本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于改良培養(yǎng)基的五針白皮松組培快繁方法。

背景技術(shù)：

五針白皮松(Pinus squamata X.W.Li)是李鄉(xiāng)旺于上世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)的僅分布于我國云南省巧家縣的珍稀樹種(李鄉(xiāng)旺.云南松屬一新系一新種.云南植物研究，1992，14:259-260.)。天然狀態(tài)下該種僅存立木31株，其野外種群低于穩(wěn)定存活界限(野生株數(shù)≤5000株)，隨時有滅絕的危險，2008年被列入云南省極小種群物種，2010年云南省林業(yè)廳、云南省綠色環(huán)境發(fā)展基金會指導(dǎo)資助開展實施野外救護(hù)項目，且被列入全球100種最瀕危物種名錄。

五針白皮松干形優(yōu)美、生長較快、適應(yīng)力強(qiáng)、木材結(jié)構(gòu)細(xì)、紋理通直，具有很高的觀賞價值、經(jīng)濟(jì)價值和科研價值(朱寶華.五針白皮松的生態(tài)特性及生長過程.云南林業(yè)科技，1933，1:29-33.)。然而，由于上述推測的各種原因，五針白皮松正處于極度瀕危狀態(tài)。針對種源稀缺的問題，普通栽培技術(shù)難以達(dá)到五針白皮松種源大量繁殖的目的，所以采取一些快速繁殖的措施將有利于該物種的保護(hù)與利用。李桐森曾嘗試將五針白皮松嫁接在華山松和云南松的砧木上，并且在華山松上獲得較高的成活率與較好的長勢(李桐森，李鄉(xiāng)旺，毓偉.五針白皮松異砧嫁接試驗初報.西南林學(xué)院學(xué)報，1997，17:11-16.)，但是由于接穗數(shù)量少，采穗困難，以及嫁接技術(shù)本身存在的局限性，使得該方法的進(jìn)一步推廣仍存在問題。普曉蘭曾以五針白皮松種子為材料進(jìn)行離體胚培養(yǎng)，但是不定芽誘導(dǎo)率過低，僅為29％，不能滿足快繁要求(普曉蘭，林平，李鄉(xiāng)旺.五針白皮松離體培養(yǎng)初步研究.西南林學(xué)院學(xué)報，1997，17:17-20.)。

組織培養(yǎng)是近幾十年來應(yīng)用較為普遍的快繁與育苗技術(shù)。在林木組織培養(yǎng)快速繁殖中，通過器官發(fā)生方式產(chǎn)生再生植株是最成功的離體培養(yǎng)繁殖方式。松樹作為主要的造林樹種，其組培快繁技術(shù)在20世紀(jì)六、七十年代開始起步，并得到快速發(fā)展。針對云南白皮松現(xiàn)存株數(shù)極少，普通繁殖技術(shù)難以實現(xiàn)規(guī)模化育苗的現(xiàn)狀，基于組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)具有繁殖周期短，效率高，可整年進(jìn)行生產(chǎn)，節(jié)省材料，且能保持植物原有優(yōu)良性狀等優(yōu)勢，利用組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)仍然是擴(kuò)大五針白皮松種群的最佳方案。

然而，根據(jù)國內(nèi)外關(guān)于松樹組織培養(yǎng)育種方面的研究和探索的眾多報道，松樹組織培養(yǎng)快速繁殖育種技術(shù)仍然存在不定芽誘導(dǎo)困難、誘導(dǎo)苗增殖率低，增殖速度慢等技術(shù)性難題。而導(dǎo)致這系列困難存在的一個重要原因是目前所使用的普通松樹組培培養(yǎng)基營養(yǎng)成分不能使得松樹不定芽很好地增殖。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是在于提供一種基于改良培養(yǎng)基的五針白皮松組培快繁方法，對所使用的培養(yǎng)基添加成熟土豆泥和成熟香蕉泥為天然有機(jī)基質(zhì)的改良，從而促進(jìn)五針白皮松規(guī)?；敝秤N。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)。

一種基于改良培養(yǎng)基的五針白皮松組培快繁方法，其過程為：

步驟1，種子的滅菌消毒

將五針白皮松種子洗凈后，采用以下任意一種方法滅菌消毒：(1)先用75％的酒精消毒1min、無菌水沖洗兩次，再用2％次氯酸鈉溶液消毒15min、無菌水沖洗5次，吸干水分后備用；(2)先用酒精消毒1min、無菌水沖洗兩次，再用0.1％升汞溶液消毒10min、無菌水沖洗5次，吸干水分后備用；

