本發(fā)明涉及一種豬新品系的培育方法，特別是涉及一種抗大腸桿菌F4ac感染的新品系豬的培育方法。
背景技術(shù)：
我國是世界上養(yǎng)豬生產(chǎn)和豬肉消費(fèi)第一大國，世界上幾乎一半的豬飼養(yǎng)在中國。豬肉是我國傳統(tǒng)肉食品來源，約占肉食品消費(fèi)的66％。仔豬腹瀉是養(yǎng)豬生產(chǎn)中的常見傳染病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F4(Enterotoxigenic Escherichia coli F4，ETEC F4)是引發(fā)新生和斷奶前仔豬腹瀉病的最主要致病菌。其中分別有約40％的仔豬腹瀉病是因ETEC F4侵染而引起的，即使是病愈個(gè)體，也會(huì)嚴(yán)重影響生長發(fā)育，有的形成僵豬，導(dǎo)致飼養(yǎng)成本增加，銷售收入下降。利用斷奶前腹瀉抗病基因MUC13，開展抗斷奶前疾病的抗性選育，培育出能抵大腸桿菌F4ac感染的優(yōu)質(zhì)抗性核心群，并進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化推廣，不僅能在技術(shù)市場搶占先機(jī)，通過抗腹瀉種豬的推廣也將為企業(yè)帶來豐厚的經(jīng)濟(jì)效益，更能改善我區(qū)乃至我國種豬健康品質(zhì)。
在過去的幾十年中，我國在地方豬種的選育提高及與外來豬種的雜交改良及雜種優(yōu)勢利用方面做出了大量的工作，大大提高了我國養(yǎng)豬業(yè)的生產(chǎn)水平。隨著分子生物學(xué)和分子數(shù)量遺傳學(xué)的發(fā)展，豬的育種已逐步從常規(guī)育種走向常規(guī)育種與分子育種相結(jié)合的道路。分子標(biāo)記己應(yīng)用于豬的不 同品系或品種的等位基因之組合、性狀的標(biāo)記輔助選擇，大大提高了選擇的準(zhǔn)確性和育種效率。然而現(xiàn)有抗大腸桿菌F4ac感染的豬生長較慢快、瘦肉率和出欄率較低。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供了一種抗大腸桿菌F4ac感染的新品系豬的培育方法，包括以下步驟：
第一階段：
以抗大腸桿菌F4ac感染的優(yōu)秀個(gè)體作為母本，以外來瘦肉型品種新美系杜洛克公豬中來源于不同家系的優(yōu)秀個(gè)體作為父本進(jìn)行雜交，在所產(chǎn)后代中選留母豬，組成第1世代母豬核心群；
第二階段：
第1世代母豬產(chǎn)生的豬卵母細(xì)胞去核；使所述卵母細(xì)胞與供體豬成纖維細(xì)胞融合，所述成纖維細(xì)胞的基因組包含至少一個(gè)抗大腸桿菌F4ac感染等位基因；激活所述卵母細(xì)胞以產(chǎn)生胚胎；
第三階段：
以胚胎中的母豬核心群為母本、抗大腸桿菌F4ac感染的公豬為父本進(jìn)行級進(jìn)雜交，在所生后代中用分子標(biāo)記和綜合選擇指數(shù)方法選留母豬，組成第2世代母豬核心群，其含有75％的抗大腸桿菌F4ac感染的豬血統(tǒng)，25％的杜洛克豬血統(tǒng)；
以第1世代母豬核心群為母本、新美系杜洛克公豬為父本進(jìn)行級進(jìn)雜交，杜洛克公豬來源于不同的家系，在所生后代中用分子標(biāo)記和綜合選擇指數(shù)方法選留母豬，組成第3世代母豬核心群，其含有75％的杜洛克豬血 統(tǒng)，25％的抗大腸桿菌F4ac感染的豬血統(tǒng)；
第四階段：
以第2世代母豬核心群為母本，再以抗大腸桿菌F4ac感染的公豬為父本進(jìn)行級進(jìn)雜交，在所生后代中用分子標(biāo)記和綜合選擇指數(shù)方法選留公豬和母豬，組成第4世代豬核心群，其含有87.5％的抗大腸桿菌F4ac感染豬的血統(tǒng)，12.5％的杜洛克豬血統(tǒng)；
