用海水溫度為25 °C，鹽度為24。
[0051]實(shí)施例2
[0052]I) 2013年6月初，在國(guó)家某貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系綜合試驗(yàn)站，利用渤海灣灘涂采捕的3齡蛤仔作為親貝，親貝殼長(zhǎng)43-48_，性腺充分成熟；
[0053]2)置入經(jīng)紫外線照射30min的砂濾海水催產(chǎn)。將開始排放配子的親貝選出，淡水沖洗后，單個(gè)置于100ml燒杯排放配子，約30min配子基本排放完畢，獲得卵液12杯，精液8杯；
[0054]3)鏡檢每杯卵液，選擇卵膜完整、規(guī)格一致、形狀呈規(guī)則球形、分散度良好的卵液4杯合并，得卵子約500萬枚，卵子懸浮液以90 μ m篩絹過濾去除組織碎片，以30 μ m篩絹清洗3次，收集卵子，置入5000mL塑料燒杯；
[0055]4)鏡檢每杯精液，其中3杯中90%以上的精子具有正常活動(dòng)能力，且分散度良好，選擇濃度較高的一杯，用30μπι篩絹濾除組織碎片，作為備用精子；
[0056]5)取適量精子，加入卵子懸浮液中，及時(shí)攪動(dòng)卵液使卵子同步受精，鏡檢每個(gè)卵子周圍附上3-5個(gè)精子。受精后的卵子分成2組，即處理組和對(duì)照組，處理組體積2000mL，對(duì)照組體積300mL ；
[0057]6)為方便觀察，取卵液I滴滴于載玻片上，輕彈載玻片使極體轉(zhuǎn)至卵球側(cè)面，受精后18min，觀察對(duì)照組受精卵出現(xiàn)PBl的比例達(dá)到80%，向處理組加入2mL CB儲(chǔ)備液(CB首先溶于二甲基亞砜配制的0.5mg/mL溶液)，及時(shí)攪動(dòng)卵液使藥物分散均勻；
[0058]7)受精后35min，觀察對(duì)照組中82%的PBl下方出現(xiàn)PB2，以30 μ m篩絹洗卵，砂濾海水清洗3次，去除CB，受精卵重新懸浮于新鮮的砂濾海水中，孵化密度25粒/mL，22h后發(fā)育至D形幼蟲；
[0059]8)幼蟲倍性檢測(cè):對(duì)于步驟7中獲得的初孵D形幼蟲，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行倍性檢測(cè)，三倍體誘導(dǎo)率為89.4%。
[0060]9)所用海水溫度為25.5°C，鹽度為26。
[0061]實(shí)施例3
[0062]I) 2014年6月初，在天津市某水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室，利用渤海灣淺海采捕的3齡蛤仔作為親貝，親貝殼長(zhǎng)43-45_，性腺自然成熟；
[0063]2)置入經(jīng)紫外線照射60min的砂濾海水催產(chǎn)。將開始排放配子的親貝選出，淡水反復(fù)沖洗后，單個(gè)置于100ml燒杯繼續(xù)排放配子，約20min后，配子基本排放完畢，獲得卵液15杯，精液13杯；
[0064]3)鏡檢每杯卵液，選擇卵膜完整、規(guī)格一致、形狀呈規(guī)則球形、分散度良好的卵液6杯合并，得卵子約700萬枚，卵子懸浮液以90 μ m篩絹過濾去除組織碎片，以30 μ m篩絹清洗3次，收集卵子，置入5000mL塑料燒杯；
[0065]4)鏡檢每杯精液，其中7杯中90%以上的精子具有正常活動(dòng)能力，且分散度良好，選擇濃度較高的一杯，用30μπι篩絹濾除組織碎片，作為備用精子；
[0066]5)取適量精子，加入卵子懸浮液中，及時(shí)攪動(dòng)卵液使卵子同步受精，鏡檢每個(gè)卵子周圍附上3-6個(gè)精子。受精后的卵子分成2組，即處理組和對(duì)照組，處理組體積2000mL，對(duì)照組體積500mL ；
[0067]6)為方便觀察，取對(duì)照組受精卵懸浮液I滴滴于載玻片上，輕彈載玻片使極體轉(zhuǎn)至卵球側(cè)面，受精后20min，觀察對(duì)照組受精卵出現(xiàn)PBl的比例達(dá)到80%，迅速向處理組加入2mL CB儲(chǔ)備液(CB首先溶于二甲基亞砜配制的0.5mg/mL溶液)，同時(shí)攪動(dòng)卵液使藥物分散均勻；
[0068]7)受精后40min，觀察對(duì)照組中86%的PBl下方出現(xiàn)PB2，以30 μ m篩絹洗卵，砂濾海水清洗3次，去除CB，受精卵重新懸浮于新鮮的砂濾海水中，孵化密度30粒/mL，25h后發(fā)育至D形幼蟲；
[0069]8)幼蟲倍性檢測(cè):對(duì)于步驟7中獲得的初孵D形幼蟲，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行倍性檢測(cè)，三倍體誘導(dǎo)率為94.2 %。
[0070]9)所用海水溫度為23.5°C，鹽度為22。
[0071]實(shí)施例4
[0072]I) 2015年5月底，在天津某水產(chǎn)養(yǎng)殖公司苗種繁育車間，利用堿河口灘涂采捕的3齡蛤仔作為親貝，親貝殼長(zhǎng)42-44_，性腺自然成熟；
[0073]2)置入經(jīng)紫外線照射60min的砂濾海水催產(chǎn)。將開始排放配子的親貝選出，淡水反復(fù)沖洗后，單個(gè)置于100ml燒杯繼續(xù)排放配子，約20min后，配子基本排放完畢，獲得卵液14杯，精液15杯；
[0074]3)鏡檢每杯卵液，選擇卵膜完整、規(guī)格一致、形狀呈規(guī)則球形、分散度良好的卵液6杯合并，得卵子約650萬枚，卵子懸浮液以90 μ m篩絹過濾去除組織碎片，以30 μ m篩絹清洗3次，收集卵子，置入5000mL塑料燒杯；
[0075]4)鏡檢每杯精液，其中5杯中90%以上的精子具有正?；顒?dòng)能力，且分散度良好，選擇濃度較高的一杯，用30μπι篩絹濾除組織碎片，作為備用精子；
[0076]5)取適量精子，加入卵子懸浮液中，及時(shí)攪動(dòng)卵液使卵子同步受精，鏡檢每個(gè)卵子周圍附上3-7個(gè)精子。受精后的卵子分成2組，即處理組和對(duì)照組，處理組體積2000mL，對(duì)照組體積400mL ；