步驟2，種胚萌發(fā)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲取組培苗

(1)獲取種胚：將所述步驟1中滅菌消毒后的種子在超凈臺上，在無菌條件下吸干水分后剝種殼，獲取種胚；

(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)種胚：將處理后的種胚接種到1/3GD改良誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在24-26℃條件下暗培養(yǎng)4-7天；待種仁萌發(fā)后在26-28℃條件下光照培養(yǎng)25-30天，平均每天光照12小時，光照強(qiáng)度為1500-2000lux，使誘導(dǎo)培養(yǎng)的苗長至4-6cm，并且伴有側(cè)芽萌發(fā)，即為初代誘導(dǎo)的組培苗；

步驟3，組培苗增殖培養(yǎng)

將所述步驟2初代誘導(dǎo)的增殖苗切割分株后接種于GD改良培養(yǎng)基上，于26-28℃條件下培養(yǎng)20-25天為繼代增殖苗，平均每天光照14小時，光照強(qiáng)度為3000-3500lux；

步驟4，增殖苗壯苗培養(yǎng)

將所述步驟3的繼代增殖苗切割分株后接種于MS改良培養(yǎng)基上，在26-28℃條件下培養(yǎng)10-15天，平均每天光照14小時，光照強(qiáng)度為3000-3500lux；

步驟5，增殖苗生根誘導(dǎo)培養(yǎng)

將所述步驟4壯苗培養(yǎng)后的增殖苗分株接種于1/2MS改良培養(yǎng)基，在26-28℃條件下培養(yǎng)20-25天，平均每天光照14小時，光照強(qiáng)度為3000-3500lux；

步驟6，生根苗的練苗培養(yǎng)

包含兩階段：第一階段將生根苗連同組培瓶一起放到大棚內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25-28℃，光照為大棚內(nèi)非太陽直接照射的自然光，培養(yǎng)時間為7-14天；第二階段將瓶苗移栽到經(jīng)過消毒處理的練苗土壤中，培養(yǎng)溫度為25-28℃，光照為大棚內(nèi)非太陽直接照射的自然光，培養(yǎng)30-50天，即可。

所述步驟2中1/3GD改良誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/3GD+土豆1％+香蕉1％+蔗糖20.0g/L+瓊脂5.0g/L+6-BA 0.1-0.5mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L。

所述步驟3中GD改良培養(yǎng)基為GD+土豆1％+香蕉1％+蔗糖20.0g/L+瓊脂5.0g/L+6-BA 0.5-2.0mg/L+NAA 0.1mg/L。

所述步驟4中MS改良培養(yǎng)基為MS+土豆1％+香蕉1％+蔗糖20.0g/L+瓊脂5.0g/L+6-BA 0.1-1.0mg/L+NAA 0.5mg/L。

所述步驟5中1/2MS改良培養(yǎng)基為1/2MS+土豆1％+香蕉1％+蔗糖20.0g/L+瓊脂5.0g/L+6-BA 0.1mg/L+NAA 1.0-5.0mg/L。

本發(fā)明方法的有益效果為：

(1)本發(fā)明的改良培養(yǎng)基含有更豐富的植物生長所必須的碳源、氮源和其他微量營養(yǎng)元素，從而使得五針白皮松不定芽和植株更容易增殖，并且植株長勢良好；

(2)本發(fā)明方法操作步驟簡便，培養(yǎng)周期短，所培養(yǎng)的五針白皮松種苗質(zhì)量良好，可以運用于五針白皮松的產(chǎn)業(yè)化繁殖育種。

附圖說明

圖1表示不同濃度水平的6-BA和NAA對五針白皮松種胚不定芽的誘導(dǎo)出芽率；

圖2表示不同濃度水平的6-BA對五針白皮松不定芽和植株增殖的影響；

圖3表示不同濃度水平的NAA對五針白皮松植株誘導(dǎo)生根的影響。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于這些實施例。

實施例1

(1)改良培養(yǎng)基的配制

將去皮土豆切小塊或片，用100倍體積蒸餾水煮爛，然后將成熟香蕉切碎混入其中，再用勻漿機(jī)將其充分打碎為混合泥，將處理好的混合泥分別添加到GD基本培養(yǎng)基或MS基本培養(yǎng)基中，使1/3GD改良誘導(dǎo)培養(yǎng)基、GD改良培養(yǎng)基、1/2MS改良培養(yǎng)基和MS改良培養(yǎng)基中成熟土豆泥和成熟香蕉泥的比例均為1％。

