本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)的器官組織深低溫凍存領(lǐng)域，公開了在器官組織深低溫凍存前后，使用間充質(zhì)干細胞及其分泌產(chǎn)物灌注，從而達到減少細胞凋亡、降低冰晶對細胞膜損害的一種預(yù)處理和后處理的方法。

背景技術(shù)：

器官移植是治療嚴(yán)重器官衰竭的最終手段，但是供體捐獻和受體準(zhǔn)備總是存在時間和空間的差異，因此，進一步開發(fā)更安全長效的器官冷凍保存——復(fù)蘇方法成了亟待解決的問題。

生物組織的冷凍凍存過程包括冷凍保護劑的灌注、程控降溫，深低溫儲存，復(fù)蘇解凍及冷凍保護劑的置換清洗。每個步驟都影響著冷凍后器官中細胞的存活率及組織結(jié)構(gòu)功能的保持。1972年，Mazur等首先從中國倉鼠組織培養(yǎng)細胞低溫凍存的實驗中，提出冷凍損傷的兩因素假說。一是溶質(zhì)損傷效應(yīng)，是指冷卻速度過慢，導(dǎo)致細胞外溶質(zhì)濃度升高。二是機械損傷效應(yīng)，是指冷卻速度過快，細胞內(nèi)形成冰晶直接損傷細胞的膜結(jié)構(gòu)。

為了降低凍存對細胞的破壞，現(xiàn)在多使用玻璃化凍存，使液體粘稠度提高，在冷凍固化過程中減少內(nèi)部晶體形成。溶液實現(xiàn)玻璃化主要靠提高冷卻速率和增加溶液濃度，這就需要使用冷凍保護劑。但是，冷凍保護劑本身也會對細胞造成損傷，高濃度保護劑會對細胞和組織形成毒性作用，而在復(fù)溫后洗脫的過程中還會造成細胞膜內(nèi)外的滲透壓差，形成滲透損傷。因此，當(dāng)今深低溫研究的重點就在于減少玻璃化過程中冷凍保護劑的損害。現(xiàn)有實驗的方向主要有改善導(dǎo)入和洗脫方式，使用“連續(xù)導(dǎo)入法”；加快保護劑滲透的“負壓浸漬技術(shù)”；使用不同種類冷凍保護劑使其相互稀釋的復(fù)配技術(shù)。但是，冷凍保護劑除了自身特性外，在不同細胞組織中的保護和毒性作用也不盡相同。而器官并不是多種細胞的簡單集合，作為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的復(fù)合組織，其降溫過程中各部分溫度分布不均勻?qū)е碌睦鋮s速率的差異和各種細胞對冷凍保護劑的敏感性不同使其低溫凍存的難度大為增加。因此，尋找新的組織細胞冷凍保護方法及修復(fù)損傷的方法極為重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種在冷凍凍存器官過程中，應(yīng)用臍帶間充質(zhì)干細胞及其條件培養(yǎng)基進行組織內(nèi)預(yù)灌注和后灌注的方法，可有效的提高組織的自我修復(fù)能力，有效提高復(fù)蘇后組織內(nèi)活細胞的比例，使組織器官在復(fù)溫后更好的恢復(fù)功能。

本發(fā)明涉及的器官深低溫凍存方法，包括以下步驟：

1) 將待冷凍的器官連接預(yù)冷至4℃的梯度濃度混合程控降溫器官灌注儀，灌注25℃恒溫的間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基，灌注時間為30-60 min；

所述間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基為傳代5代內(nèi)脂肪、臍帶、臍血或骨髓中的一種的間充質(zhì)干細胞，在傳代后24h后長到70~80%匯合，更換無血清間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基，48h后收集的培養(yǎng)上清，經(jīng)1000~3000g離心10~30min，取上清后使用0.1μm~0.22μm微孔濾膜過濾后所得；

2）然后向器官灌注預(yù)冷至4℃的冷凍保護劑，灌注時長30min；

3）將處理完畢的器官放入冷凍袋，封口后置于程控降溫儀中，按照設(shè)定降溫程序進行程序化降溫，待其溫度降至-80℃后投入液氮中存放；

所述程控降溫儀降溫程序設(shè)定為①4℃平衡，②以1℃/min的速度降至0℃，并保持10min，③以2℃/min的速度降至-18℃，保持15min，④以2℃/min速度降至-45℃，保持15min，⑤再以5℃/min的速度降至-90℃，保持5min；

