發(fā)性腫瘤組織中EB病毒LMP-1的表達(dá)差異。
[0022]該步驟的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在誘發(fā)性腫瘤組織中LMP-1的表達(dá)比在移植前的正常人淋巴細(xì)胞中明顯增加。
[0023]需要說明的是，在本實(shí)施例中，為提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性及成功率，可以將每例實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0024]至此，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，結(jié)合上述步驟2.2和步驟2.3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出以下結(jié)論:誘發(fā)性腫瘤組織中確有EB病毒感染存在。
[0025]2.4.PCR擴(kuò)增檢測人特異性Alu序列；
提取誘發(fā)性腫瘤組織的DNA，應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增221 bp的人特異性Alu序列，PCR反應(yīng)方式為:
2.4.1.先 95°C預(yù)變性 5 min ；
2.4.2.再經(jīng) 94°C變性 I min、57°C退火 I min、72°C延伸 I min ；
對上述步驟2.4.2循環(huán)30次，再72°C延伸5 min,最后將PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳觀察，用凝膠成像系統(tǒng)成像。
[0026]在本步驟中，成像結(jié)果顯示6例誘發(fā)瘤均有221 bp的Alu序列擴(kuò)增條帶，與陽性對照一致，由此可以確定，hu-PBL/SCID嵌合小鼠體內(nèi)誘發(fā)性腫瘤是人源性的，而非鼠源性。
[0027]2.5.PCR分析誘發(fā)性腫瘤組織的IgH基因重排；
石蠟包埋腫瘤組織切片至6 um厚，在本具體實(shí)施例中，每個組織塊切取12張連續(xù)組織切片，然后依照DNA FFPE Tissue Kit操作步驟，提取腫瘤組織切片中的基因組DNA，接著以臨床病理學(xué)確診為淋巴瘤的組織標(biāo)本作為單克隆對照，以反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)標(biāo)本作為多克隆對照，采用B10MED-2引物系統(tǒng)及PCR儀擴(kuò)增人免疫球蛋白重鏈(IgH)基因片段，PCR反應(yīng)方式為:
2.5.1.先 95°C預(yù)變性 7 min ；
2.5.2.再 95°C 變性 45s、60°C 退火 45s、72°C 延伸 90s ;
對上述步驟2.5.2循環(huán)40次，再72°C延伸10 min,得到PCR產(chǎn)物；
2.5.3.將經(jīng)步驟2.5.2得到的PCR產(chǎn)物的一部分用毛細(xì)管電泳分析儀精確作圖；
2.5.4.將經(jīng)步驟2.5.2得到的PCR產(chǎn)物的另一部分進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察，用凝膠成像系統(tǒng)成像。
[0028]需要說明的是，本實(shí)施例提及的“B10MED-2引物系統(tǒng)”及該引物系統(tǒng)的堿基序列在期刊 Leukemia, 2003，17 (12): 2257-317，第 2270 頁 Figure.4b 和 2274 頁 Figure.5a 中有詳細(xì)記載，為簡便表述，在此不再贅述，上述參考文獻(xiàn)的作者為:van Dongen JJ, LangerakAW, Bruggemann M, et al.,文章名稱為:Design and standardizat1n of PCR primersand protocols for detect1n of clonal immunoglobulin and T—cell receptorgene recombinat1ns in suspect lymphoproliferat1ns: report of the B10MED-2Concerted Act1n BMH4-CT98-3936 ;本實(shí)施例用到的 PCR 儀為美國 Applied B1systems公司生產(chǎn)的型號為PE 9700的PCR儀。
[0029]在本步驟中，PCR反應(yīng)優(yōu)選為分5管進(jìn)行，分別標(biāo)記為A、B、C、D、E，相應(yīng)的引物配制見附圖2所示。
[0030]在本步驟中，PCR產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳分析儀精確作圖結(jié)果顯示，6例誘發(fā)瘤均檢測到單克隆的峰，表明這些誘發(fā)瘤都是單克隆增殖。為簡化表示，本實(shí)施例只通過附圖3展示了 I例誘發(fā)瘤PCR擴(kuò)增IgH的FRl-JH區(qū)間327.28bp處(Tube A)檢測到單克隆的擴(kuò)增產(chǎn)物峰。
[0031]需要強(qiáng)調(diào)的是，在附圖3中，橫坐標(biāo)代表各目的引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小(bp)，縱坐標(biāo)代表各個擴(kuò)增產(chǎn)物的相對熒光信號強(qiáng)度。Tube A在327.28 bp處顯示出一條特異性擴(kuò)增峰。Control (對照)呈現(xiàn)不規(guī)則分布的多個擴(kuò)增峰。
