本發(fā)明屬于組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及植物的組織培養(yǎng)體系，尤其涉及荷花的未成熟子葉體細(xì)胞胚誘導(dǎo)、增殖、分化、萌發(fā)與成苗方法。
背景技術(shù)：
荷花(NelumbonuciferaGaertn.)為蓮科蓮屬多年生水生花卉，是中國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，具有很高的觀賞價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和獨(dú)特的文化內(nèi)涵，深受人們喜愛(ài)。根據(jù)其用途，可分為藕蓮、籽蓮與花蓮。
2013年，荷花品種--中國(guó)古代蓮的全基因組測(cè)序完成，為荷花的基因功能研究奠定了良好的基礎(chǔ)。然而，作為轉(zhuǎn)基因重要技術(shù)基礎(chǔ)的荷花遺傳轉(zhuǎn)化再生體系尚不成熟，嚴(yán)重制約了荷花轉(zhuǎn)基因工作的開(kāi)展。盡管以荷花為研究對(duì)象的組織培養(yǎng)技術(shù)有研究并成功獲得植株再生的報(bào)道，但它的的組織培養(yǎng)不能象其它作物容易誘導(dǎo)再生(如小麥、水稻、玉米等形成胚性愈傷后多次繼代增殖與保存，并誘導(dǎo)高效分化和再生植株)，因此一直被認(rèn)為是難以進(jìn)行培養(yǎng)的園藝作物，限制了荷花組織培養(yǎng)及轉(zhuǎn)基因技術(shù)在育種領(lǐng)域的應(yīng)用。
一般來(lái)說(shuō)，植株再生的途徑可分為兩種，一種途徑是由莖尖直接分化形成叢生苗，然后進(jìn)行增殖，最后誘導(dǎo)生根獲得完整植株，即器官發(fā)生途徑。器官發(fā)生途徑的優(yōu)點(diǎn)在于誘導(dǎo)過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，但它的缺點(diǎn)在于增殖系數(shù)低，同時(shí)，此種再生途徑被認(rèn)為是多細(xì)胞起源，易形成嵌合體，導(dǎo)致假陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株的出現(xiàn)，因此在轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用上受很大的限制。對(duì)荷花來(lái)說(shuō)，目前此途徑主要依靠荷花成熟胚在試管中離體培養(yǎng)出無(wú)菌苗，再用無(wú)菌苗的莖尖作為外植體誘導(dǎo)出愈傷，然后對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)不定芽分化，最后生根成苗。關(guān)于用荷花成熟胚進(jìn)行無(wú)菌苗培養(yǎng)時(shí)取荷花種胚的方法以及消毒的方法，郭娜娜等(荷花成熟胚的組織培養(yǎng)[J].河南科學(xué),2013(3):281-284.)使用濃硫酸腐蝕蓮子種皮，用小刀破殼后直接用酒精和氯化汞消毒后成熟胚的離體成活率達(dá)到86.63％，最終可以形成無(wú)菌苗。
另一種途徑則是通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑，即先通過(guò)誘導(dǎo)外植體形成胚性愈傷，進(jìn)一步誘導(dǎo)胚性愈傷發(fā)育成成熟的胚狀體并萌發(fā)成完整植株，此過(guò)程類(lèi)似于植物的有性繁殖，體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的困難在于，胚性愈傷與胚狀體的誘導(dǎo)與增殖周期長(zhǎng)，獲得難度大且有基因型的差異，但因?yàn)樗谝韵路矫娴膸讉€(gè)特點(diǎn)使這項(xiàng)技術(shù)極具吸引力：一、一旦成功誘導(dǎo)出胚性愈傷，它可以獲得幾百倍甚至上千倍的增殖系數(shù)；二，胚性愈傷可以長(zhǎng)期保持；三、體細(xì)胞胚被認(rèn)為是單細(xì)胞起源，在遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中不易形成嵌合體導(dǎo)致假陽(yáng)性的發(fā)生，因此是轉(zhuǎn)基因的良好受體。在荷花上，目前尚未見(jiàn)體細(xì)胞胚胎再生途徑方面的報(bào)道。