4）復(fù)蘇器官時，將凍存器官自液氮取出后置于37℃水浴中，不斷搖動；

5）完全融化后再次進行灌注，灌注液為12-25℃的含間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基，灌注時間為30min-60min；

處理完成的器官可直接進行移植。

所述間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基，細胞密度為1x10⁷/L，灌注速度為1.5ml/min。

本發(fā)明提供的這種低溫凍存器官的處理方法，在器官待冷凍前使用干細胞條件培養(yǎng)基灌注，提高了組織細胞的生存狀態(tài)，增加了抗凋亡能力，減少了細胞在離體后發(fā)生的氧化應(yīng)激損傷；在復(fù)蘇后立即使用含鮮活間充質(zhì)干細胞的完全培養(yǎng)基進行后灌注處理，對凍存過程中受到冷凍保護劑毒性和滲透損傷的細胞進行主動修復(fù)，可有效減少細胞凋亡比率，減少組織結(jié)構(gòu)的破壞。

附圖說明

圖1. 為本發(fā)明提供的器官深低溫凍存方法流程圖；

圖2. 腎動脈插管及結(jié)扎固定；

圖3. 各組標(biāo)本HE染色結(jié)果；

A為新鮮大鼠腎臟石蠟切片HE染色(40×)；

B為新鮮大鼠腎臟石蠟切片HE染色(200×)；

C為凍存對照組大鼠腎臟石蠟切片HE染色(40×)；

D為凍存對照組大鼠腎臟石蠟切片HE染色(200×)；

E為MSC灌注組大鼠腎臟石蠟切片HE染色(40×)；

F為MSC灌注組大鼠腎臟石蠟切片HE染色(200×)；

圖4. 各實驗組大鼠腎臟腎小管paller氏評分；

圖5. 各組標(biāo)本TUNEL染色結(jié)果；

A,B. 新鮮大鼠腎臟石蠟切片TUNEL染色(200×)；

C,D. 凍存對照組大鼠腎臟石蠟切片TUNEL染色(200×)；

E,F. MSC灌注組大鼠腎臟石蠟切片TUNEL染色(200×)。

具體實施方式

為明確本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點，下面以大鼠腎臟為例，對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整的描述。

實施例1

大鼠腎臟的凍存及復(fù)蘇

取培養(yǎng)至第4-6代的脂肪間充質(zhì)干細胞，傳代后換新鮮培養(yǎng)基，48h后收集培養(yǎng)上清待用。

選取8-12周齡SD大鼠，腹腔注射水合氯醛麻醉。打開腹腔，取其腎臟，注意保持腎動脈及靜脈結(jié)構(gòu)完整。

將取出腎臟置于4℃生理鹽水中沖洗，后置于同樣預(yù)冷的干細胞條件培養(yǎng)基。

通過腎動脈插管并行絲線固定，結(jié)扎腎動脈分支后與預(yù)冷至4℃的程控降溫器官灌注儀相連，啟動定量進液泵，以1.5ml/min的速率向腎臟灌注干細胞條件培養(yǎng)基，時間60min（圖2）。

灌注液換為冷凍保護劑，以同樣方式進行灌注。

將灌注完畢的腎臟裝入冷凍袋，置于程序降溫儀中，程序設(shè)定為①4℃平衡，②以1℃/min的速度降至0℃，并保持10min，③以2℃/min的速度降至-18℃，保持15min，④以2℃/min速度降至-45℃，保持15min，⑤再以5℃/min的速度降至-90℃，保持5min。隨后將凍存袋投入液氮。

凍存一周后，將凍存腎臟取出，置于37℃水浴融化，時刻搖動使溫度分布均勻。

將培養(yǎng)至第4-6代的脂肪間充質(zhì)干細胞使用胰酶消化，使用預(yù)冷至4℃的條件培養(yǎng)基重懸調(diào)整細胞濃度為1×10⁷/L。