以第3世代母豬為母本，再以新美系杜洛克豬公豬為父本進(jìn)行級進(jìn)雜交，杜洛克公豬來源于不同的家系，在所生后代中用分子標(biāo)記和綜合選擇指數(shù)方法選留公豬和母豬，組成第5世代豬核心群，其含有87.5％的杜洛克豬血統(tǒng)，12.5％的抗大腸桿菌F4ac感染豬的豬血統(tǒng)；
第五階段：
分別以第4世代豬核心群中的公、母豬交配，以第5世代豬核心群心群中的公、母豬交配，從第4世代開始分別采用群體閉鎖繁殖和選育，進(jìn)行2～3個(gè)世代的橫交，在橫交各代豬中用分子標(biāo)記和綜合選擇指數(shù)方法選留公豬和母豬，得到橫交各代豬核心群。同一世代公豬與母豬交配，每個(gè)世代選留母豬和公豬，進(jìn)行2～3個(gè)世代的橫交后，得到抗大腸桿菌F4ac感染的新品系豬。
在某些實(shí)施方式中，所述第二階段的重構(gòu)胚胎具體過程為：將成熟的卵母細(xì)胞置于顯微操作盤工作滴中，隨后將固定針固定住卵母細(xì)胞，將注射針針口正對極體且位于透明帶間隙內(nèi)，緩緩吸取1/5-1/4的細(xì)胞質(zhì)并同時(shí)吸走極體，去除卵母細(xì)胞的細(xì)胞核，然后選取中等大小、活力較好的細(xì)胞注入卵母細(xì)胞卵周隙，最后采用電融合的方法形成重構(gòu)胚胎，融合電擊參數(shù)為1.3kv/mm、30us、2次脈沖，30min后觀察融合率，未融合的進(jìn)行二次融合，將融合后的卵母細(xì)胞放入38℃、5％CO2中培養(yǎng)，48h后觀察卵裂 率，6d后觀察囊胚發(fā)育情況。
在某些實(shí)施方式中，所述第二階段后還包括胚胎移植過程，具體為：當(dāng)重組胚胎體發(fā)育至2～4細(xì)胞期后，挑選形態(tài)和發(fā)育較好的胚胎進(jìn)行移植，每頭受體移植150～250枚胚胎，共移植3～10頭母豬，胚胎移植后進(jìn)行B超妊娠檢測。
在某些實(shí)施方式中，所述第五階段后還包括轉(zhuǎn)基因豬的鑒定的過程：小豬出生后采取耳朵與尾部組織提取基因組DNA，以此為模板進(jìn)行PCR、Real-time PCR和染色體步移方法來鑒定其陽性。
在某些實(shí)施方式中，第一次選留在28日齡斷奶時(shí)進(jìn)行，且選擇被毛黑色，體重大于4kg，乳頭數(shù)7對及以上，體形勻稱，體質(zhì)好的母豬。
在某些實(shí)施方式中，第二次選留時(shí)淘汰生長速度慢，體質(zhì)差的豬。
在某些實(shí)施方式中，第三次選留時(shí)測定6月齡體重、背膘厚、計(jì)算斷奶后至90kg體重階段的日增重，料肉比，選擇日增重500g以上、料肉比小于3.2∶1的母豬留種。
在某些實(shí)施方式中，第三次選留時(shí)選擇90kg時(shí)活體背膘厚20mm以下的母豬留種。
在某些實(shí)施方式中，第三次選留時(shí)選擇眼肌面積大于25cm2的母豬留種。
在某些實(shí)施方式中，豬種選自華南、華中、華北、江海、西南或高原型地方豬種中的任意一種。本發(fā)明提供的一種抗大腸桿菌F4ac感染的新品系豬的培育方法的有益效果是：
本發(fā)明可以顯著提高種群斷奶仔豬的抗腹瀉病能力，大大減少仔豬死亡率。該種培育方法培育的豬既有抗大腸桿菌F4ac感染的豬的優(yōu)點(diǎn)，又有引入豬品種的生長快、瘦肉率高等特點(diǎn)。提高了養(yǎng)豬出欄率的同時(shí)，提升 了商品豬質(zhì)量，降低了經(jīng)濟(jì)成本，保證了經(jīng)濟(jì)效益。
具體實(shí)施方式
為了更清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例及圖對本發(fā)明的權(quán)利要求做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，可以理解的是，以下僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對范圍的限定，任何人在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
本發(fā)明提供了一種抗大腸桿菌F4ac感染的新品系豬的培育方法，包括以下步驟：
