8天后收集外周血，以使用商業(yè)ELISA試劑盒(R&D systems,MN)測量血清鼠IgE(mIgE)水平。
來自人源化小鼠脾細胞的純化的原代B細胞用細菌LPS活化，且在7天培養(yǎng)物中與漸增量的重組人IL-4混合，以誘導免疫球蛋白類別轉換。對于抗體阻斷實驗，在加入0.167nM重組人IL-4之前，使純化的B細胞與漸增劑量的dupilumab一起溫育30分鐘，且培養(yǎng)7天。在不存在IL-4的情況下或連同同種型對照mAb的IgE生產分別以(◇)和(△)顯示。使用商業(yè)ELISA試劑盒測量培養(yǎng)上清液中的鼠IgE水平。(參見例如Moon等人(1989)Regulation of IgG1 and IgE synthesis by interleukin 4 in mouse B cells,Scand I Immunol 30:355-361.)。
白細胞介素-25(IL-25)是通過Th2細胞產生的細胞因子，所述Th2細胞的主要活性通過IL-4和IL-13的產生進行介導，以誘導組織特異性病理學，例如增加的肺粘液產生和杯狀細胞增生。(參見Fort等人(2001)IL-25 induces IL-4,IL-5,and IL-13 and Th2-associated pathologies in vivo,Immunity 15(6):985-995.)。
IL-13的缺乏使動物免于IL-25誘導的靶器官中的病理學。因此，IL-25驅動的肺炎癥模型用于評價dupilumab在包括人源化IL-4和/或IL-4Rα基因的小鼠體內的藥效學(PD)特性。
使用IL-25誘導的炎癥方法，通過測量人源化IL-4Rα(Il4rahu/hu)小鼠中的肺粘液累積，來表征dupilumab對II型受體的PD應答。
在第0天時，WT和人源化IL-4Rα(Il4rahu/hu)小鼠接受小鼠IL-25表達載體的水動力遞送，且隨后為以所示劑量的dupilumab或同種型對照mAb的注射。每隔一天施用抗體的另外劑量，總共4個劑量。在第8天時，從被安樂死的小鼠中收集肺組織，并且通過過碘酸希夫染色經加工的肺切片，然后就病理變化進行不知情評分。
結果
人源化IL-4Rα小鼠表征為顯示：(a)在來自雙重人源化IL-4/IL-4Rα(Il4hu/hu/Il4rahu/hu)小鼠的原代細胞上的人IL-4Rα的表達(參見圖3)；(b)在人源化IL-4Rα(Il4rahu/hu)小鼠中的IL-4配體特異性的變化(參見圖4)；和(c)在人源化IL-4Rα(Il4rahu/hu)小鼠中的IL-13途徑的功能性(參見圖4)。
如圖3中所示，其中顯示了在門控的B細胞和T細胞群體上的IL-4Rα(CD124)的標記譜，并且在陰影區(qū)域中顯示了相應的未染色細胞群體的分布，野生型和人源化IL-4Rα(Il4rahu/hu)小鼠在B(CD19+,CD3-)和T(CD19-,CD3+)細胞的表面上表達相似量的IL-4Rα蛋白質。
如圖4(左側)中所示，野生型(Il4ra+/+)小鼠響應小鼠IL-4而不響應人IL-4，并且響應小鼠和人IL-13兩者。如圖4(右側)中所示，人源化IL-4Rα(Il4rahu/hu)小鼠響應人IL-4而不響應小鼠IL-4，并且響應小鼠和人IL-13兩者。
該數據顯示IL-4而不是IL-13在野生型和人源化IL-4Rα(Il4rahu/hu)小鼠展示物種特異性。
如圖5中所示，IL-4作為介導IgE類別轉換的主要因素的作用通過在人源化IL-4Rα(Il4rahu/hu)小鼠中的小鼠IL-25基因遞送后缺乏升高水平的循環(huán)IgE得到支持。
dupilumab單克隆抗體在體外和體內進行調查。
如圖6中所示，dupilumab阻止人源化IL-4Rα(Il4rahu/hu)小鼠衍生的原代B細胞培養(yǎng)物中的人IL-4誘導的IgE生產。
如圖7中所示，dupilumab在10mg/kg及以上時劑量依賴性減少IL-25誘導的肺病理學(25mg/kg減少粘液病理學)。
結論
結果證實dupilumab，全人抗人IL-4Rα單克隆抗體，在具有細胞因子誘導的炎癥的遺傳修飾的小鼠模型中的藥理學活性。
具有人IL-4和/或IL-4Rα基因替換的遺傳修飾的小鼠的生成提供了評估基因直向同源物的功能和具有有限交叉物種反應性的抗體候選物的體內功效的有力工具。
實例5
房塵螨提取物(HDM)誘導的肺炎癥模型
在雙重人源化IL-4和IL-R4α小鼠中的慢性氣道炎癥通過房塵螨(HDM)提取物(Greer laboratories)的鼻內攻擊進行誘導。簡言之，小鼠首先通過HDM懸浮液(以2.5μg/ml的濃度20μl)的鼻內滴注致敏10天。在兩周消退間隔后，在第5至12周之間，小鼠用鼻內HDM應用再攻擊3次/周。dupilumab(抗IL-4Rα抗體)治療以每周兩次的頻率通過皮下注射從第7周開始，直至在第12周時實驗結束時。收集組織樣品用于進一步分析。實驗設計在圖8中描述。
使用雙重人源化IL-4和IL-4Rα小鼠證實dupilumab在HDM誘導的氣道炎癥模型中的治療功效
