本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域,具體為一種烏龍頭快速繁殖的方法。
背景技術(shù):
烏龍頭又稱“刺龍牙”、“木龍頭”、“樹頭菜”等,為五加科楤木屬的多年生落葉灌木或小喬木,是山林地區(qū)所產(chǎn)的藥、菜兩用的名貴野菜。烏龍頭的鮮嫩芽含有豐富的營養(yǎng)成分,富含人體所需的多種氨基酸和大量的鈣、磷、鐵、鋅、鎂、鈉等礦質(zhì)元素。烏龍頭的干燥根皮、莖皮及葉均可入藥,具很高的藥用價值,主要的有效成分是皂苷。具有補(bǔ)氣、活血、止痛、祛風(fēng)、利濕、利尿、消腫之功效。長期食用可調(diào)節(jié)神經(jīng)、強(qiáng)身健體、延年益壽。隨著人們生活水平的不斷提高,綠色食品越來越受到人們的關(guān)注,被譽(yù)為“山野菜之王”的烏龍頭自然越來越受到人們的青睞,市場需求量與日俱增。隨著人們肆無忌憚的采集和破壞,野生資源已經(jīng)日漸枯竭。
為保護(hù)烏龍頭野生資源、滿足市場需求,解決烏龍頭的快速繁殖勢在必行。所以,具有繁殖速度快、周期短、可以規(guī)?;a(chǎn)等優(yōu)點的植物組織培養(yǎng)技術(shù)是烏龍頭快速繁殖的一條有效且重要的途徑。楤木植物組織培養(yǎng)過程中可通過莖段的休眠腋芽誘導(dǎo)成不定芽,再誘導(dǎo)不定芽進(jìn)行生根成苗;也可使外植體先誘導(dǎo)出愈傷,再形成胚狀體,最后由誘導(dǎo)的胚狀體分化成苗。休眠腋芽途徑獲得的幼苗數(shù)量較少,受外植體取材限制,且小苗成活率低。因此探究外植體誘導(dǎo)愈傷,進(jìn)一步誘導(dǎo)形成胚狀體,最后分化為幼苗的關(guān)鍵技術(shù),是實現(xiàn)烏龍頭大量繁殖的關(guān)鍵。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
本發(fā)明旨在建立誘導(dǎo)烏龍頭外植體成為愈傷、誘導(dǎo)愈傷形成胚狀體、誘導(dǎo)胚狀體分化成苗、誘導(dǎo)幼苗生根四個環(huán)節(jié)的整個快繁體系,研究烏龍頭組織培育苗技術(shù),著重研究新型植物生長調(diào)節(jié)劑和抗褐化劑對烏龍頭愈傷形成胚狀體的影響和胚狀體分化成苗的影響,建立起烏龍頭幼苗的高效繁殖體系,有效的保護(hù)環(huán)境資源,并為地方農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展起到推動作用。
本發(fā)明一種烏龍頭快速繁殖方法,具體步驟為:
(1)外植體誘導(dǎo)出愈傷:將表面消毒的烏龍頭嫩莖與幼葉接種至外植體脫分化培養(yǎng)基上,培養(yǎng)條件25℃,光照2000Lx,12小時/天,愈傷誘導(dǎo)率為100%;所述脫分化的培養(yǎng)基為MS+2,4-D 1.5 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L;pH5.8。
(2)愈傷組織誘導(dǎo)分化成胚狀體:將步驟(1)獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)至誘導(dǎo)愈傷組織分化為胚狀體培養(yǎng)基上,培養(yǎng)條件25℃,光照2000Lx,12小時/天,繼代三次,每次45天,第三次胚狀體增殖系數(shù)11.337;所述誘導(dǎo)愈傷組織分化為胚狀體培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L+活性炭2 g/L;pH5.8。
(3)胚狀體誘導(dǎo)分化為幼苗:將步驟(2)獲得的胚狀體轉(zhuǎn)至胚狀體分化成苗培養(yǎng)基上,培養(yǎng)條件25℃,光照2000Lx,12小時/天,培養(yǎng)60天,苗分化倍數(shù)3.889;所述胚狀體分化成苗培養(yǎng)基為MS+ ZT(玉米素)1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30g/L+活性炭2 g/L;pH5.8。