第一階段：
以抗大腸桿菌F4ac感染的優(yōu)秀個(gè)體作為母本，以外來瘦肉型品種新美系杜洛克公豬中來源于不同家系的優(yōu)秀個(gè)體作為父本進(jìn)行雜交，在所產(chǎn)后代中選留母豬，組成第1世代母豬核心群；
第二階段：
第1世代母豬產(chǎn)生的豬卵母細(xì)胞去核；使所述卵母細(xì)胞與供體豬成纖維細(xì)胞融合，所述成纖維細(xì)胞的基因組包含至少一個(gè)抗大腸桿菌F4ac感染等位基因；激活所述卵母細(xì)胞以產(chǎn)生胚胎；
第三階段：
以胚胎中的母豬核心群為母本、抗大腸桿菌F4ac感染的公豬為父本進(jìn)行級進(jìn)雜交，在所生后代中用分子標(biāo)記和綜合選擇指數(shù)方法選留母豬，組成第2世代母豬核心群，其含有75％的抗大腸桿菌F4ac感染的豬血統(tǒng)，25％的杜洛克豬血統(tǒng)；
以第1世代母豬核心群為母本、新美系杜洛克公豬為父本進(jìn)行級進(jìn)雜 交，杜洛克公豬來源于不同的家系，在所生后代中用分子標(biāo)記和綜合選擇指數(shù)方法選留母豬，組成第3世代母豬核心群，其含有75％的杜洛克豬血統(tǒng)，25％的抗大腸桿菌F4ac感染的豬血統(tǒng)；
第四階段：
以第2世代母豬核心群為母本，再以抗大腸桿菌F4ac感染的公豬為父本進(jìn)行級進(jìn)雜交，在所生后代中用分子標(biāo)記和綜合選擇指數(shù)方法選留公豬和母豬，組成第4世代豬核心群，其含有87.5％的抗大腸桿菌F4ac感染豬的血統(tǒng)，12.5％的杜洛克豬血統(tǒng)；
以第3世代母豬為母本，再以新美系杜洛克豬公豬為父本進(jìn)行級進(jìn)雜交，杜洛克公豬來源于不同的家系，在所生后代中用分子標(biāo)記和綜合選擇指數(shù)方法選留公豬和母豬，組成第5世代豬核心群，其含有87.5％的杜洛克豬血統(tǒng)，12.5％的抗大腸桿菌F4ac感染豬的豬血統(tǒng)；
第五階段：
分別以第4世代豬核心群中的公、母豬交配，以第5世代豬核心群心群中的公、母豬交配，從第4世代開始分別采用群體閉鎖繁殖和選育，進(jìn)行2～3個(gè)世代的橫交，在橫交各代豬中用分子標(biāo)記和綜合選擇指數(shù)方法選留公豬和母豬，得到橫交各代豬核心群。同一世代公豬與母豬交配，每個(gè)世代選留母豬和公豬，進(jìn)行2～3個(gè)世代的橫交后，得到抗大腸桿菌F4ac感染的新品系豬。
可以理解的是，該種培育方法顯著提高種群斷奶仔豬的抗腹瀉病能力，大大減少仔豬死亡率。該種培育方法培育的豬既有抗大腸桿菌F4ac感染的豬的優(yōu)點(diǎn)，又有引入豬品種的生長快、瘦肉率高等特點(diǎn)。提高了養(yǎng)豬出欄率的同時(shí)，提升了商品豬質(zhì)量，降低了經(jīng)濟(jì)成本，保證了經(jīng)濟(jì)效益。
需要理解的是，由于選擇指數(shù)法具有很大的優(yōu)越性，因而迅速地在理 論和方法上成熟起來，從一般的綜合選擇指數(shù)發(fā)展為約束選擇指數(shù)、最宜選擇指數(shù)、綜合育種值估計(jì)以及通用選擇指數(shù)等，因而成為多性狀選擇重要的方法。由于選擇的性狀不同、運(yùn)用時(shí)期不同以及性狀權(quán)重不同等眾多因素的影響，所制定的綜合選擇指數(shù)千差萬別。
可以理解的是，豬只屠宰后，取小腸空腸部分，提取小腸上皮細(xì)胞刷狀緣，利E.coliF4ac菌株黏附豬小腸上皮細(xì)胞刷狀緣，通過相差顯微鏡檢測細(xì)菌的黏附結(jié)果。每個(gè)樣品檢測20個(gè)以上的刷狀緣，若有10％以上的刷狀緣上至少有2個(gè)細(xì)菌黏附，判該樣品為黏附型，若至少有2個(gè)細(xì)菌黏附的刷狀緣不到10％，但有1～2個(gè)細(xì)菌黏附的刷狀緣多于10％，判該樣品為弱黏附型，否則判為不黏附型。