使用上述方案在雙重人源化IL-4和IL-4Rα(IL-4hu/hu/IL-4Rhu/hu)小鼠中誘導氣道疾病。肺組織的組織學分析顯示鼻內HDM滴注引起氣道中增加的粘液產生。dupilumab治療減少HDM攻擊的小鼠中的粘液累積。支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的浸潤細胞分析指示嗜酸性粒細胞計數通過HDM滴注增加，并且通過dupilumab治療減少。總循環(huán)IgE通過人源化小鼠中的HDM治療得到升高，提示有能力的IL-4信號傳導途徑。dupilumab的使用能夠減少IgE的水平。相比之下，僅拮抗IL-13而不干擾IL-4信號轉導的比較物分子IL13R2α-Fc在減少粘液累積和阻止嗜酸性粒細胞浸潤中具有可比較的活性。然而，在dupilumab和IL-13拮抗劑IL13R2α-Fc之間的循環(huán)IgE水平中檢測到差異效應。IL-13途徑單獨的阻斷不足以減少HDM誘導的IgE水平；而dupilumab通過阻斷IL-4和IL-13途徑兩者減輕變態(tài)反應的主要致病性介質IgE的生產。
在一組分開的實驗中，使用上述相同方案在雙重人源化IL-4和IL-4Rα(IL-4hu/hu/IL-4Rhu/hu)小鼠中誘導氣道疾病，除了使用不同對照之外。與dupilumab為相同IgG同種型的同種型對照抗體用于這些實驗中。實驗設計在圖9中描述。使用Dynabeads mRNA試劑盒(Life Tech)從總RNA中純化mRNA，并且使用Scriptseq RNA Library Prep試劑盒(Illumina)由mRNA制備鏈特異性RNA-Seq文庫。使用HiSeq 2000(Illumina)以33bp的讀數長度進行文庫測序，并且使用Clcbio(Qiagen)RNA-Seq工作流，從原始讀數中提取基因表達水平。使用斯氏t檢驗鑒定在實驗組之間差異表達的基因(p<0.05，倍數變化≥1.5)。使用來自GeneSpring GX7.3的皮爾遜相關聚類算法生成這些基因的表達簇。發(fā)現HDM誘導雙重人源化IL-4和IL-4Rα小鼠中的肺基因表達的改變，并且此類改變被dupilumab阻斷。在治療期結束時從被安樂死的小鼠中收集血清樣品。使用商業(yè)ELISA試劑盒(R&D systems)測量血清鼠IgE水平。使用普通的單向ANOVA方法執(zhí)行統(tǒng)計分析。
實例6
抗原誘導的皮膚炎癥模型
雙重人源化Il-4和Il-4Rα小鼠中的慢性皮膚炎癥可通過下述程序進行誘導。用電動剪刀剃掉人源化小鼠的背部毛發(fā)，并且隨后用膠帶剝離以制備微小損傷且破壞皮膚屏障。用變應原(例如卵白蛋白加上細菌毒素或房塵螨提取物)溶液浸泡的紗布貼片附著至皮膚共一周，隨后為兩周消退期。將該程序重復三次總7周，以誘導特應性皮炎樣皮膚病損。經處理的小鼠具有增加的IgE水平、瘙癢、表皮增厚、特應性皮炎的典型癥狀。
實例7
表征抗人IL-4Rα抗體在表達人源化IL-4Rα的小鼠中的PK譜
該實例描述為評估REGN 668(針對人IL-4Rα的人單克隆抗體，也稱為“dupilumab”)和對照抗體REGN646(猴子替代物，抗mfIL-4R非結合對照抗體)的PK譜而進行的實驗。
在這些實驗中使用的小鼠是20-23周的MAID 1444(對于人源化IL-4Rα純合的或“IL-4RαHumIn”，其中IL-4Rα胞外域是人的，并且跨膜和細胞質區(qū)是小鼠的)和品系匹配的(75％C57BL/6/25％129Sv)野生型(“WT”)小鼠。研究組包括總共40只小鼠，雄性和雌性，具有5只純合和5只品系匹配WT的群組大小/藥物//劑量。抗體(在PBS緩沖液中)經由皮下注射以10mg/kg給予小鼠。分別在注射當天(時間點“0”或第0天)、在注射后6小時以及在第1天、第3天、第7天、第10天、第14天、第21天和第30天時，獲得血樣用于分析。
循環(huán)藥物(即REGN668或REGN646)水平通過總人抗體分析使用ELISA免疫測定進行測定。簡言之，將山羊抗人IgG多克隆抗體(Jackson ImmunoResearch,#109-005-098)涂布到96孔板上，以捕獲血清中的測試的人抗體，并且隨后使用與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗人IgG多克隆抗體(Jackson ImmunoResearch,#109-035-098)和TMB底物(BD Pharmingen)，檢測板結合的抗體。血清樣品在范圍為1:100-1:243,000的六劑量系列稀釋/樣品中，并且分別抗體的參考標準在12劑量系列稀釋中。基于使用Graphpad Prism軟件生成的參考標準曲線計算血清中的藥物抗體濃度。
發(fā)現與僅具有小鼠IL-4Rα蛋白質的野生型小鼠相比較，REGN 668的半衰期在IL-4RαHumIn小鼠中縮短。PK譜中的這種差異可通過在單克隆抗體和人IL-4α受體之間的靶介導的相互作用和清除加以解釋。因此，表達人或人源化IL-4Rα的小鼠提供了合適模擬，以在臨床前小鼠模型中表征抗人IL-4Rα抗體(例如dupilumab)的PK特性。
人源化IL-4和/或IL-4Rα小鼠的用途
人源化IL-4和/或IL-4Rα可用于評估人特異性IL-4和/或IL-4Rα拮抗劑例如中和性抗IL-4和/或抗IL-4Rα抗體例如dupilumab的藥效學(PD)。
根據本領域已知的標準程序，執(zhí)行在人源化IL-4和/或IL-4Rα小鼠中的藥代動力學(PK)和PD測定。
人源化IL-4和/或IL-4Rα小鼠可用于測試人特異性IL-4和/或IL-4Rα拮抗劑例如中和性抗IL-4和/或IL-4Rα抗體例如dupilumab在例如如上文所示的本領域已知的各種疾病模型中的體內治療功效。