器官在水浴中完全融化后移入干細胞條件培養(yǎng)基，再次將腎動脈插管與灌注儀連接，使用步驟8所述干細胞懸液進行灌注，以1.5ml/min的速率進行30min。

實施例2

凍存器官復(fù)蘇后活性的測定

在凍存實驗中將大鼠腎臟分為三組，分別為：

新鮮組：取大鼠腎臟后立即固定于4%多聚甲醛，不經(jīng)凍存。

對照組：按照一般凍存方法不經(jīng)干細胞處理凍存。

實驗組：按照本發(fā)明所述方法進行凍存。

在凍存一周后復(fù)蘇各組器官，對其結(jié)構(gòu)的完整性和細胞活性進行測定。

形態(tài)學(xué)分析

組織石蠟切片的制作

石蠟包埋及切片：將各組腎臟通過腎動脈沿冠狀面切開，將其中一半組織置于4%多聚甲醛中進行固定。另一半組織用于分子生物學(xué)檢測。固定組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋制作石蠟組織塊，在石蠟切片機上進行冠狀連續(xù)切片，厚度為4um。

蘇木素-伊紅染色（HE染色）

脫蠟水化：將石蠟切片60℃烤片30min后依次投入二甲苯20min×2，無水乙醇10min×2,95%乙醇5min×2,90%乙醇5min，80%乙醇5min，70%乙醇5min，PBS 5min×3.

染色分化：將切片浸入蘇木素染液染色10min，滴1%鹽酸酒精溶液5s,自來水沖洗反藍10min。

復(fù)染：浸入0.5%伊紅染液2-5min，PBS沖洗10min。

脫水封片:常規(guī)梯度乙醇脫水，將染色完成的切片浸入80%乙醇5min，90%乙醇5min，95%乙醇10min×2,無水乙醇10min×2，二甲苯10min×2，中性樹膠封片。

光鏡下觀察拍照。

形態(tài)學(xué)分析：

I. 凍存復(fù)蘇后對照及MSC灌注組腎臟可見腎皮質(zhì)區(qū)出現(xiàn)近端腎小管急性變性、壞死為主要特征的病理改變；腎小管上皮細胞刷狀緣脫落，細胞扁平，腎小管管腔擴張，部分細胞空泡變性及腫脹破裂，胞核濃縮、破裂甚至消失，部分基底膜裸露或不完整，管腔內(nèi)可見脫落的上皮細胞，多處小管管腔內(nèi)充滿細胞碎屑，管腔狹窄或阻塞，彌漫間質(zhì)水腫。腎小球無明顯病理變化（圖3）。

II. 對腎小管損傷進行paller氏評分：每個標(biāo)本選擇10個高倍鏡視野，對病變最嚴(yán)重的10個腎小管進行評分，共計數(shù)100個有病變的腎小管，評分標(biāo)準(zhǔn)：腎小管明顯擴張、腎小管上皮細胞扁平1分；刷狀緣脫落分；腎小管上皮細胞空泡變性1-2分；間質(zhì)水腫1分；管腔梗阻或管型1-2分；腎小管上皮細胞壞死1-2分；腎小管上皮細胞膜囊泡形成1-2分。

腎小管損傷Paller氏評分結(jié)果，對照組和實驗組顯示凍存過程中腎小管有損傷，但是本發(fā)明方法處理實驗組評分低于凍存對照組（圖4）。

檢測

① 脫蠟水化過程如前所述

② 將切片浸入3%雙氧水室溫孵育10min。PBS沖洗2min×3；

③ 將切片浸入含10μg/L蛋白酶K的100mM Tris/HCl中，37℃消化20min，PBS沖洗5min×3；

④ 甩去切片上多余液體，滴加100μlTUNEL反應(yīng)溶液。陰性對照使用蒸餾水替代TdT酶。37℃避光孵育60min；

⑤ PBS沖洗5min×3，將DAPI染色液與水性封片劑混合后封片；

⑥ 鏡下觀察，每張切片隨機取5個視野拍照并對凋亡細胞數(shù)進行評價。

細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：I期的細胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；IIa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；IIb期的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。凋亡細胞經(jīng)TUNEL染色后在激光顯微鏡下觀察呈綠色。

結(jié)果顯示本發(fā)明方法處理組器官凋亡細胞少于對照組（圖5）。