現(xiàn)有技術(shù)中荷花作為商業(yè)開(kāi)發(fā)時(shí)，利用種藕進(jìn)行人工繁育的繁殖系數(shù)低、成本高；同時(shí)在基礎(chǔ)研究中缺乏高效的再生體系，限制了基因工程育種工作的開(kāi)展；這些因素不利于荷花的經(jīng)濟(jì)栽培與遺傳育種工作。因此，通過(guò)研究獲得一種荷花的高效再生體系，以解決荷花人工胚狀體的獲取、基因工程育種等問(wèn)題，并實(shí)現(xiàn)荷花的人工快速離體培養(yǎng)與再生，這顯得尤為重要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種荷花的未成熟子葉體細(xì)胞胚誘導(dǎo)、增殖、分化、萌發(fā)與成苗方法，以實(shí)現(xiàn)荷花的快速經(jīng)濟(jì)繁育，極大提高荷花的繁育系數(shù)，同時(shí)本發(fā)明得到的再生體系可以為荷花的基因工程育種提供良好的材料基礎(chǔ)。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，發(fā)明人通過(guò)大量試驗(yàn)研究并不懈探索，最終獲得了一種荷花未成熟子葉體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的再生方法，該方法包括利用外植體誘導(dǎo)進(jìn)行組織培養(yǎng)的步驟，所采用的外植體為荷花合子胚中的未成熟子葉。
進(jìn)一步地，本發(fā)明所提供的荷花未成熟子葉體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的再生方法，該方法包括如下步驟：
(1)選取荷花受精后合子胚中的未成熟子葉作為組織培養(yǎng)的外植體，對(duì)外植體進(jìn)行消毒及清潔處理；
(2)將外植體放入胚性愈傷誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)出愈傷組織并進(jìn)行增殖培養(yǎng)；
(3)將愈傷組織塊轉(zhuǎn)移到胚狀體發(fā)生培養(yǎng)基中，發(fā)育形成胚狀體；
(4)將產(chǎn)生的胚狀體移入胚萌發(fā)培養(yǎng)基中進(jìn)行萌發(fā)，發(fā)育形成子葉形胚；
(5)將萌發(fā)的子葉形胚移至含荷花成苗培養(yǎng)基中成苗培養(yǎng)，然后移栽至自然環(huán)境中。
優(yōu)選地，如上所述荷花未成熟子葉體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的再生方法，其中步驟(1)中對(duì)于發(fā)育較大的未成熟子葉，將其切割成約1-2mm小塊。
優(yōu)選地，如上所述荷花未成熟子葉體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的再生方法，其中步驟(2)中所述的胚性愈傷誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基的配方為基本MS培養(yǎng)基，添加30g/L的蔗糖、250mg/L的水解酪蛋白、0.5-5.0mg/L的2,4-D、0.5-2.0mg/L的BAP和0.7％的瓊脂糖，調(diào)節(jié)pH為5.5-6.0；外植體放在盛有上述培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，然后用封口膜將培養(yǎng)皿包好；培養(yǎng)條件為黑暗或弱光中，25±2℃培養(yǎng)4-8周；當(dāng)愈傷組織誘導(dǎo)出來(lái)，將胚性愈傷組織分成直徑為0.2-0.5cm的小塊，將各小塊分別接入裝有所述胚性愈傷誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基的器皿中進(jìn)行胚性愈傷組織的增殖。
優(yōu)選地，如上所述荷花未成熟子葉體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的再生方法，其中步驟(3)中所述的胚狀體發(fā)生培養(yǎng)基的配方為基本MS培養(yǎng)基，添加30g/L的蔗糖、250mg/L的水解酪蛋白、1.0mg/L的BAP和0.7％的瓊脂糖，調(diào)節(jié)pH為5.5-6.0；將步驟2所得的胚性愈傷組織接入盛有上述培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，然后用封口膜將培養(yǎng)皿包好；培養(yǎng)條件為16/8h光周期，光照強(qiáng)度為1000-1500lux，25±2℃培養(yǎng)3-4周。
優(yōu)選地，如上所述荷花未成熟子葉體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的再生方法，其中步驟(4)中所述的胚萌發(fā)培養(yǎng)基的配方為1/2MS培養(yǎng)基，添加10-50mg/L的GA3、0-0.5mg/L的BAP與0.7％的瓊脂糖；培養(yǎng)條件為16/8h光周期，光照強(qiáng)度為2000-3000lux，25±2℃培養(yǎng)1-6周。