[0032]在本步驟中，本實(shí)施例選擇了 6例誘發(fā)性腫瘤的IgH基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，最終的電泳照片上都可觀察到清晰的單一條帶，因而證實(shí)上述誘發(fā)瘤皆為單克隆增生的腫瘤。為簡化表述，本實(shí)施例只通過附圖4展示了 I例誘發(fā)淋巴瘤的IgH基因片段的瓊脂糖凝膠電泳照片，如附圖4所示，A泳道在300bp附近可見清晰的單一條帶(與附圖3中Tube A在327.28 bp處顯示出一條特異性擴(kuò)增峰相對應(yīng))。
[0033]綜合以上檢測結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定，在hu-PBL /SCID嵌合小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的EB病毒感染相關(guān)淋巴瘤，不是多克隆的淋巴細(xì)胞增生形成的腫塊，而是單克隆的腫瘤。由此，通過上述鑒定步驟可以確定EB病毒的感染對淋巴瘤的產(chǎn)生具有誘發(fā)性。
[0034]上述實(shí)施方式中提供的鑒定EB病毒對淋巴瘤的誘發(fā)性的方法通過構(gòu)建人源化N0D/SCID小鼠，在hu-PBL /SCID嵌合小鼠體內(nèi)成功建立EB病毒誘導(dǎo)淋巴瘤的實(shí)驗(yàn)動物模型，并且創(chuàng)造性地運(yùn)用IgH基因重排檢測方法，鑒定了該誘發(fā)瘤的單克隆性，從而有力排除以往因不明確誘發(fā)瘤性質(zhì)而給生物醫(yī)學(xué)及臨床研究帶來的干擾，客服了現(xiàn)有的鑒定方法結(jié)果不可靠、可信度低的缺陷，本發(fā)明提供的鑒定方法程序嚴(yán)謹(jǐn)，經(jīng)該方法得出的鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、可信度極高。
[0035]最后需要強(qiáng)調(diào)的是，在以上實(shí)施例中，鑒定過程中的樣本數(shù)量并非是唯一固定的，之所以選擇上述數(shù)量的樣本是出于保證鑒定實(shí)驗(yàn)的成功率(避免因人為操作原因?qū)е聦?shí)驗(yàn)失敗)及操作方便的考慮，實(shí)際應(yīng)用時可以根據(jù)需要設(shè)定不同的樣本數(shù)量，本發(fā)明提供的鑒定方法對于樣本的具體數(shù)量并無特別要求。
[0036]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)現(xiàn)方案，除此之外，本發(fā)明還可以其它方式實(shí)現(xiàn)，在不脫離本技術(shù)方案構(gòu)思的前提下任何顯而易見的替換均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0037]最后，應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，為了讓本領(lǐng)域普通技術(shù)人員更方便地理解本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)之處，本發(fā)明的一些描述已經(jīng)被簡化，并且為了清楚起見，本申請文件還省略了一些其它元素，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該意識到這些省略的元素也可構(gòu)成本發(fā)明的內(nèi)容。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種鑒定EB病毒對淋巴瘤的誘發(fā)性的方法，包括以下步驟: 第I步，建立EB病毒誘發(fā)正常人淋巴細(xì)胞發(fā)生腫瘤的動物模型及從所述動物模型中獲取腫瘤組織: .1.1.NOD/SCID小鼠的準(zhǔn)備； 將3-4周齡的NOD/SCID小鼠在SPF級環(huán)境中單只分籠飼養(yǎng)5_10天，將用于飼養(yǎng)所述NOD/SCID小鼠的飲用水、墊料、籠具均經(jīng)高壓蒸汽滅菌，飼養(yǎng)期間，給所述NOD/SCID小鼠投放全價(jià)鼠飼料，讓其自由進(jìn)食及飲水； . 1.2.人淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備； 從健康獻(xiàn)血員的外周靜脈中采血，從采集到的外周靜脈血中分離出PBL，并用免疫酶標(biāo)方法檢測獻(xiàn)血者血清中EB病毒殼抗原VCA-1gG和VCA-1gA的抗體滴度； . 1.3.EB病毒的準(zhǔn)備； 體外培養(yǎng)B95_8細(xì)胞，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后調(diào)整細(xì)胞濃度至10 6_7個/ml，再將其置于溫度37°C，二氧化碳濃度為5%的培養(yǎng)箱中饑餓7-10天，然后收集培養(yǎng)液，并將收集到的培養(yǎng)液在4°C環(huán)境下離心30 min，離心速度為4000 rpm/min，離心完成后吸取全部上清液，最后將所述上清液經(jīng)0.45 um微孔濾膜過濾后置于_80°C低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫? . 1.4.構(gòu)建hu-PBL/SCID嵌合體小鼠； 在無菌條件下給每只NOD/SCID小鼠腹腔注射PBL含量為8 X 17至1X 10 7個/ml的人PBL懸液I ml，剩余PBL懸液留存?zhèn)溆茫?. 1.5.EB病毒注射； 對于接受VCA-1gG和VCA-1gA均為陽性的獻(xiàn)血員的淋巴細(xì)胞移植的NOD/SCID小鼠，不再給其注射EB病毒懸液，對于接受VCA-1gA為陰性的獻(xiàn)血員的淋巴細(xì)胞移植的NOD/SCID小鼠，在該NOD/SCID小鼠接受淋巴細(xì)胞移植后第三天，往該NOD/SCID小鼠腹腔注射0.4 ml由步驟1.3得到的EB病毒懸液； . 1.6.腫瘤組織的獲??； 將步驟1.5中接受EB病毒感染后的NOD/SCID小鼠處死，從處死后的NOD/SCID小鼠體內(nèi)取出誘發(fā)性腫瘤組織，一部分用液氮凍存，其余的用10%福爾馬林固定； 第2步，鑒定步驟1.6中獲取的誘發(fā)性腫瘤的誘發(fā)源及該誘發(fā)性腫瘤的基因特性: .2.1.腫瘤組織病理學(xué)檢查及免疫組織化學(xué)染色； 取步驟1.6中已固定的誘發(fā)性腫瘤標(biāo)本，石蠟包埋切片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察，確診病變情況，免疫組織化學(xué)染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化酶法，檢測抗原包括: 人類白細(xì)胞共同抗原:LCA ； B 細(xì)胞標(biāo)記:CD20、CD79a ； T 細(xì)胞標(biāo)記:CD3、CD45RO ； .2.2.原位分子雜交檢測腫瘤組織中EBER ； . 2.3.實(shí)時定量PCR檢測腫瘤組織中LMP-1的表達(dá)； 以GADPH基因?yàn)閮?nèi)參，用實(shí)時熒光定量PCR方法檢測并比較移植前正常淋巴細(xì)胞與誘發(fā)性腫瘤組織中EB病毒LMP-1的表達(dá)差異； .2.4.PCR擴(kuò)增檢測人特異性Alu序列； 提取誘發(fā)性腫瘤組織的DNA，應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增221 bp的人特異性Alu序列，PCR反應(yīng)方式為: . 2.4.1.先 95°C預(yù)變性 5 min ； . 2.4.2.再經(jīng) 94°C變性 I min、57°C退火 I min、72°C延伸 I min ； 對上述步驟2.4.2循環(huán)30次，再72°C延伸5 min,最后將PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳觀察，用凝膠成像系統(tǒng)成像； .2.5.PCR分析誘發(fā)性腫瘤組織的IgH基因重排； 石蠟包埋腫瘤組織切片至6 um厚，依照DNA FFPE Tissue Kit操作步驟，提取腫瘤組織切片中的基因組DNA，接著以臨床病理學(xué)確診為淋巴瘤的組織標(biāo)本作為單克隆對照，以反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)標(biāo)本作為多克隆對照，采用B1MED-2引物系統(tǒng)及PCR儀擴(kuò)增人免疫球蛋白重鏈基因片段，PCR反應(yīng)方式為: . 2.5.1.先 95°C預(yù)變性 7 min ； . 2.5.2.再 95°C 變性 45s、60°C 退火 45s、72°C 延伸 90s ; 對上述步驟2.5.2循環(huán)40次，再72°C延伸10 min,得到PCR產(chǎn)物； . 2.5.3.將經(jīng)步驟2.5.2得到的PCR產(chǎn)物的一部分用毛細(xì)管電泳分析儀精確作圖； .2.5.4.將經(jīng)步驟2.5.2得到的PCR產(chǎn)物的另一部分進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察，用凝膠成像系統(tǒng)成像。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種鑒定EB病毒對淋巴瘤的誘發(fā)性的方法，涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，該方法包括以下步驟：第1步，建立EB病毒誘發(fā)正常人淋巴細(xì)胞發(fā)生腫瘤的動物模型及從所述動物模型中獲取腫瘤組織；第2步，鑒定第一步中獲取的誘發(fā)性腫瘤的誘發(fā)源及該誘發(fā)性腫瘤的基因特性。本發(fā)明提供的鑒定EB病毒對淋巴瘤的誘發(fā)性的方法創(chuàng)造性地運(yùn)用IgH基因重排檢測方法，鑒定了動物模型中的誘發(fā)瘤的單克隆性，從而有力排除以往因不明確誘發(fā)瘤性質(zhì)而給生物醫(yī)學(xué)及臨床研究帶來的干擾，客服了現(xiàn)有的鑒定方法結(jié)果不可靠、可信度低的缺陷，本發(fā)明提供的鑒定方法結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、可信度極高。
【IPC分類】A01K67-02, C12Q1-68
【公開號】CN104604799
【申請?zhí)枴緾N201510058727
【發(fā)明人】張楊, 唐運(yùn)蓮, 甘曉寧, 王成昆
【申請人】南華大學(xué)
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年2月5日