一種鑒定eb病毒對(duì)淋巴瘤的誘發(fā)性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種鑒定EB病毒對(duì)淋巴瘤的誘發(fā)性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]EB病毒(Epstein-Barr virus, EB病毒)是最早發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤病毒，IARC(Internat1nal Agency for Research on Cancer)已將其列為I類致癌物。在目前的現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查、病例對(duì)照研究、病原體檢測(cè)和體外轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，都給出了感染EB病毒與產(chǎn)生淋巴瘤可能相關(guān)的提示信息，但要真正確定淋巴瘤的致瘤因素及EB病毒的致瘤危險(xiǎn)性，還應(yīng)當(dāng)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。由于EB病毒易感宿主僅限于人和棉頂狨猴，小鼠雖然是理想的模式實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但是其不能被EB病毒感染，因此，迄今為止，還沒有真正合適的用于研究EB病毒感染和腫瘤發(fā)生的關(guān)系的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，并且，在目前所有對(duì)EB病毒致瘤性的研究中，還沒有一種鑒定方法能準(zhǔn)確、可靠地證實(shí)EB病毒感染對(duì)淋巴瘤的產(chǎn)生存在誘導(dǎo)作用(現(xiàn)有的鑒定方法都只能說明淋巴瘤的產(chǎn)生可能與感染EB病毒相關(guān)聯(lián)，但是并不能可靠、令人信服地證明EB病毒對(duì)淋巴瘤具有誘發(fā)性)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種能準(zhǔn)確、可靠地鑒定B病毒對(duì)淋巴瘤的誘發(fā)性的方法。
[0004]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:一種鑒定EB病毒對(duì)淋巴瘤的誘發(fā)性的方法，包括以下步驟:
第I步，建立EB病毒誘發(fā)正常人淋巴細(xì)胞發(fā)生腫瘤的動(dòng)物模型及從所述動(dòng)物模型中獲取腫瘤組織:
1.1.N0D/SCID小鼠的準(zhǔn)備；
將3-4周齡的N0D/SCID小鼠在SPF級(jí)環(huán)境中單只分籠飼養(yǎng)5_10天，將用于飼養(yǎng)所述N0D/SCID小鼠的飲用水、墊料、籠具均經(jīng)高壓蒸汽滅菌，飼養(yǎng)期間，給所述N0D/SCID小鼠投放全價(jià)鼠飼料，讓其自由進(jìn)食及飲水；
1.2.人淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備；
從健康獻(xiàn)血員的外周靜脈中采血，從采集到的外周靜脈血中分離出PBL，并用免疫酶標(biāo)方法檢測(cè)獻(xiàn)血者血清中EB病毒殼抗原VCA-1gG和VCA-1gA的抗體滴度；
1.3.EB病毒的準(zhǔn)備；
體外培養(yǎng)B95_8細(xì)胞，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后調(diào)整細(xì)胞濃度至10 6_7個(gè)/ml，再將其置于溫度37°C，二氧化碳濃度為5%的培養(yǎng)箱中饑餓7-10天，然后收集培養(yǎng)液，并將收集到的培養(yǎng)液在4°C環(huán)境下離心30 min，離心速度為4000 rpm/min，離心完成后吸取全部上清液，最后將所述上清液經(jīng)0.45 um微孔濾膜過濾后置于_80°C低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> 1.4.構(gòu)建hu-PBL/SCID嵌合體小鼠； 在無(wú)菌條件下給每只NOD/SCID小鼠腹腔注射PBL含量為8 X 17至1X 10 7個(gè)/ml的人PBL懸液I ml，剩余PBL懸液留存?zhèn)溆茫?br> 1.5.EB病毒注射；
對(duì)于接受VCA-1gG和VCA-1gA均為陽(yáng)性的獻(xiàn)血員的淋巴細(xì)胞移植的NOD/SCID小鼠，不再給其注射EB病毒懸液，對(duì)于接受VCA-1gA為陰性的獻(xiàn)血員的淋巴細(xì)胞移植的NOD/SCID小鼠，在該NOD/SCID小鼠接受淋巴細(xì)胞移植后第三天，往該NOD/SCID小鼠腹腔注射0.4 ml由步驟1.3得到的EB病毒懸液；
1.6.腫瘤組織的獲??；
將步驟1.5中被EB病毒感染后的NOD/SCID小鼠處死，從處死后的NOD/SCID小鼠體內(nèi)取出腫瘤組織，一部分用液氮凍存，其余的用10%福爾馬林固定；
第2步，鑒定步驟1.6中獲取的腫瘤的誘發(fā)源及該腫瘤的基因特性:
2.1.腫瘤組織病理學(xué)檢查及免疫組織化學(xué)染色；
取步驟1.6中已固定的誘發(fā)性腫瘤標(biāo)本，石蠟包埋切片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察，確診病變情況，免疫組織化學(xué)染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化酶法，檢測(cè)抗原包括:
人類白細(xì)胞共同抗原:LCA ；
B 細(xì)胞標(biāo)記:CD20、CD79a ；
T 細(xì)胞標(biāo)記:CD3、CD45RO ；
2.2.原位分子雜交檢測(cè)腫瘤組織中EBER ；
2.3.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)腫瘤組織中LMP-1的表達(dá)；
以GADPH基因?yàn)閮?nèi)參，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)并比較移植前正常淋巴細(xì)胞與誘發(fā)性腫瘤組織中EB病毒LMP-1的表達(dá)差異；
2.4.PCR擴(kuò)增檢測(cè)人特異性Alu序列；
提取誘發(fā)性腫瘤組織的DNA，應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增221 bp的人特異性Alu序列，PCR反應(yīng)方式為:
2.4.1.先 95°C預(yù)變性 5 min ；
2.4.2.再經(jīng) 94°C變性 I min、57°C退火 I min、72°C延伸 I min ；
對(duì)上述步驟2.4.2循環(huán)30次，再72°C延伸5 min,最后將PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳觀察，用凝膠成像系統(tǒng)成像；
2.5.PCR分析誘發(fā)性腫瘤組織的IgH基因重排；
石蠟包埋腫瘤組織切片至6 um厚，依照DNA FFPE Tissue Kit操作步驟，提取腫瘤組織切片中的基因組DNA，接著以臨床病理學(xué)確診為淋巴瘤的組織標(biāo)本作為單克隆對(duì)照，以反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)標(biāo)本作為多克隆對(duì)照，采用B1MED-2引物系統(tǒng)及PCR儀擴(kuò)增人免疫球蛋白重鏈基因片段，PCR反應(yīng)方式為:
2.5.1.先 95°C預(yù)變性 7 min ；
2.5.2.再 95°C 變性 45s、60°C 退火 45s、72°C 延伸 90s ;
對(duì)上述步驟2.5.2循環(huán)40次，再72°C延伸10 min,得到PCR產(chǎn)物；
2.5.3.將經(jīng)步驟2.5.2得到的PCR產(chǎn)物的一部分用毛細(xì)管電泳分析儀精確作圖；
2.5.4.將經(jīng)步驟2.5.2得到的PCR產(chǎn)物的另一部分進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察，用凝膠成像系統(tǒng)成像。
[0005]本發(fā)明取得的有益效果在于:本發(fā)明提供的鑒定EB病毒對(duì)淋巴瘤的誘發(fā)性的方法通過構(gòu)建人源化N0D/SCID小鼠，在hu-PBL /SCID嵌合小鼠體內(nèi)成功建立EB病毒誘導(dǎo)淋巴瘤的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，并且創(chuàng)造性地運(yùn)用IgH基因重排檢測(cè)方法，鑒定了該誘發(fā)瘤的單克隆性，從而有力排除以往因不明確誘發(fā)瘤性質(zhì)而給生物醫(yī)學(xué)及臨床研究帶來(lái)的干擾，客服了現(xiàn)有的鑒定方法結(jié)果不可靠、可信度低的缺陷，本發(fā)明提供的鑒定方法結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、可信度極高。
【附圖說明】
[0006]圖1為本發(fā)明中人淋巴細(xì)胞在SCID小鼠體內(nèi)移植及成瘤情況的統(tǒng)計(jì)圖；
圖2為本發(fā)明中IgH基因重排檢測(cè)的PCR擴(kuò)增引物系統(tǒng)中各引物配置的統(tǒng)計(jì)圖；
圖3為誘發(fā)淋巴瘤的IgH基因重排檢測(cè)的毛細(xì)管電泳峰圖；
圖4為PCR擴(kuò)增誘發(fā)淋巴瘤的IgH基因片段的瓊脂糖凝膠電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0007]為了便于本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，實(shí)施例提及的內(nèi)容并非對(duì)本發(fā)明的限定。
[0008]一種鑒定EB病毒對(duì)淋巴瘤的誘發(fā)性的方法，包括以下步驟:
第I步，建立EB病毒誘發(fā)正常人淋巴細(xì)胞發(fā)生腫瘤的動(dòng)物模型及從上述動(dòng)物模型中獲取腫瘤組織:
1.1.N0D/SCID小鼠的準(zhǔn)備；
本實(shí)驗(yàn)所用N0D/SCID小鼠為非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠，該品系小鼠B、T淋巴細(xì)胞功能缺失，NK細(xì)胞活性低下。
[0009]將3-4周齡的N0D/SCID小鼠在SPF級(jí)環(huán)境中單只分籠飼養(yǎng)5_10天，將用于飼養(yǎng)所述N0D/SCID小鼠的飲用水、墊料、籠具均經(jīng)高壓蒸汽滅菌，飼養(yǎng)期間，給所述N0D/SCID小鼠投放全價(jià)鼠飼料，讓其自由進(jìn)食及飲水。