(4)誘導(dǎo)生根壯苗:將步驟(3)獲得的小苗轉(zhuǎn)至生根壯苗培養(yǎng)基上,培養(yǎng)條件25℃,光照2000Lx,12小時/天,培養(yǎng)45天,生根率98.6%,平均根長11.5cm,平均主根數(shù)3.2條;所述生根壯苗培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.1 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L+活性炭2 g/L;pH5.8。
本發(fā)明通過組織培養(yǎng)中四個環(huán)節(jié)(外植體誘導(dǎo)出愈傷、愈傷組織誘導(dǎo)分化成胚狀體、胚狀體誘導(dǎo)分化為健壯小苗、小苗誘導(dǎo)生根)培養(yǎng)基的設(shè)計,在愈傷組織形成生根小苗的3個環(huán)節(jié)中添加了抗褐化劑成分,在胚狀體誘導(dǎo)分化為健壯小苗添加了新的激素成分,從而實現(xiàn)烏龍頭的快速繁殖。
本發(fā)明方法的優(yōu)點:本發(fā)明方法使用的外植體為烏龍頭幼葉與嫩莖,愈傷誘導(dǎo)率高,愈傷品質(zhì)好,不易褐化;易誘導(dǎo)胚狀體分化且胚狀體增殖率高,胚狀體易分化為幼苗,畸形率較低,幼苗健壯,根系發(fā)達(dá)。
本發(fā)明方法使用四種培養(yǎng)基所用成分均為常規(guī)培養(yǎng)基成分,材料易尋找,成本低。
附圖說明
圖1為外植體在脫分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的愈傷組織;
圖2為誘導(dǎo)愈傷分化為胚狀體培養(yǎng)基上的胚狀體;
圖3為誘導(dǎo)胚狀體成苗培養(yǎng)基上的幼苗;
圖4為誘導(dǎo)生根壯苗培養(yǎng)基上的幼苗。
具體實施方式
通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明,而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。
所用試劑采購廠家分別為:1/2MS粉末:上海宇涵生物科技有限公司;NAA:北京康倍斯科技有限公司;6-BA:北京康倍斯科技有限公司;ZT:南京奧多福尼生物科技有限公司;蔗糖:天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;瓊脂:北京康倍斯科技有限公司;活性炭:北京康倍斯科技有限公司。
【實施例1】利用烏龍頭的幼葉與嫩莖建立起烏龍頭幼苗的高效繁殖體系
1、準(zhǔn)備四種培養(yǎng)基:
外植體脫分化培養(yǎng)基(A)MS+2, 4-D 1.5 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L;pH 5.8。誘導(dǎo)愈傷組織分化為胚狀體培養(yǎng)基(B)MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L+活性炭2 g/L;pH5.8。胚狀體分化成苗培養(yǎng)基(C)MS+ZT 1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30 g/L+活性炭2 g/L;pH5.8。生根壯苗培養(yǎng)基(D)1/2MS+NAA 0.1 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L+活性炭2 g/L;pH5.8。
2、準(zhǔn)備外植體:準(zhǔn)備生長健康、初春剛發(fā)芽展開的兩年生的幼葉與嫩莖,備用。
3、外植體誘導(dǎo)愈傷:
外植體脫分化培養(yǎng)基制備(以一升為例):取900 ml左右蒸餾水加熱,當(dāng)有小氣泡出現(xiàn)時,加入7 g瓊脂,攪拌均勻,溶解完全后,再加入蔗糖30 g和 MS 4.74 g,攪拌至溶解完全,加入植物生長調(diào)節(jié)劑2,4-D 1.5 mg;定容到1 L,調(diào)節(jié)pH為5.8。分裝到果醬瓶中,裝量為30 ml/瓶。
外植體脫分化:嫩莖與幼葉接入愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基時,將幼葉剪切為0.5cm2左右,將嫩莖剪切為0.5cm左右莖段。分別接入培養(yǎng)基,25天嫩莖完全愈傷化,60天幼葉完全愈傷化。培養(yǎng)條件25℃,光照2000Lx,12小時/天。記錄愈傷生長狀況,測量愈傷塊體積并計算愈傷增殖量,愈傷誘導(dǎo)率100%,每塊愈傷組織增殖1 cm左右。(如圖1)
4、誘導(dǎo)愈傷組織分化胚狀體:
誘導(dǎo)愈傷組織分化為胚狀體培養(yǎng)基制備(以一升為例):取900 ml左右蒸餾水加熱,當(dāng)有小氣泡出現(xiàn)時,加入7 g瓊脂,攪拌均勻,溶解完全后,再加入蔗糖30 g和 MS 4.74 g,攪拌至溶解完全,加入植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA 0.5 mg和NAA 0.4 mg,攪拌均勻后加入2 g活性炭;定容到1 L,調(diào)節(jié)pH為5.8。分裝到果醬瓶中,裝量為30 ml/瓶。
愈傷組織分化為胚狀體并誘導(dǎo)胚狀體增殖:轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)愈傷組織分化胚狀體培養(yǎng)基時,將愈傷組織切割為0.5 cm3左右小塊,均勻接入培養(yǎng)基表面,每瓶接種三塊。繼代三次,每次繼代45天。培養(yǎng)條件25℃,光照2000Lx,12小時/天。記錄每次繼代后的胚狀體誘導(dǎo)狀況,并記錄第三次繼代胚狀體測量體積并計算增殖系數(shù),胚狀體增殖11.337倍。(如圖2)
5、誘導(dǎo)胚狀體分化幼苗:
誘導(dǎo)胚狀體分化幼苗培養(yǎng)基制備(以一升為例):取900 ml左右蒸餾水加熱,當(dāng)有小氣泡出現(xiàn)時,加入7 g瓊脂,攪拌均勻,溶解完全后,再加入蔗糖30 g和 MS 4.74 g,攪拌至溶解完全,加入植物生長調(diào)節(jié)劑ZT 1 mg和NAA 0.05 mg,攪拌均勻后加入2 g活性炭;定容到1 L,調(diào)節(jié)pH為5.8。分裝到果醬瓶中,裝量為30 ml/瓶。
胚狀體分化為幼苗:轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)胚狀體分化為幼苗的培養(yǎng)基時,將多個魚雷期胚狀體連同與其相連接的少量愈傷組織或子葉前期胚狀體均勻接入培養(yǎng)基表面。培養(yǎng)條件25℃,光照2000Lx,12小時/天。誘導(dǎo)60天,記錄統(tǒng)計分化成的健康幼苗數(shù)量并計算分化率,苗分化倍數(shù)為3.889倍。(如圖3)
6、誘導(dǎo)生根壯苗:
誘導(dǎo)胚狀體分化幼苗培養(yǎng)基制備(以一升為例):取900 ml左右蒸餾水加熱,當(dāng)有小氣泡出現(xiàn)時,加入7 g瓊脂,攪拌均勻,溶解完全后,再加入蔗糖30 g和 1/2MS 2.47 g,攪拌至溶解完全,加入植物生長調(diào)節(jié)劑NAA 0.1 mg,攪拌均勻后加入2 g活性炭;定容到1 L,調(diào)節(jié)pH為5.8。分裝到果醬瓶中,裝量為30 ml/瓶。
幼苗生根壯苗:轉(zhuǎn)入生根壯苗培養(yǎng)基時,將過于幼小的苗和根系纖弱的苗接入培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件25℃,光照2000Lx,12小時/天。培養(yǎng)45天,記錄生根苗數(shù)和苗株的根長、主根數(shù)并計算生根率,生根率98.6 %,平均根長11.5 cm,平均主根數(shù)3.2條(如圖4)。