實例8
內源小鼠IL-33基因由人IL-33基因的替換
小鼠IL-33基因(NCBI基因ID：77125，主要源：MGI:1924375；RefSeq轉錄物：NM_001164724.1；UniProt ID：Q8BVZ5；基因組裝配：NCBI37/mm9；位置：chr19:29,999,604-30,035,205+鏈)具有8個外顯子，且編碼266個氨基酸的蛋白質(GenBank登錄號NP_001158196.1)。
人IL-33基因(NCBI基因ID：90865，主要源：HGNC:16028；RefSeq轉錄物：NM_033439.3；UniProt ID：O95760；基因組裝配：GRCh37/hg19；位置：chr9:6,215,149-6,257,983+鏈)也具有8個外顯子，且編碼270個氨基酸的蛋白質(GenBank登錄號NP_254274.1)。
含有人IL-33基因的從ATG起始密碼子開始的外顯子2到外顯子8(包括3'非翻譯區(qū))的16333bp人基因組區(qū)段替換跨越從ATG起始密碼子開始的外顯子2到外顯子8的編碼部分包括終止密碼子的9381bp小鼠IL-33基因。參見圖10A。
使用基因工程技術(參見Valenzuela等人(2003)High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis,Nature Biotech,21(6):652-659))，在單個靶向步驟中構建關于用人IL-33基因組片段替換小鼠IL-33基因的靶向構建體，類似于上文實例1中描述的關于用人IL-4基因組區(qū)段替換小鼠IL-4基因的程序，除了小鼠和人IL-33 DNA分別得自細菌人工染色體(BAC)克隆bMQ-350I18和CTD-3015M15之外，以及除了靶向載體含有l(wèi)oxP新霉素選擇盒之外(圖10B)。
正確靶向的ES細胞克隆(MAID 7060)通過天然等位基因喪失(LONA)測定(Valenzuela等人2003)進行鑒定，其中通過對于靶向用于缺失的小鼠IL-33基因中的序列特異性的兩種TaqManTM定量聚合酶鏈反應(qPCR)，來測定天然、未經修飾的IL-33基因的拷貝數。qPCR測定包括下述引物-探針組(從5'到3'書寫)：
上游("mTU")：
正向引物，TTGGACTAGTAACAAGAAGGGTAGCA(SEQ ID NO:31)；
反向引物，CCTTTCCCATCACCCTCTAACTT(SEQ ID NO:32)；
探針(MGB)，AGCTCTGGTGGACAGA(SEQ ID NO:33)；
下游("mTD")：
正向引物，TCTCTGCCAAGCTGCTTATCC(SEQ ID NO:34)；
反向引物，GGCTGCATGGAAGAGGTGAA(SEQ ID NO:35)；
探針(MGB)，CTCTCCACAAATCG(SEQ ID NO:36)。
在人源化等位基因中人IL-33基因序列替換小鼠IL-33基因序列的證實通過TaqManTM qPCR測定加以證實，所述TaqManTM qPCR測定包括下述引物-探針組(從5'到3'書寫)：
上游("hTU")
正向引物，CAGGCAGGAATAGCTGAGATAATCT(SEQ ID NO:37)；
反向引物，TGTGGAGCAAAAAGTGGTTGAT(SEQ ID NO:38)；
探針(MGB)，CCTGTGAATAGTGATAAAC(SEQ ID NO:39)；
下游("hTD")：
正向引物，CAGTTCCAAACGATAGGCTCAA(SEQ ID NO:40)；
反向引物，ATAATTCTGTGAAGCATCTGGTCTTC(SEQ ID NO:41)；
探針(MGB)，CTAGAGCTGCTAGTAAAA(SEQ ID NO:42)。
鼠IL-33基因座和含有人IL-33基因的序列的上游連接(在圖10B中顯示為"I")設計為在5’-ATAGCCAAGG TTGCTTCTGA TGACTTCAGG TCCATATAGT TGGATTAATG TTATATTTCA ATCCCACAGA AACCTGAAAA-3'(SEQ ID NO:43)內，其中人IL-33序列是斜體的，并且人起始密碼子ATG是有下劃線的。含有人IL-33基因組序列的序列和loxP新霉素選擇盒的下游連接(在圖10B中顯示為"II")設計為在5’-/CTCGAGATAA CTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT ATGCATGGCC TCCGCGCCGG GTTTTGGCGC CTCCCGCGGG-3'(SEQ ID NO:44)內，其中人IL-33序列是斜體的，并且連接由"/"符號指示，并且lox P位點是有下劃線的。loxP neo選擇盒的序列和鼠IL-33基因座的下游連接(在圖10C中顯示為"III")設計為在內，其中連接通過"/"符號顯示，并且loxP位點是有下劃線的。
