一種適用于菲律賓蛤仔的三倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于海洋農(nóng)業(yè)中貝類遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種適用于菲律賓蛤仔的三倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]菲律賓蛤仔Ruditapes phiIippenarum俗稱花蛤、蜆子，屬雙殼綱，簾蛤科，蛤仔屬，為廣溫、廣鹽性種類，宜養(yǎng)面積廣，是我國四大養(yǎng)殖貝類之一，其產(chǎn)量占海水貝類總產(chǎn)量的31%。2010年，我國蛤仔養(yǎng)殖產(chǎn)量約300萬噸，約占世界總產(chǎn)量的90%。菲律賓蛤仔養(yǎng)殖風(fēng)險小、投資少、相對成本低、產(chǎn)量高，產(chǎn)業(yè)地位十分重要。
[0003]目前我國海水養(yǎng)殖的菲律賓蛤仔基本上都是野生型的，難以適應(yīng)逐漸惡化的養(yǎng)殖環(huán)境。因此，利用生物技術(shù)培育優(yōu)良的養(yǎng)殖品種，是當(dāng)前乃至未來發(fā)展海水貝類養(yǎng)殖亟待解決的關(guān)鍵問題之一。以多倍體誘發(fā)技術(shù)為主的貝類細(xì)胞遺傳技術(shù)是目前貝類遺傳育種中最活躍和最具應(yīng)用價值的一個領(lǐng)域。由于三倍體貝類可育性較差，消耗極少能量用于繁殖，而更多的能量用于生長，導(dǎo)致三倍體貝類比正常二倍體生長速度快、成活率高、產(chǎn)量高。因此，通過染色體操作，誘導(dǎo)蛤仔三倍體，對蛤仔產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。
[0004]20世紀(jì)80年代以來，海水貝類的染色體操作得到廣泛研宄，主要通過兩種方法誘導(dǎo)三倍體，第一，應(yīng)用物理或化學(xué)的方法，阻遏PB2的排出，使PB2的一組染色單體留在受精卵內(nèi)，形成三倍體；另外，通過四倍體個體與二倍體雜交，可以得到100%三倍體，已經(jīng)用雄性四倍體與雌性二倍體雜交培育出全三倍體長牡蠣。
[0005]根據(jù)上述三倍體誘導(dǎo)機理，發(fā)展出多種多倍體誘導(dǎo)方法，通過抑制PBl釋放可誘導(dǎo)四倍體和三倍體，抑制PB2的釋放可得到三倍體。人工誘導(dǎo)多倍體的方法可分為物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)三個方面。
[0006]物理學(xué)方法
[0007]在受精卵的細(xì)胞周期中施加物理因子處理，影響和干預(yù)細(xì)胞有絲分裂器的正常運作，以達(dá)到染色體加倍的方法。包括溫度休克和靜水壓休克等。
[0008]化學(xué)方法
[0009]應(yīng)用一些特殊的化學(xué)物質(zhì)，阻遏細(xì)胞正常分裂，從而達(dá)到染色體加倍的目的。例如應(yīng)用細(xì)胞松弛素B(CB)、6_ 二甲氨基嘌呤(6-DMAP)、咖啡因、秋水仙素、聚乙二醇、氰化鈣等試劑。
[0010]生物學(xué)方法
[0011]在貝類培育上比較常用的方法就是用可育的四倍體與正常二倍體雜交，產(chǎn)生三倍體，三倍體率達(dá)到100 %，并且操作方便，適用于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化水產(chǎn)養(yǎng)殖的需要，但目前，僅在牡蠣開發(fā)出可供繁育的四倍體成貝。
[0012]根據(jù)以上方法，已在30余種海水貝類中進(jìn)行了多倍體的誘導(dǎo)，但僅牡蠣類實現(xiàn)了多倍體的產(chǎn)業(yè)化。國外曾研宄菲律賓蛤仔的多倍體誘發(fā)，但誘導(dǎo)率較低，且不穩(wěn)定，未能形成成熟的菲律賓蛤仔三倍體誘導(dǎo)技術(shù)。本發(fā)明通過大量科學(xué)試驗，加強對精卵的選擇，大幅度改進(jìn)對受精卵的處理方法，建立了穩(wěn)定、高效的菲律賓蛤仔三倍體誘導(dǎo)方法。