再者，眼肌面積，指家畜背最長肌的橫斷面面積。由于眼肌面積性狀與家畜產(chǎn)肉性能有強(qiáng)相關(guān)關(guān)系，所以在育種上顯得尤為重要。眼肌面積計(jì)算方法有多種，即公式法、求積儀法、圖像法和坐標(biāo)紙法等，其中公式法最為簡便易行。目前，在豬的屠宰測定上普遍采用高×寬×系數(shù)0.7＝眼肌面積，大大簡化了眼肌面積的計(jì)算。
其次，背膘厚表示豬脂肪多少，背膘厚度越厚廋肉率越低；相反，則廋肉率高。我國現(xiàn)背膘厚的測量大部分單位取三點(diǎn)測量，即肩胛后沿、最后肋處及腰薦接合處距背正中線4厘米處作為膘厚和眼肌厚的測量點(diǎn)，而后取三點(diǎn)平均值。也有人僅作10～11肋間距背正中線4厘米處測量。
需要理解的是，不同階段綜合選擇指數(shù)如下：
斷奶綜合選擇指數(shù)＝斷奶個(gè)體重×40％/斷奶體重均值+同窩活仔數(shù)×60％/活仔數(shù)均值。
4月齡綜合選擇指數(shù)＝斷奶綜合選擇指數(shù)×20％+4月齡個(gè)體重×50％/體重均值+體長×30％/體長均值。
6月齡綜合選擇指數(shù)＝4月齡綜合選擇指數(shù)×20％+個(gè)體6月齡個(gè)體重×50％/體重均值+6～7肋背膘厚×30％/6～7肋背膘厚均值。
可以理解的是，豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)：從屠宰場收集豬的卵巢置于37℃生理鹽水中，2小時(shí)內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。采用帶有18號針頭的10ml一次性注射器采集3～6mm卵泡中的卵泡液并放入15ml離心管中，靜止10分鐘后棄去上清，用采卵液(名稱PVA-TL-HEPES，配方：稱取聚乙烯醇0.1g，NaCl 6.6633g，KCl 0.2386g，NaH2PO4 0.0408g，NaHCO3 0.168g，羥乙基哌嗪乙硫磺酸Hepes 2.383g，酚紅0.0022g，山梨醣醇2.186g，丙酮酸鈉0.022g，乳酸鈉1.868ml，青霉素G0.065g，硫酸鏈霉素0.025g，MgCl2·6H2O 0.1017g，CaCl2·2H2O 0.294g，用雙蒸水定容至100ml，并將pH調(diào)至7.4洗兩遍。在顯微鏡下挑選形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)均勻，外圍有3～5層卵丘細(xì)胞緊密包裹的卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體(簡稱COCs)置于38.5℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42～44小時(shí)，隨后用透明質(zhì)酸酶消化，吹打成裸卵，以第一極體排出為豬卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)準(zhǔn)。豬卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液配方：基礎(chǔ)培養(yǎng)液為培養(yǎng)基Medium199(購自Gibco公司)，在其中添加10％(體積比)豬卵泡液(PFF)，0.1％聚乙烯醇(PVA)30mM NaHCO3，10μg/ml慶大霉素(Gentamicin)，3.05mM D-葡萄糖(D-Glucose)，0.91mM丙酮酸鈉(Na-pyruvate)，0.07g/L L-胱氨酸鹽酸鹽(L-cystine)，12.5ng/ml表皮生長因子(EGF 10IU/ml促黃體生成素(LH)，10IU/ml促卵泡生成素(FSH)。