優(yōu)選地，如上所述荷花未成熟子葉體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的再生方法，其中步驟(5)中所述的荷花成苗培養(yǎng)基為雙層培養(yǎng)基，基中下層為固體培養(yǎng)基，上層為液體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基的配方為1/2MS培養(yǎng)基，添加0.2mg/L的IBA與0.7％的瓊脂糖，液體培養(yǎng)基的配方為2％蔗糖水溶液，調(diào)節(jié)pH為5.5-6.0。
進(jìn)一步優(yōu)選地，如上所述荷花未成熟子葉體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的再生方法，其中步驟(5)中當(dāng)荷花莖伸長(zhǎng)至6-8cm后，將其移栽至泥塘中培養(yǎng)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的荷花未成熟子葉體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的再生方法具有如下有益效果和突出優(yōu)點(diǎn)：其一，培養(yǎng)速度快，從誘導(dǎo)傷愈組織6-8個(gè)星期之后，胚性愈傷組織開(kāi)始形成，8-10個(gè)星期之后胚形態(tài)已經(jīng)開(kāi)始發(fā)生并形成子葉形胚，然后將已誘導(dǎo)的小苗進(jìn)行移栽，可進(jìn)一步培養(yǎng)成苗；其二，經(jīng)濟(jì)適用性高，每克愈傷組織可以分化成500-800個(gè)胚狀體或者不斷在新愈傷培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)，這取決于材料、培養(yǎng)基與激素的應(yīng)用，一般而言通過(guò)3-4周的培養(yǎng)可以擴(kuò)大8-10倍；其三，能促進(jìn)荷花的商業(yè)開(kāi)發(fā)，有效提高荷花生產(chǎn)上的繁殖系數(shù)，滿(mǎn)足園藝栽培與大批量生產(chǎn)的要求；其四，荷花的轉(zhuǎn)基因研究剛剛起步，本發(fā)明中建立的高效再生體系可以為荷花的轉(zhuǎn)基因奠定良好的基礎(chǔ)；其五，本發(fā)明的方法易于實(shí)施，便于推廣。
附圖說(shuō)明
圖1為荷花品種‘紅建蓮’體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程；其中：
a.花后10d未成熟合子胚子葉接種42d后形成的愈傷；
b.胚性愈傷的增殖(黑色部分為老愈傷組織，淡黃色部分為新形成的愈傷)；
c.體細(xì)胞胚的萌發(fā)(多個(gè)體細(xì)胞胚發(fā)育至魚(yú)雷形胚)；
d.胚性愈傷及胚的早期萌發(fā)；
e.兩個(gè)獨(dú)立的子葉型胚的萌發(fā)示意莖尖的形成；
f.胚白化與畸形的產(chǎn)生；
g.體細(xì)胞胚的生根；
h.小苗的移栽與生長(zhǎng)發(fā)育。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明方法的實(shí)施過(guò)程和有益效果，實(shí)施例僅用于例證的目的，不限制本發(fā)明的范圍，同時(shí)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所做的顯而易見(jiàn)的改變也包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。另外，本發(fā)明所采用的試劑，其中：
GA3的化學(xué)成分為赤霉素，使用時(shí)配制成高濃度母液，即0.5mg/mL。具體配制方法：稱(chēng)取50mgGA3，先用2-3mL95％酒精溶解，然后用蒸餾水定容至100mL，即可使用。
2,4-D的化學(xué)成分為2,4-二氯苯氧乙酸，使用時(shí)配制成高濃度母液，即0.5mg/mL具體配制方法：準(zhǔn)確稱(chēng)量2,4-D50mg，先用2ml95％乙醇完全溶解后，加蒸餾水定容至100ml，即配成濃度為0.5mg/mL的母液。
BAP的化學(xué)成分為6-芐氨基嘌呤，使用時(shí)配制成高濃度母液，即0.5mg/mL具體配制方法：準(zhǔn)確稱(chēng)量BAP50mg，加入2mL量1mol/L氫氧化鈉溶液使之完全溶解后，加蒸餾水定容至100ml，即配制成濃度為0.5mg/mL的BAP的母液。
IBA的化學(xué)成分為吲哚丁酸，使用時(shí)配制成高濃度母液，即0.5mg/mL具體配制方法：準(zhǔn)確稱(chēng)量IBA50mg，用2ml1mol/L氫氧化鈉溶液使之完全溶解后，再加蒸餾水定容至100ml，即配成濃度為0.5mg/mL的母液。
1、選取外植體：