正確靶向的ES細胞(MAID 7060)還用瞬時Cre表達載體進行電穿孔，以去除藥物選擇盒且獲得不含藥物盒的ES細胞克隆(MAID 7061)。這些MAID 7061 ES細胞中的上游連接(在圖18C中顯示為"I")與MAID 7060 ES細胞中相同。下游連接(在圖18C中顯示為"II")設計為在5’-TTTATATTAT TGAATAAAGT/CTCGAGATAA CTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTATGCTAGTAACT ATAACGGTCC TAAGGTAGCG AGCTAGC/-3'(SEQ ID NO:46)內，其中3'人IL-33序列是第一個"/"符號之前斜體的，并且小鼠IL-33 3'序列是第二個"/"符號之后斜體的，并且loxP位點是有下劃線的。
正確靶向的ES細胞(MAID 7060或MAID 7061)通過方法(參見美國專利號7,294,754、7,576,259、7,659,442，以及Poueymirou等人(2007)F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses,Nature Biotech.25(1):91-99)引入8細胞期SW小鼠胚胎內。使用等位基因測定(參見Valenzuela等人(2003))的修飾，通過就小鼠等位基因的喪失和人等位基因的獲得進行基因分型，來鑒定荷有人源化IL-33基因的(完全來源于供體ES細胞的F0小鼠)。相同LONA測定用于測定由來源于靶向ES細胞的小鼠的尾部活組織檢查純化的DNA，以測定其IL-33基因型且證實人源化IL-33等位基因已通過種系傳遞。進行對于替換雜合的兩只幼鼠的育種，以生成對于內源小鼠IL-33基因被人IL-33基因的替換純合的小鼠。
序列表
<110> Wang, Li-Hsien
Xue, Yingzi
Murphy, Andrew J.
Stevens, Sean
<120> 人源化IL-4和IL-4Ra動物
<130> 31260 (T0029)
<150> 61/989,757
<151> 2014-05-07
<160> 46
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1
catgcacgga gatggatgtg 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 2
gacccctcag gtccacttac c 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用FAM（5-羧基熒光素熒光探針）進行標記
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 用BHQ（黑洞淬滅型熒光淬滅劑）進行標記
<400> 3
aacgtcctca cagcaacga 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 4
gtgcccaggt gtgctcatg 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 5
cgcctgcctc ctcactttat c 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用FAM（5-羧基熒光素熒光探針）進行標記
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> 用BHQ（黑洞淬滅型熒光淬滅劑）進行標記
<400> 6
atctgcttca ccatccact 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 7
gcctggacca agactctgt 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 8
accgtgggac ggcttcttac 20
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用FAM（5-羧基熒光素熒光探針）進行標記
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> 用BHQ（黑洞淬滅型熒光淬滅劑）進行標記
<400> 9
caccgagttg accgtaacag acatc 25
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 10
tgcggccgat cttagcc 17
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 11
ttgaccgatt ccttgcgg 18
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用FAM（5-羧基熒光素熒光探針）進行標記
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 用BHQ（黑洞淬滅型熒光淬滅劑）進行標記
<400> 12
acgagcgggt tcggcccatt c 21
<210> 13
<211> 458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有鼠IL4基因座和人IL4序列的上游連接的核酸序列
<400> 13
tgctgattgg cccagaataa ctgacaatct ggtgtaataa aattttccaa tgtaaactca 60