[0013]對菲律賓蛤仔的三倍體誘導(dǎo)有以下幾個關(guān)鍵點:精卵充分發(fā)育，同步受精，提高受精階段及胚胎發(fā)育階段的同步性，對提高三倍體誘導(dǎo)率尤為重要；對受精卵處理時間、處理時長和處理強度的精確控制；外界因素，尤其是溫度，對胚胎發(fā)育速度具有顯著影響，因此有必要通過對極體的觀察確定藥物處理的時間節(jié)點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提出一種適用于菲律賓蛤仔的三倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，實現(xiàn)對菲律賓蛤仔穩(wěn)定、高效的三倍體誘導(dǎo)。
[0015]本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采取以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0016]一種適用于菲律賓蛤仔的三倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，包括步驟如下:
[0017](I)蛤仔親貝的選擇及促熟:選取灘涂采捕親貝，在室內(nèi)升溫促熟，達(dá)到性腺充分成熟；
[0018](2)親貝處理及配子排放；將親貝置入砂濾海水中進(jìn)行催產(chǎn)，然后將開始排放配子的親貝選出，單個置于燒杯中排放配子，獲得多杯卵液和多杯精液；
[0019](3)卵液選擇及處理；鏡檢上述步驟(2)獲得多杯卵液中的每杯卵液，選擇發(fā)育良好的多杯卵液進(jìn)行合并，卵子懸浮液以90 μ m篩絹過濾去除組織碎片，以30 μ m篩絹清洗3次，收集卵子，置入塑料燒杯備用；
[0020](4)精液選擇及處理；鏡檢上述步驟(2)獲得多杯精液中的每杯精液，選取活力良好的一杯，用30μπι篩絹濾除組織碎片，作為備用精子；
[0021](5)同步受精，鏡檢及分組；取上述備用精子加入到上述步驟(3)的卵子懸浮液中，精卵比為3:1-5:1，然后將受精卵分成處理組和對照組；
[0022](6)在處理組的受精卵中加入細(xì)胞松弛素B ;觀察對照組受精卵出現(xiàn)第一極體的比例達(dá)到總卵數(shù)的80%時，迅速向處理組加入細(xì)胞松弛素B至終濃度為0.5mg/L ;
[0023](7)去除受精卵溶液中的細(xì)胞松弛素B及孵化；觀察對照組中80%至90%的第一極體下方出現(xiàn)第二極體時，以30 μ m篩絹洗卵，砂濾海水清洗，去除細(xì)胞松弛素B，然后孵化發(fā)育至擔(dān)輪幼蟲或D形幼蟲。
[0024]而且，所述步驟(I)中親貝為3齡蛤仔，殼長大于40mm。
[0025]而且，所述步驟(2)中的砂濾海水為經(jīng)紫外線照射處理30min至60min的砂濾海水。
[0026]而且，所述步驟(3)中發(fā)育良好的卵液為卵子的卵膜完整、規(guī)格一致、形狀呈規(guī)則球形、分散度良好；所述步驟(4)中活力良好的精子是指鏡下檢查，大于90%的精子具有正?；顒幽芰Γ曳稚⒍攘己?。
[0027]而且，所述步驟(6)加入的細(xì)胞松弛素B具體配制方法為:將細(xì)胞松弛素B溶于二甲基亞砜，配制成0.5mg/mL的溶液，然后加入到受精卵溶液中，至體積比1:1000。
[0028]而且，所述步驟￠)中的觀察具體為，取受精卵懸浮液I滴滴于載玻片上，輕彈載玻片使極體轉(zhuǎn)至卵球側(cè)面，然后進(jìn)行觀察。
[0029]而且，所述步驟(7)中的孵化密度為10-30粒/mL。
[0030]而且，所述步驟(7)中發(fā)育至擔(dān)輪幼蟲或D形幼蟲是通過流式細(xì)胞術(shù)測定。
[0031]而且，所有所述的砂濾海水的溫度為23_26°C，鹽度為20-30。
[0032]本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是:
[0033]本發(fā)明首次公開了一種適用于菲律賓蛤仔的三倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，具有穩(wěn)定、高效、操作簡單等優(yōu)點。對比以往的海水雙殼類三倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，本發(fā)明有如下特點:
[0034]1、受精策略不同:以往雙殼類三倍體誘導(dǎo)過程中，采用混合精卵進(jìn)行受精，胚胎發(fā)育同步性差，誘導(dǎo)率不高，本發(fā)明采用單一個體催產(chǎn)，可對精卵進(jìn)行嚴(yán)格的人工選擇，有效提高發(fā)育同步性和三倍體誘導(dǎo)率；
[0035]2、處理時機不同:以往的化學(xué)誘導(dǎo)方法一般規(guī)定在受精后特定時間加入CB，本發(fā)明以顯微觀察為基礎(chǔ)，在卵子出現(xiàn)PBl的比例達(dá)80%時加入CB，第一極體有效釋放，有效降低四倍體及非整倍體胚胎的出現(xiàn)幾率；
[0036]2、處理持續(xù)時間的判斷方法不同:其他海水雙殼類處理持續(xù)時間為15-20min，本發(fā)明以對照組中出現(xiàn)PB2的受精卵比例達(dá)到80%作為去除CB的時間節(jié)點，處理時間以受精卵發(fā)育進(jìn)度作為生物學(xué)指標(biāo)，有效回避了溫度、水質(zhì)等外界因素的影響，使第二極體被有效抑制在合子內(nèi)，有效降低二倍體胚胎的出現(xiàn)幾率；
[0037]3、對于PB2出現(xiàn)比例的判定方式不同:以往的判定方式為出現(xiàn)PB2的卵子占總卵數(shù)的百分比，本發(fā)明所述為出現(xiàn)PB2的受精卵與出現(xiàn)PBl的受精卵之比，更為精確、科學(xué)；
[0038]4、獲得結(jié)果不同:以往在其他雙殼類的三倍體誘導(dǎo)率在50-70%間變化，而本發(fā)明三倍體誘導(dǎo)率穩(wěn)定在85%以上。
【具體實施方式】
[0039]以下對本發(fā)明實施做進(jìn)一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0040]一種適用于菲律賓蛤仔的三倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，其主要內(nèi)容為對雌雄親貝進(jìn)行催產(chǎn)，人工授精，以一定濃度的細(xì)胞松弛素B在受精的一定時間段進(jìn)行處理，獲得三倍體胚胎；下面以幾個具體實例進(jìn)行說明，
[0041]實施例1
[0042]I) 2013年5月底，在某水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖實驗室，利用本地灘涂采捕的3齡蛤仔作為親貝，親貝殼長44-47mm，已在室內(nèi)升溫促熟，性腺充分成熟；
[0043]2)置入經(jīng)紫外線照射45min的砂濾海水催產(chǎn)。將開始排放配子的親貝選出，淡水反復(fù)沖洗后，單個置于100ml燒杯排放配子，約20min后，配子基本排放完畢，獲得卵液14杯，精液8杯；
[0044]3)鏡檢每杯卵液，選擇卵膜完整、規(guī)格一致、形狀呈規(guī)則球形、分散度良好的卵液3杯合并，得卵子約300萬枚，卵子懸浮液以90 μ m篩絹過濾去除組織碎片，以30 μ m篩絹清洗3次，收集卵子，置入5000mL塑料燒杯；
[0045]4)鏡檢每杯精液，其中2杯中90%以上的精子具有正常活動能力，且分散度良好，選擇濃度較高的一杯，用30μπι篩絹濾除組織碎片，作為備用精子；
[0046]5)取適量精子，加入卵子懸浮液中，及時攪動卵液使卵子同步受精，鏡檢每個卵子周圍附上3-8個精子。受精后的卵子分成2組，即處理組和對照組，處理組體積2000mL，對照組體積200mL ；
[0047]6)為方便觀察，取受精卵懸浮液I滴滴于載玻片上，輕彈載玻片使極體轉(zhuǎn)至卵球側(cè)面，受精后19min，觀察對照組受精卵出現(xiàn)PBl的比例達(dá)到80%，迅速向處理組加入2mLCB儲備液(CB首先溶于二甲基亞砜配制的0.5mg/mL溶液)，同時攪動卵液使藥物分散均勻；
[0048]7)受精后37min，觀察對照組中81%的PBl下方出現(xiàn)PB2，以30 μ m篩絹洗卵，砂濾海水清洗3次，去除CB，受精卵重新懸浮于新鮮的砂濾海水中，孵化密度30粒/mL，22.5h后發(fā)育至D形幼蟲；
[0049]8)幼蟲倍性檢測:對于步驟7中獲得的初孵D形幼蟲，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行倍性檢測，三倍體誘導(dǎo)率為89.2 %。
[0050]9)所