(2)種子的選擇

種子選?。毫挤N系五針白皮松優(yōu)種子采集于云南省昭通市巧家縣藥山國家自然保護(hù)區(qū)，采集時間為2015年3月份。

(3)種子的滅菌消毒

將五針白皮松種子洗凈后，先用75％的酒精消毒1min、無菌水沖洗兩次，再用2％次氯酸鈉溶液消毒15min、無菌水沖洗5次，吸干水分后備用。

(4)種仁萌發(fā)誘導(dǎo)

獲取種胚：將滅菌消毒后的種子在超凈臺上，在無菌條件下吸干水分后剝種殼，獲取種胚。

表1

誘導(dǎo)培養(yǎng)種胚：將處理后的種胚接種到1/3GD改良誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，其中：6-BA濃度為0.2mg/L，NAA濃度為0.2mg/L，在24-26℃條件下暗培養(yǎng)4-7天；待種仁萌發(fā)后在26-28℃條件下光照培養(yǎng)25-30天，平均每天光照12小時，光照強(qiáng)度為1500-2000lux，使誘導(dǎo)培養(yǎng)的苗長至4-6cm，并且伴有側(cè)芽萌發(fā)，即為初代誘導(dǎo)的組培苗。參照圖1，本實施例的不定芽誘出率為75％。其中，1/3GD培養(yǎng)基的具體配方見表1。

(5)組培苗增殖培養(yǎng)

將初代誘導(dǎo)的增殖苗切割分株后接種于GD改良培養(yǎng)基上，6-BA濃度為0.5mg/L，NAA濃度為0.1mg/L，于26-28℃條件下培養(yǎng)20-25天為繼代增殖苗，平均每天光照14小時，光照強(qiáng)度為3000-3500lux。參照圖2，相對較低濃度的6-BA不能使不定芽明顯增殖，增殖率僅為200％。其中，GD培養(yǎng)基的具體配方見表2。

表2

(6)增殖苗壯苗培養(yǎng)

將繼代增殖苗切割分株后接種于MS改良培養(yǎng)基上，6-BA濃度為0.1mg/L,NAA濃度為0.5mg/L，在26-28℃條件下培養(yǎng)10-15天，平均每天光照14小時，光照強(qiáng)度為3000-3500lux。其中，MS培養(yǎng)基的具體配方見表3。

表3

(7)增殖苗生根誘導(dǎo)培養(yǎng)

將壯苗培養(yǎng)后的增殖苗分株接種于1/2MS改良培養(yǎng)基，細(xì)胞分裂素6-BA濃度為0.1mg/L,生長素NAA濃度為2.0mg/L，在26-28℃條件下培養(yǎng)20-25天，平均每天光照14小時，光照強(qiáng)度為3000-3500lux。參照圖3，植株生根率為65％，相對較低。其中，1/2MS培養(yǎng)基的具體配方見表4。

表4

(8)生根苗的練苗培養(yǎng)

第一階段將生根苗連同組培瓶一起放到大棚內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25-28℃，光照為大棚內(nèi)非太陽直接照射的自然光，培養(yǎng)時間為7-14天；第二階段將瓶苗移栽到經(jīng)過消毒處理的練苗土壤中，培養(yǎng)溫度為25-28℃，光照為大棚內(nèi)非太陽直接照射的自然光，培養(yǎng)30-50天即可。

實施例2

(1)改良培養(yǎng)基的配制

改良培養(yǎng)基的配制方法同實施例1。

(2)種子的選擇

種子選取同實施例1。

(3)種子的滅菌消毒

先用酒精消毒1min、無菌水沖洗兩次，再用0.1％升汞溶液消毒10min、無菌水沖洗5次，吸干水分后備用。

(4)種仁萌發(fā)誘導(dǎo)

獲取種胚：獲取種胚方法同實施例1；

誘導(dǎo)培養(yǎng)種胚：將處理后的種胚接種到含0.4mg/L 6-BA和0.4mg/L NAA的1/3GD改良培養(yǎng)基中，在24-26℃條件下暗培養(yǎng)4-7天；待種仁萌發(fā)后在26-28℃條件下光照培養(yǎng)25-30天，平均每天光照12小時，光照強(qiáng)度為1500-2000lux，使誘導(dǎo)培養(yǎng)的苗長至4-6cm，并且伴有側(cè)芽萌發(fā)，即為初代誘導(dǎo)的組培苗。1/3GD培養(yǎng)基的具體配方同實施例1。參照圖1，6-BA與NAA濃度水平為最適水平，不定芽誘出率可達(dá)94％。