ttttcccttg gtttcagcaa ctttaactct atatatagag agacctctgc cagcattgca 120
ttgttagcat ctcttgataa acttaattgt ctctcgtcac tgacggcaca gagctattga 180
tgggtctcac ctcccaactg cttccccctc tgttcttcct gctagcatgt gccggcaact 240
ttgtccacgg acacaagtgc gatatcacct tacaggagat catcaaaact ttgaacagcc 300
tcacagagca gaaggtgagt acctatctgg caccatctct ccagatgttc tggtgatgct 360
ctcagtattt ctaggcatga aaacgttaac agctgctaga gaagttggaa ctggtggttg 420
gtggcagtcc agggcacaca gcgaggcttc tcccctgc 458
<210> 14
<211> 565
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有人IL4序列和兩側加有l(wèi)oxP位點的hygo選擇盒的下游連接的
核酸序列
<400> 14
tgtttatttt gcagaattcc tgtcctgtga aggaagccaa ccagagtacg ttggaaaact 60
tcttggaaag gctaaagacg atcatgagag agaaatattc aaagtgttcg agctgaatat 120
tttaatttat gagtttttga tagctttatt ttttaagtat ttatatattt ataactcatc 180
ataaaataaa gtatatatag aatctaacag caatggcatt taatgtattg gctatgttta 240
cttgacaaat gaaattatgg tttgcaactt ttagggaaat caatttagtt taccaagaga 300
ctataaatgc tatgggagca aaacaggaaa gaccacttcc ccctcgaggg gttccctctc 360
gagttaggga cataacacac aagataatta aagaacacaa ggccatacaa gatgcggccg 420
caccggtata acttcgtata aggtatccta tacgaagtta tatgcatggc ctccgcgccg 480
ggttttggcg cctcccgcgg gcgcccccct cctcacggcg agcgctgcca cgtcagacga 540
agggcgcagc gagcgtcctg atcct 565
<210> 15
<211> 438
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有兩側加有l(wèi)oxP位點的hygo選擇盒和鼠IL-4基因座的下游連接的
核酸序列
<400> 15
tgccaagttc taattccatc agacctcgac ctgcagccgg cgcgccataa cttcgtataa 60
ggtatcctat acgaagttat ctcgagagga gttcccaccc ttctcaagag cataatgcgc 120
agatcattaa gggacagatg caggctgggg agacggttca gcagttagga gtacctgttg 180
ctcttccaga ggacccaggt tcaattcccg gcactcacat agcagcttaa aacaataact 240
caagttctgg gggagctgat gctctcctct ggcctcctgt ggaggtacac agaccacatg 300
cctgtaggca agacacccac acacataaaa acaaaataaa ataaggatag aaaggccagg 360
gggatgaatc cagaggtaga agaaaactta ttccctggaa ttgtcctctg actcccctcc 420
caaaacctct aacacgca 438
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 16
ccgctggcat gtgtattgtg 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 17
tgagtgtggg accctcaaga g 21
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用FAM（5-羧基熒光素熒光探針）進行標記
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> 用BHQ（黑洞淬滅型熒光淬滅劑）進行標記
<400> 18
tgacccaagc cctacatggc cact 24
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 19
tgaggagagc tcacgggaat c 21
