高度約為2?3cm的不定芽切割并接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)5天，然后置于每天光照11小時(shí)，光照強(qiáng)度為20001x，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)30天后即可生根，生根率達(dá)87.3%。所述的生根培養(yǎng)基為PDA+0.2mg/LIBA+l.5%蔗糖+0.5%瓊脂+6g/L椰糖，pH值為5.8。
[0019](5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約5?7cm的生長良好且健壯的生根試管苗去瓶蓋置于自然光照下煉苗5天后,將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基,栽入由營養(yǎng)土:珍珠巖=3:1混合成的基質(zhì)，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天以1/2MS大量元素營養(yǎng)液給幼苗澆水，保持濕度。待幼苗成活后再移栽大田，移栽成活率可達(dá)88.4%。
[0020]實(shí)施例2:
(I)外植體的消毒:選取完整、飽滿、無一的濕地松種子，自來水搓洗干凈，去掉種翅雜物，用0.20%1(1^04溶液浸泡6min，無菌水沖洗3次后用3%NaC10溶液消毒8min，無菌水沖洗干凈后于無菌水中浸泡過夜。次日在超凈工作臺中將種子剝?nèi)シN殼后以75%乙醇浸泡5s，0.1%升汞溶液消毒7min，再用無菌水清洗5次，無菌濾紙擦干后備用。
[0021](2)不定芽誘導(dǎo):經(jīng)步驟(I)處理后的種胚用無菌的手術(shù)器械小心使種胚與胚乳分離后，將種胚橫置于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)直至萌生一個(gè)不定芽，然后置于每天光照14小時(shí)，光照強(qiáng)度為15001x，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)直至各不定芽伸長到I?2cm。培養(yǎng)14天后外植體污染率為3%，褐化率控制在14%以內(nèi)。培養(yǎng)30天后不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)83.6%。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+4mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+3.5% 蔗糖 +0.35% 瓊脂 +0.08% 活性炭，pH 值為 5.6。
[0022](3)增殖培養(yǎng):將步驟(2)成功誘導(dǎo)出的不定芽分離，以單個(gè)不定芽為單位轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)4天，然后置于每天光照13小時(shí)，光照強(qiáng)度為35001x，置于培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)28天后平均芽增殖系數(shù)達(dá)到7.23。多次反復(fù)切割進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以得到更多的叢生芽。所述的增殖培養(yǎng)基為DCR+4mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+2.0% 蔗糖 +0.4% 瓊脂 +0.1% 活性炭，pH 值為 5.6。
[0023](4)生根培養(yǎng):將步驟(I)或步驟(2)培養(yǎng)得到的高度約為2?3cm的不定芽切割并接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)5天，然后置于每天光照13小時(shí)，光照強(qiáng)度為25001x，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)30天后即可生根，生根率達(dá)85.8%。所述的生根培養(yǎng)基為PDA+0.5mg/LIBA+l.5%蔗糖+0.4%瓊脂+6g/L椰糖，pH值為5.6。
[0024](5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約5?7cm的生長良好且健壯的生根試管苗去瓶蓋置于自然光照下煉苗5天后,將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基,栽入由營養(yǎng)土:珍珠巖=3:1混合成的基質(zhì)，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天以1/2MS大量元素營養(yǎng)液給幼苗澆水，保持濕度。待幼苗成活后再移栽大田，移栽成活率可達(dá)90%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種高產(chǎn)脂濕地松的離體快繁技術(shù)，其特征在于包括以下步驟: (I)外植體的消毒:選取完整、飽滿、無一的濕地松種子，自來水搓洗干凈，去掉種翅雜物,用0.1%?0.2%1(]\^04溶液浸泡10?20min，無菌水沖洗3?5次后用2%?4%NaC10溶液消毒10?30min，無菌水沖洗干凈后于無菌水中浸泡過夜，次日在超凈工作臺中將種子剝?nèi)シN殼后以70%?80%乙醇浸泡5?10s，0.1%升汞溶液消毒3?lOmin，再用無菌水清洗3?5次,無菌濾紙擦干后備用； (2)不定芽誘導(dǎo):經(jīng)步驟(I)處理后的種胚用無菌的手術(shù)器械小心使種胚與胚乳分離后，將種胚橫置于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)直至萌生一個(gè)不定芽，然后置于每天光照12?15小時(shí),光照強(qiáng)度為1000?15001x,培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至各不定芽伸長到I?2cm; (3)增殖培養(yǎng):將步驟(2)成功誘導(dǎo)出的不定芽分離，以單個(gè)不定芽為單位轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)I?4天，然后置于每天光照12?16小時(shí)，光照強(qiáng)度為3000?50001x，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)多次反復(fù)切割進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以得到更多的叢生芽； (4)生根培養(yǎng):將步驟(I)或步驟(2)培養(yǎng)得到的高度約為2?3cm的不定芽切割并接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)3?7天，然后置于每天光照10?12小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)至生根； (5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約5?7cm的生長良好且健壯的生根試管苗去瓶蓋置于自然光照下煉苗5?7天后,將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基,栽入由營養(yǎng)土:珍珠巖=3:1混合成的基質(zhì)，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天以1/2MS大量元素營養(yǎng)液給幼苗澆水，保持濕度，待幼苗成活后再移栽大田。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)脂濕地松的離體快繁技術(shù)，其特征在于步驟(I)所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+2 ?6mg/L6-BA+0.01 ?0.5mg/L NAA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)脂濕地松的離體快繁技術(shù)，其特征在于步驟(2)所述的增殖培養(yǎng)基為 DCR+1 ?5mg/L6-BA+0.01 ?0.5mg/L NAA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)脂濕地松的離體快繁技術(shù)，其特征在于步驟(3)所述的生根培養(yǎng)基為PDA+0.1?0.5mg/LIBA+l.0%?1.5%蔗糖+0.35%?0.5%瓊脂+5?10g/L椰糖，pH值為5.4?5.8。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)脂濕地松的離體快繁技術(shù)，涉及濕地松（Pinus elliottii）通過植物組織培養(yǎng)的方法快速繁育“材脂兩用”高產(chǎn)濕地松種苗。本發(fā)明以美國北卡羅萊納州高產(chǎn)脂濕地松成熟種胚為外植體，經(jīng)過外植體選擇及消毒、不定芽誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽等過程從而實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)脂濕地松離體快繁，為濕地松的組培快繁和工廠化育苗提供技術(shù)支持。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號】CN104663445
【申請?zhí)枴緾N201510087222
【發(fā)明人】楊惠才
【申請人】楊惠才
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年2月25日