一種高產(chǎn)脂濕地松的離體快繁技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說，涉及一種高產(chǎn)脂濕地松的離體快繁技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]濕地松(Pi/ms elHottii)屬于松科松屬常綠喬木，原產(chǎn)于美國(guó)南方的重要用材和產(chǎn)脂樹種之一。適應(yīng)性強(qiáng)，早期生長(zhǎng)迅速，干形通直，木材質(zhì)量好，松脂含量高。其松脂質(zhì)量好，松香不易結(jié)晶凝固，雜質(zhì)少，在松脂市場(chǎng)上廣受歡迎，世界上亞熱帶和部分熱帶地區(qū)廣為引種。從上世紀(jì)30年代開始引進(jìn)中國(guó)，已成為我國(guó)南方重要的綠化造林樹種。
[0003]目前在我國(guó)南方各省廣泛種植，種植面積不斷擴(kuò)大，已成為我國(guó)南方地區(qū)很有發(fā)展前途的造林樹種。隨著濕地松種植面積的不斷擴(kuò)大，其種苗供應(yīng)短缺問題日益突出，我國(guó)濕地松種子很大程度上依賴于進(jìn)口，但進(jìn)口種子質(zhì)量良莠不齊，價(jià)格昂貴，造成生產(chǎn)成本過高，增加林農(nóng)負(fù)擔(dān)。通過建立種子園來進(jìn)行育種繁育，由于有性繁殖方式繁殖周期長(zhǎng)、成本高，生產(chǎn)出的種子雜合度高、產(chǎn)量有限，種子萌發(fā)率低、種子實(shí)生苗生長(zhǎng)不整齊等諸多問題，尤其是選育優(yōu)良家系難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，嚴(yán)重妨礙了良種的推廣應(yīng)用。植物組織培養(yǎng)技術(shù)作為新興的植物無性繁殖手段，具有占空間少，培養(yǎng)條件可控、繁殖快、效率高等特點(diǎn)，適于自動(dòng)化、工廠化生產(chǎn)。至今為止，尚未見有關(guān)濕地松離體快繁的報(bào)道，因此，非常有必要建立濕地松離體再生體系，以期降低生產(chǎn)成本、簡(jiǎn)化步驟，以促進(jìn)濕地松產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供出一種高產(chǎn)脂濕地松的離體快繁技術(shù)，本發(fā)明以美國(guó)北卡羅萊納州高產(chǎn)脂濕地松成熟種胚為外植體，經(jīng)過外植體選擇及消毒、不定芽誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽等過程從而實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)脂濕地松離體快繁，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0005]本發(fā)明的一種高產(chǎn)脂濕地松的離體快繁技術(shù)，包括以下的步驟:
(I)外植體的消毒:選取完整、飽滿、無一的濕地松種子，自來水搓洗干凈，去掉種翅雜物,用0.1%?0.2%1(]\^04溶液浸泡10?20min，無菌水沖洗3?5次后用2%?4%NaC10溶液消毒10?30min，無菌水沖洗干凈后于無菌水中浸泡過夜。次日在超凈工作臺(tái)中將種子剝?nèi)シN殼后以70%?80%乙醇浸泡5?10s，0.1%升汞溶液消毒3?lOmin，再用無菌水清洗3?5次,無菌濾紙擦干后備用。
[0006](2)不定芽誘導(dǎo):經(jīng)步驟(I)處理后的種胚用無菌的手術(shù)器械小心使種胚與胚乳分離后，將種胚橫置于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)直至萌生一個(gè)不定芽，然后置于每天光照12?15小時(shí)，光照強(qiáng)度為1000?15001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至各不定芽伸長(zhǎng)到I?2cm。
[0007](3)增殖培養(yǎng):將步驟(2)成功誘導(dǎo)出的不定芽分離，以單個(gè)不定芽為單位轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)I?4天，然后置于每天光照12?16小時(shí)，光照強(qiáng)度為3000?50001x，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)。多次反復(fù)切割進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以得到更多的叢生芽。
[0008](4)生根培養(yǎng):將步驟(I)或步驟(2)培養(yǎng)得到的高度約為2?3cm的不定芽切割并接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)3?7天，然后置于每天光照10?12小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)至生根。
[0009](5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約5?7cm的生長(zhǎng)良好且健壯的生根試管苗去瓶蓋置于自然光照下煉苗5?7天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入由營(yíng)養(yǎng)土:珍珠巖=3:1混合成的基質(zhì)，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天以1/2MS大量兀素營(yíng)養(yǎng)液給幼苗澆水，保持濕度。待幼苗成活后再移栽大田。
[0010]上述步驟(I)所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+2?6mg/L6-BA+0.01?0.5mg/LNAA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0011]上述步驟(2)所述的增殖培養(yǎng)基為DCR+1?5mg/L6-BA+0.01?0.5mg/LNAA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0012]上述步驟(3)所述的生根培養(yǎng)基為PDA+0.1?0.5mg/LIBA+l.0%?1.5%蔗糖+0.35%?0.5%瓊脂+5?10g/L椰糖，pH值為5.4?5.8。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:一種高產(chǎn)脂濕地松的離體快繁技術(shù)，涉及濕地松ell1ttii)通過植物組織培養(yǎng)的方法快速繁育“材脂兩用”高產(chǎn)濕地松種苗。本發(fā)明以美國(guó)北卡羅萊納州高產(chǎn)脂濕地松成熟種胚為外植體，經(jīng)過外植體選擇及消毒、不定芽誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽等過程從而實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)脂濕地松離體快繁，為濕地松的組培快繁和工廠化育苗提供技術(shù)支持。
【具體實(shí)施方式】
[0014]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0015]實(shí)施例1:
(I)外植體的消毒:選取完整、飽滿、無一的濕地松種子，自來水搓洗干凈，去掉種翅雜物，用0.15%1(1^04溶液浸泡lOmin，無菌水沖洗3次后用2%NaC10溶液消毒lOmin，無菌水沖洗干凈后于無菌水中浸泡過夜。次日在超凈工作臺(tái)中將種子剝?nèi)シN殼后以75%乙醇浸泡5s, 0.1%升汞溶液消毒5min，再用無菌水清洗3次，無菌濾紙擦干后備用。
[0016](2)不定芽誘導(dǎo):經(jīng)步驟(I)處理后的種胚用無菌的手術(shù)器械小心使種胚與胚乳分離后，將種胚橫置于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)直至萌生一個(gè)不定芽，然后置于每天光照13小時(shí)，光照強(qiáng)度為ΙΟΟΟΙχ，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)直至各不定芽伸長(zhǎng)到I?2cm。培養(yǎng)14天后外植體污染率為6%，褐化率控制在12%以內(nèi)。培養(yǎng)30天后不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)86.9%。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+3mg/L6-BA+0.3mg/L NAA+3.5% 蔗糖 +0.35% 瓊脂 +0.05% 活性炭，pH 值為 5.8。
[0017](3)增殖培養(yǎng):將步驟(2)成功誘導(dǎo)出的不定芽分離，以單個(gè)不定芽為單位轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)3天，然后置于每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為30001χ，置于培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)28天后平均芽增殖系數(shù)達(dá)到7.10。多次反復(fù)切割進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以得到更多的叢生芽。所述的增殖培養(yǎng)基為DCR+3mg/L6-BA+0.3mg/L NAA+2.0% 蔗糖 +0.4% 瓊脂 +0.1% 活性炭，pH 值為 5.8。
[0018](4)生根培養(yǎng):將步驟(I)或步驟(2)培養(yǎng)得到的