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 20
acccatctcc tgcgtttctg 20
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用FAM（5-羧基熒光素熒光探針）進行標記
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 用BHQ（黑洞淬滅型熒光淬滅劑）進行標記
<400> 21
ttgacacgcc agctacactg ctcca 25
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 22
acctgcgtct ccgactacat g 21
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 23
gagctcggtg ctgcaattg 19
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用FAM（5-羧基熒光素熒光探針）進行標記
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 用BHQ（黑洞淬滅型熒光淬滅劑）進行標記
<400> 24
tgggaccatt catcttccac tcgca 25
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 25
ggtggagagg ctattcggc 19
<210> 26
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 26
gaacacggcg gcatcag 17
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用FAM（5-羧基熒光素熒光探針）進行標記
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> 用BHQ（黑洞淬滅型熒光淬滅劑）進行標記
<400> 27
tgggcacaac agacaatcgg ctg 23
<210> 28
<211> 243
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠IL-4Rα基因座和含有IL-4Rα基因的序列的部分
<400> 28
tgggggaggg aggccatgac acaaatgaaa tggaccccgc tgacccagga tcagcatctg 60
cccactcttc tttctgcagg caccttttgt gtccccaatg gggtggcttt gctctgggct 120
cctgttccct gtgagctgcc tggtcctgct gcaggtggca agctctggta agtcaccact 180
tctcaatcat tcatttgttg gctattaatg gcgtgccagg gtcctgcagt atgtcacctg 240
gcc 243
<210> 29
<211> 243
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有人IL-4Rα序列和兩側加有l(wèi)oxP位點的neo選擇盒的下游連接的
核酸序列
<400> 29
gtcagatcgt ggagggtctc ggacgagggt cctgaccctg ggtctccagt cctgggaagt 60
ggagcccagg ctgtaccatg gctgacctca gctcatggct cccgggctcg ataactataa 120
cggtcctaag gtagcgactc gagataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatatg 180
catggcctcc gcgccgggtt ttggcgcctc ccgcgggcgc ccccctcctc acggcgagcg 240
ctg 243
<210> 30
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兩側加有l(wèi)oxP位點的neo選擇盒的序列和鼠IL-4Rα基因座的部分
<400> 30
tattgttttg ccaagttcta attccatcag acctcgacct gcagccccta gataacttcg 60
tataatgtat gctatacgaa gttatcctag gttggagctc tctgtagcca ggtaaccaag 120
ggtcccaggg gaacccccag tgtggacgcg gactgcacat gacacagggc ggcctcccca 180
ttcatgactg tttttctcct tgcagacttc cagctgcccc tgatacagcg ccttccactg 240
ggggtcacca tctcctgcct ctgcatcccg ttgttttgcc tgttctgtta cttcagcatt 300
accaagtgag ttcctgcttt ggctggtgtc tctggctggc ccttcagcag tgctctcaga 360