將豬的卵母細(xì)胞置于顯微操作盤工作滴中，隨后將固定針(Holder)固定住卵母細(xì)胞，注射針(injection)針尖快速刺破透明帶后收針，輕柔地破開細(xì)胞膜，然后緩慢回針，使針口正對極體且位于透明帶間隙內(nèi)，緩緩吸取1/5-1/4的細(xì)胞質(zhì)并同時(shí)吸走極體，沿橫軸方向快速出針，迅速推動(dòng)油壓泵，使吸取物順著透明帶涌出。利用胰酶將用于移核的細(xì)胞消化并置于顯微操 作盤中，將顯微操作針調(diào)節(jié)到最佳位置，選取中等大小、活力較好的細(xì)胞約30～50個(gè)吸入injection中。Holder固定胚胎后，調(diào)節(jié)焦距，使胚胎與injection在同一平面，稍微給injection一點(diǎn)向外打細(xì)胞的力，待細(xì)胞將要出injection口的瞬間快速刺入卵母細(xì)胞卵周隙，等細(xì)胞進(jìn)入胚胎后迅速移出injection。
需要理解的是，重構(gòu)胚的融合與激活：將移核完畢的卵母細(xì)胞平鋪于加滿激活液(配方：0.3M甘露醇，0.5mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，1.0mM CaCl2·2H2O，0.1mM MgCl2·6H2O)的融合槽中(BTX，槽寬0.5mm或1mm)，電融合儀為BLS(CF-150B)。用針撥動(dòng)卵母細(xì)胞將卵母細(xì)胞與供體細(xì)胞接觸面垂直于場強(qiáng)方向，供體細(xì)胞面向正極方向。30min后觀察融合率，未融合的進(jìn)行二次融合。將融合后的卵母細(xì)胞放入38℃、5％CO2中培養(yǎng)，48h后達(dá)4-細(xì)胞期，6d后觀察重組囊胚的發(fā)育情況。
國外采用胴體探測儀測定離背中線6至8cm處倒數(shù)第三到第四肋間的背膘厚稱為邊膘厚。
進(jìn)一步的，所述第二階段的重構(gòu)胚胎具體過程為：將成熟的卵母細(xì)胞置于顯微操作盤工作滴中，隨后將固定針固定住卵母細(xì)胞，將注射針針口正對極體且位于透明帶間隙內(nèi)，緩緩吸取1/5-1/4的細(xì)胞質(zhì)并同時(shí)吸走極體，去除卵母細(xì)胞的細(xì)胞核，然后選取中等大小、活力較好的細(xì)胞注入卵母細(xì)胞卵周隙，最后采用電融合的方法形成重構(gòu)胚胎，融合電擊參數(shù)為1.3kv/mm、30us、2次脈沖，30min后觀察融合率，未融合的進(jìn)行二次融合，將融合后的卵母細(xì)胞放入38℃、5％CO2中培養(yǎng)，48h后觀察卵裂率，6d后觀察囊胚發(fā)育情況。
進(jìn)一步的，所述第二階段后還包括胚胎移植過程，具體為：當(dāng)重組胚胎體發(fā)育至2～4細(xì)胞期后，挑選形態(tài)和發(fā)育較好的胚胎進(jìn)行移植，每頭受 體移植150～250枚胚胎，共移植3～10頭母豬，胚胎移植后進(jìn)行B超妊娠檢測。
進(jìn)一步的，所述第五階段后還包括轉(zhuǎn)基因豬的鑒定的過程：小豬出生后采取耳朵與尾部組織提取基因組DNA，以此為模板進(jìn)行PCR、Real-time PCR和染色體步移方法來鑒定其陽性。
進(jìn)一步的，第一次選留在28日齡斷奶時(shí)進(jìn)行，且選擇被毛黑色，體重大于4kg，乳頭數(shù)7對及以上，體形勻稱，體質(zhì)好的母豬。
進(jìn)一步的，第二次選留時(shí)淘汰生長速度慢，體質(zhì)差的豬。
進(jìn)一步的，第三次選留時(shí)測定6月齡體重、背膘厚、計(jì)算斷奶后至90kg體重階段的日增重，料肉比，選擇日增重500g以上、料肉比小于3.2∶1的母豬留種。
進(jìn)一步的，第三次選留時(shí)選擇90kg時(shí)活體背膘厚20mm以下的母豬留種。
進(jìn)一步的，第三次選留時(shí)選擇眼肌面積大于25cm2的母豬留種。
進(jìn)一步的，豬種選自華南、華中、華北、江海、西南或高原型地方豬種中的任意一種。
申請人聲明，本發(fā)明通過上文所列出的一系列的詳細(xì)說明僅僅是針對本發(fā)明的可行性實(shí)施方式的具體說明，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程。并且即不意味著本發(fā)明應(yīng)依賴上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。