以荷花‘紅建蓮’作為組織培養(yǎng)品種，選取荷花未成熟子葉為組織培養(yǎng)外植體，取開(kāi)放前的花藥及花絲為對(duì)照外植體。在6月底，觀察不同株系‘紅建蓮’開(kāi)花與授粉的時(shí)期，并在花后一段時(shí)間取其蓮座，放置于4℃冰箱進(jìn)行低溫預(yù)處理3天。
2、外植體的消毒、接種：
從蓮座中取出幼嫩的蓮種子，先用2％次氯酸鈉溶液浸泡消毒30min，然后用無(wú)菌蒸餾水中沖洗三次，去掉種子外層的種皮，取出未成熟合子胚，在超凈工作臺(tái)上用解剖刀將其中的子葉切下，根據(jù)發(fā)育時(shí)期的不同，分別切割成1-2mm長(zhǎng)。
3、愈傷組織誘導(dǎo)：
胚性愈傷誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基的配方為基本MS培養(yǎng)基，添加30g/L的蔗糖、250mg/L的水解酪蛋白、2.0mg/L的2,4-D、1.0mg/L的BAP，調(diào)節(jié)pH為5.5-5.8，然后加0.7％的瓊脂，高壓滅菌鍋121℃滅菌20分鐘；在直徑9cm的培養(yǎng)皿上倒好培養(yǎng)基后，將上述預(yù)處理后的外植體置于其上，然后用封口膜將培養(yǎng)皿包好置于人工培養(yǎng)箱中；培養(yǎng)條件為黑暗，25±2℃，培養(yǎng)約6-8個(gè)星期；當(dāng)愈傷組織塊誘導(dǎo)出來(lái)，把胚性愈傷組織分成直徑為0.2-0.5cm的小塊，將各小塊分別放在裝有上述胚性愈傷誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基的器皿中進(jìn)行胚性愈傷的增殖，每隔28d對(duì)胚性愈傷進(jìn)行1次增殖培養(yǎng)。根據(jù)表1的試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，接種外植體后42天時(shí)，采用本發(fā)明培養(yǎng)基配方(EC12)誘導(dǎo)后的愈傷誘導(dǎo)發(fā)生率(誘導(dǎo)愈傷發(fā)生的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100％)為29.59％(29/98)。
表1‘紅建蓮’幼胚子葉及花藥、花絲在接種不同愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上42天后胚性愈傷形成率
4、體細(xì)胞胚誘導(dǎo)：
把愈傷組織分成直徑為0.5cm的小塊，將上述各小塊轉(zhuǎn)移到25ml含有30g/L的蔗糖、250mg/L的水解酪蛋白、1.0mg/L的BAP和0.7％的瓊脂糖、pH為5.5-6.0的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)，16/8h光周期，光強(qiáng)為1000-1500lux，溫度為27℃，培養(yǎng)3-4周。
5、胚狀體的萌發(fā)：
將經(jīng)過(guò)上述步驟4處理的胚狀體放入裝有20-25ml的固體培養(yǎng)基的器皿中，培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，添加50mg/L的GA3與0.7％的瓊脂糖，培養(yǎng)條件為16/8h光周期，光照強(qiáng)度為2000-3000lux，25±2℃，在培養(yǎng)箱中上培育2-3個(gè)星期之后轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中，部分胚狀體會(huì)萌發(fā)分化形成子葉。根據(jù)表2的試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，采用本發(fā)明培養(yǎng)基(8號(hào))誘導(dǎo)后的萌發(fā)率(已誘導(dǎo)萌發(fā)的胚數(shù)/接種體細(xì)胞團(tuán)×100％)為63.47％(73/115)。
表2紅建蓮胚狀體在不同培養(yǎng)基上的萌發(fā)率比較
6、成苗誘導(dǎo)與移栽：
將萌發(fā)的子葉形胚移至含荷花成苗培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，培養(yǎng)基為雙層培養(yǎng)基，基中下層為75-100ml固體培養(yǎng)基，上層為50-100ml液體培養(yǎng)基。其中，固體培養(yǎng)基成份為1/2MS培養(yǎng)基，添加0.2mg/L的IBA與0.7％的瓊脂糖，液體培養(yǎng)基為2％蔗糖水溶液，調(diào)節(jié)pH為5.5-6.0，6000-8000lux光照下恒溫培養(yǎng)。待萌發(fā)的子葉形胚生長(zhǎng)至荷花莖尖長(zhǎng)約6-8cm后且根系發(fā)育致密，可將其移栽至泥塘中培養(yǎng)。移栽存活率(移栽存活植株數(shù)/移栽總苗數(shù)×100％)為97.14％(68/70)。