1.一種荷花未成熟子葉體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的再生方法,該方法包括利用外植體誘導(dǎo)進(jìn)行組織培養(yǎng)的步驟,其特征在于,所采用的外植體為荷花合子胚中的未成熟子葉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述荷花未成熟子葉體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的再生方法,其特征在于,該方法包括如下步驟:
(1)選取荷花受精后合子胚中的未成熟子葉作為組織培養(yǎng)的外植體,對(duì)外植體進(jìn)行消毒及清潔處理;
(2)將外植體放入胚性愈傷誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng),誘導(dǎo)出愈傷組織并進(jìn)行增殖培養(yǎng);
(3)將愈傷組織塊轉(zhuǎn)移到胚狀體發(fā)生培養(yǎng)基中,發(fā)育形成胚狀體;
(4)將產(chǎn)生的胚狀體移入胚萌發(fā)培養(yǎng)基中進(jìn)行萌發(fā),發(fā)育形成子葉形胚;
(5)將萌發(fā)的子葉形胚移至含荷花成苗培養(yǎng)基中成苗培養(yǎng),然后移栽至自然環(huán)境中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述荷花未成熟子葉體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的再生方法,其特征在于,步驟(1)中對(duì)于發(fā)育較大的未成熟子葉,將其切割成約1-2mm小塊。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述荷花未成熟子葉體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的再生方法,其特征在于,步驟(2)中所述的胚性愈傷誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基的配方為基本MS培養(yǎng)基,添加30g/L的蔗糖、250mg/L的水解酪蛋白、0.5-5.0mg/L的2,4-D、0.5-2.0mg/L的BAP和0.7%的瓊脂糖,調(diào)節(jié)pH為5.5-6.0;外植體放在盛有上述培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,然后用封口膜將培養(yǎng)皿包好;培養(yǎng)條件為黑暗或弱光中,25±2℃培養(yǎng)4-8周;當(dāng)愈傷組織誘導(dǎo)出來(lái),將胚性愈傷組織分成直徑為0.2-0.5cm的小塊,將各小塊分別接入裝有所述胚性愈傷誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基的器皿中進(jìn)行胚性愈傷組織的增殖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述荷花未成熟子葉體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的再生方法,其特征在于,步驟(3)中所述的胚狀體發(fā)生培養(yǎng)基的配方為基本MS培養(yǎng)基,添加30g/L的蔗糖、250mg/L的水解酪蛋白、1.0mg/L的BAP和0.7%的瓊脂糖,調(diào)節(jié)pH為5.5-6.0;將步驟2所得的胚性愈傷組織接入盛有上述培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,然后用封口膜將培養(yǎng)皿包好;培養(yǎng)條件為16/8h光周期,光照強(qiáng)度為1000-1500lux,25±2℃培養(yǎng)3-4周。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述荷花未成熟子葉體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的再生方法,其特征在于,步驟(4)中所述的胚萌發(fā)培養(yǎng)基的配方為1/2MS培養(yǎng)基,添加10-50mg/L的GA3、0-0.5mg/L的BAP與0.7%的瓊脂糖;培養(yǎng)條件為16/8h光周期,光照強(qiáng)度為2000-3000lux,25±2℃培養(yǎng)1-3周。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述荷花未成熟子葉體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的再生方法,其特征在于,步驟(5)中所述的荷花成苗培養(yǎng)基為雙層培養(yǎng)基,基中下層為固體培養(yǎng)基,上層為液體培養(yǎng)基,固體培養(yǎng)基的配方為1/2MS培養(yǎng)基,添加0.2mg/L的IBA與0.7%的瓊脂糖,液體培養(yǎng)基的配方為2%蔗糖水溶液,調(diào)節(jié)pH為5.5-6.0。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述荷花未成熟子葉體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的再生方法,其特征在于,步驟(5)中當(dāng)荷花莖伸長(zhǎng)至6-8cm后,將其移栽至泥塘中培養(yǎng)。