ggtcacagtc attgtgctgg ctgagaaaag 390
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 31
ttggactagt aacaagaagg gtagca 26
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 32
cctttcccat caccctctaa ctt 23
<210> 33
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 33
agctctggtg gacaga 16
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 34
tctctgccaa gctgcttatc c 21
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 35
ggctgcatgg aagaggtgaa 20
<210> 36
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 36
ctctccacaa atcg 14
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 37
caggcaggaa tagctgagat aatct 25
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 38
tgtggagcaa aaagtggttg at 22
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 39
cctgtgaata gtgataaac 19
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 40
cagttccaaa cgataggctc aa 22
<210> 41
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 41
ataattctgt gaagcatctg gtcttc 26
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 42
ctagagctgc tagtaaaa 18
<210> 43
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 43
atagccaagg ttgcttctga tgacttcagg tccatatagt tggattaatg ttatatttca 60
atcccacaga aacctgaaaa atgaagccta aaatgaagta ttcaaccaac aaaatttcca 120
cagcaaagtg gaagaacaca gcaagcaaag ccttgtgttt 160
<210> 44
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 44
tttatattat tgaataaagt atattttcca aatgtatgtg agactataat gattttatca 60
tatgatgact caatattctg ctcgagataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 120
atgcatggcc tccgcgccgg gttttggcgc ctcccgcggg 160
<210> 45
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 45
agcccctaga taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatgctagta actataacgg 60
tcctaaggta gcgagctagc cgcctgtgcg ttctgggttg aatgacttaa tgcttccaac 120
tgaagaaagg gtaacagaga gaaagaaagc cattcttggc 160
<210> 46
<211> 237
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 46
tttatattat tgaataaagt atattttcca aatgtatgtg agactataat gattttatca 60
tatgatgact caatattctg ctcgagataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 120
gctagtaact ataacggtcc taaggtagcg agctagccgc ctgtgcgttc tgggttgaat 180
gacttaatgc ttccaactga agaaagggta acagagagaa agaaagccat tcttggc 237
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