[0010]1.2.人淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備；
本實(shí)驗(yàn)中所用的人淋巴細(xì)胞分別從6名健康獻(xiàn)血員外周靜脈血分離獲得，每I名獻(xiàn)血員采血 300-400 ml ο
[0011]從健康獻(xiàn)血員的外周靜脈中采血，從采集到的外周靜脈血中分離出PBL，并用免疫酶標(biāo)方法檢測(cè)獻(xiàn)血者血清中EB病毒殼抗原VCA-1gG和VCA-1gA的抗體滴度。
[0012]1.3.EB病毒的準(zhǔn)備；
體外培養(yǎng)B95_8細(xì)胞，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后調(diào)整細(xì)胞濃度至10 6_7個(gè)/ml，再將其置于溫度37°C，二氧化碳濃度為5%的培養(yǎng)箱中饑餓7-10天，然后收集培養(yǎng)液，并將收集到的培養(yǎng)液在4°C環(huán)境下離心30 min，離心速度為4000 rpm/min，離心完成后吸取全部上清液，最后將所述上清液經(jīng)0.45 um微孔濾膜過濾后置于_80°C低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0013]1.4.構(gòu)建 hu-PBL/SCID 嵌合體小鼠；
從獻(xiàn)血員新鮮靜脈血中分離出外周血淋巴細(xì)胞(PBL)，在無(wú)菌條件下給每只N0D/SCID小鼠腹腔注射人PBL懸液I ml，上述I ml的人PBL懸液中含有(8-10) X 17個(gè)淋巴細(xì)胞，每I名獻(xiàn)血員的外周血淋巴細(xì)胞接種3-4只NOD/SCID小鼠。
[0014]1.5.ElB 病毒注射；
對(duì)于接受VCA-1gG和VCA-1gA均為陽(yáng)性的獻(xiàn)血員的淋巴細(xì)胞移植的N0D/SCID小鼠，不再給其注射EB病毒懸液，對(duì)于接受VCA-1gA為陰性的獻(xiàn)血員的淋巴細(xì)胞移植的N0D/SCID小鼠，在該N0D/SCID小鼠接受淋巴細(xì)胞移植后第三天，往該N0D/SCID小鼠腹腔注射0.4 ml由步驟1.3得到的EB病毒懸液。
[0015]1.6.腫瘤組織的獲??；
定期觀察N0D/SCID小鼠的飲食與活動(dòng)狀況，小鼠在PBL接種后135天時(shí)處死，對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行詳細(xì)的解剖。檢查小鼠胸腹腔、縱隔和主要臟器，觀察腫瘤的形狀、大小、顏色、質(zhì)地等情況，取部分腫瘤組織，用液氮凍存，其余腫瘤組織用10%福爾馬林固定備用。在本步驟中，人淋巴細(xì)胞移植在N0D/SCID小鼠體內(nèi)成瘤具體情況見附圖1所示。
[0016]需要說明的是，在本步驟中，對(duì)處死小鼠的具體時(shí)間并無(wú)特別要求，只要此時(shí)小鼠體內(nèi)的腫瘤組織已經(jīng)形成，能夠從處死后的小鼠體內(nèi)獲取到實(shí)驗(yàn)所需的腫瘤組織即可。
[0017]第2步，鑒定步驟1.6中獲取的誘發(fā)性腫瘤的誘發(fā)源及該誘發(fā)性腫瘤的基因特性:
2.1.腫瘤組織病理學(xué)檢查及免疫組織化學(xué)染色；
取步驟1.6中已固定的誘發(fā)性腫瘤標(biāo)本，石蠟包埋切片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察，確診病變情況，免疫組織化學(xué)染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化酶法，檢測(cè)抗原包括:
人類白細(xì)胞共同抗原:LCA ；
B 細(xì)胞標(biāo)記:CD20、CD79a ；
T 細(xì)胞標(biāo)記:CD3、CD45R0。
[0018]在本步驟中，對(duì)N0D/SCID小鼠體內(nèi)誘發(fā)性腫瘤進(jìn)行病理檢查時(shí)，光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞體積較大，呈漿母細(xì)胞樣淋巴細(xì)胞、中心母細(xì)胞和免疫母細(xì)胞樣形態(tài)；抗原檢測(cè)結(jié)果顯示LCA陽(yáng)性，B細(xì)胞標(biāo)記陽(yáng)性，T細(xì)胞標(biāo)記陰性。有上述結(jié)果可知，本實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的誘發(fā)性腫瘤其病理學(xué)特征與臨床上彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的病理學(xué)特征相符合。
[0019]2.2.原位分子雜交檢測(cè)腫瘤組織中EBER。
[0020]EBER原位分子雜交檢測(cè)結(jié)果顯示幾乎所有腫瘤細(xì)胞核都呈陽(yáng)性棕褐色，而荷瘤小鼠組織及腫瘤鄰近的宿主臟器細(xì)胞均為陰性，由上述結(jié)果可以得出以下提示:腫瘤細(xì)胞存在EB病毒編碼的小分子RNA (EBER)。
[0021]2.3.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)腫瘤組織中LMP-1的表達(dá)；
以GADPH基因?yàn)閮?nèi)參，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)并比較移植前正常淋巴細(xì)胞與誘