(5)組培苗增殖培養(yǎng)

將初代誘導(dǎo)的增殖苗切割分株后接種于GD改良培養(yǎng)基上，細(xì)胞分裂素6-BA濃度為1.2mg/L和生長素NAA濃度為0.1mg/L，于26-28℃條件下培養(yǎng)20-25天為繼代增殖苗，平均每天光照14小時，光照強(qiáng)度為3000-3500lux。GD培養(yǎng)基的具體配方同實施例1。參照圖2，隨著細(xì)胞分裂素濃度的升高，植株增殖率迅速升高且可達(dá)500％。

(6)增殖苗壯苗培養(yǎng)

增殖苗壯苗培養(yǎng)同實施例1。

(7)增殖苗生根誘導(dǎo)培養(yǎng)

將壯苗培養(yǎng)后的增殖苗分株接種于1/2MS改良培養(yǎng)基，細(xì)胞分裂素6-BA濃度為0.1mg/L，生長素NAA濃度為3.0mg/L，在26-28℃條件下培養(yǎng)20-25天，平均每天光照14小時，光照強(qiáng)度為3000-3500lux。1/2MS培養(yǎng)基的具體配方同實施例1。參照圖3，此濃度的生長素生根率可達(dá)92％，是本發(fā)明中的最適濃度水平。

(8)生根苗的練苗培養(yǎng)

生根苗的練苗培養(yǎng)同實施例1。

實施例3

(1)改良培養(yǎng)基的配制

改良培養(yǎng)基的配制同實施例1。

(2)種子的選擇

種子選取同實施例1。

(3)種子的滅菌消毒

種子的滅菌消毒同實施例2。

(4)種仁萌發(fā)誘導(dǎo)

獲取種胚：獲取種胚方法同實施例1；

誘導(dǎo)培養(yǎng)種胚：將處理后的種胚接種到含0.5mg/L 6-BA和0.5mg/L NAA的1/3GD改良誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在24-26℃條件下暗培養(yǎng)4-7天；待種仁萌發(fā)后在26-28℃條件下光照培養(yǎng)25-30天，平均每天光照12小時，光照強(qiáng)度為1500-2000lux，使誘導(dǎo)培養(yǎng)的苗長至4-6cm，并且伴有側(cè)芽萌發(fā)，即為初代誘導(dǎo)的組培苗。1/3GD培養(yǎng)基的具體配方同實施例1。參照圖1，繼續(xù)升高細(xì)胞分裂素和生長素濃度水平對不定芽誘出率沒有提高。

(5)組培苗增殖培養(yǎng)

將初代誘導(dǎo)的增殖苗切割分株后接種于GD改良培養(yǎng)基上，6-BA濃度為2.0mg/L和NAA濃度為0.1mg/L，于26-28℃條件下培養(yǎng)20-25天為繼代增殖苗，平均每天光照14小時，光照強(qiáng)度為3000-3500lux。GD培養(yǎng)基的具體配方同實施例1。參照圖2，1.6-2.2mg/L是6-BA濃度的最適水平，這個水平濃度可使植株增殖率高達(dá)700％。

(6)增殖苗壯苗培養(yǎng)

增殖苗壯苗培養(yǎng)同實施例1。

(7)增殖苗生根誘導(dǎo)培養(yǎng)

將壯苗培養(yǎng)后的增殖苗分株接種于1/2MS改良培養(yǎng)基，6-BA濃度為0.1mg/L和NAA濃度為5.0mg/L，在26-28℃條件下培養(yǎng)20-25天，平均每天光照14小時，光照強(qiáng)度為3000-3500lux。1/2MS培養(yǎng)基的具體配方同實施例1。參照圖3，用相對較高濃度的NAA，植株的生根率沒有提高，反而有下降的趨勢，生根率為85％。

(8)生根苗的練苗培養(yǎng)

生根苗的練苗培養(yǎng)同實施例1。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳案例，并不對本發(fā)明做出任何限制，凡是針對本發(fā)明技術(shù)內(nèi)容對以上實施案例所做的任何簡單修改、變更、模仿均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。