[0077]6)為方便觀察，取對(duì)照組受精卵懸浮液I滴滴于載玻片上，輕彈載玻片使極體轉(zhuǎn)至卵球側(cè)面，受精后18min，觀察對(duì)照組受精卵出現(xiàn)PBl的比例達(dá)到80%，迅速向處理組加入2mL CB儲(chǔ)備液(CB首先溶于二甲基亞砜配制的0.5mg/mL溶液)，同時(shí)攪動(dòng)卵液使藥物分散均勻；
[0078]7)受精后37min，觀察對(duì)照組中84.5%的PBl下方出現(xiàn)PB2，以30 μπι篩絹洗卵，砂濾海水清洗3次，去除CB，受精卵重新懸浮于新鮮的砂濾海水中，孵化密度25粒/mL，23h后發(fā)育至D形幼蟲；
[0079]8)幼蟲倍性檢測(cè):對(duì)于步驟7中獲得的初孵D形幼蟲，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行倍性檢測(cè)，三倍體誘導(dǎo)率為93.6%。
[0080]9)所用海水溫度為24.5°C，鹽度為23。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種適用于菲律賓蛤仔的三倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，其特征在于:包括步驟如下: (1)蛤仔親貝的選擇及促熟:選取灘涂采捕親貝，在室內(nèi)升溫促熟，達(dá)到性腺充分成熟； (2)親貝處理及配子排放；將親貝置入砂濾海水中進(jìn)行催產(chǎn)，然后將開始排放配子的親貝選出，單個(gè)置于燒杯中排放配子，獲得多杯卵液和多杯精液； (3)卵液選擇及處理；鏡檢上述步驟(2)獲得多杯卵液中的每杯卵液，選擇發(fā)育良好的多杯卵液進(jìn)行合并，卵子懸浮液以90 μπι篩絹過濾去除組織碎片，以30 μπι篩絹清洗3次，收集卵子，置入塑料燒杯備用； (4)精液選擇及處理；鏡檢上述步驟(2)獲得多杯精液中的每杯精液，選取活力良好的一杯，用30μπι篩絹濾除組織碎片，作為備用精子； (5)同步受精，鏡檢及分組；取上述備用精子加入到上述步驟(3)的卵子懸浮液中，精卵比為3:1-5:1，然后將受精卵分成處理組和對(duì)照組； (6)在處理組的受精卵中加入細(xì)胞松弛素B;觀察對(duì)照組受精卵出現(xiàn)第一極體的比例達(dá)到總卵數(shù)的80%時(shí)，迅速向處理組加入細(xì)胞松弛素B至終濃度為0.5mg/L ； (7)去除受精卵溶液中的細(xì)胞松弛素B及孵化；觀察對(duì)照組中80%至90%的第一極體下方出現(xiàn)第二極體時(shí)，以30 μπι篩絹洗卵，砂濾海水清洗，去除細(xì)胞松弛素B，然后孵化發(fā)育至擔(dān)輪幼蟲或D形幼蟲。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于菲律賓蛤仔的三倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，其特征在于:所述步驟(I)中親貝為3齡蛤仔，殼長(zhǎng)大于40_。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于菲律賓蛤仔的三倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，其特征在于:所述步驟(2)中的砂濾海水為經(jīng)紫外線照射處理30min至60min的砂濾海水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于菲律賓蛤仔的三倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，其特征在于:所述步驟(3)中發(fā)育良好的卵液為卵子的卵膜完整、規(guī)格一致、形狀呈規(guī)則球形、分散度良好；所述步驟(4)中活力良好的精子是指鏡下檢查，大于90%的精子具有正?；顒?dòng)能力，且分散度良好。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于菲律賓蛤仔的三倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，其特征在于:所述步驟(6)加入的細(xì)胞松弛素B具體配制方法為:將細(xì)胞松弛素B溶于二甲基亞砜，配制成0.5mg/mL的溶液，然后加入到受精卵溶液中，至體積比1:1000。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于菲律賓蛤仔的三倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，其特征在于:所述步驟(6)中的觀察具體為，取受精卵懸浮液I滴滴于載玻片上，輕彈載玻片使極體轉(zhuǎn)至卵球側(cè)面，然后進(jìn)行觀察。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于菲律賓蛤仔的三倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，其特征在于:所述步驟⑵中的孵化密度為10-30粒/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于菲律賓蛤仔的三倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，其特征在于:所述步驟(7)中發(fā)育至擔(dān)輪幼蟲或D形幼蟲是通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于菲律賓蛤仔的三倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，其特征在于:所有所述的砂濾海水的溫度為23-26°C，鹽度為20-30。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種適用于菲律賓蛤仔的三倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，包括：(1)蛤仔親貝的選擇及促熟：(2)親貝處理及配子排放；(3)卵液選擇及處理；(4)精液選擇及處理；(5)同步受精，鏡檢及分組；(6)在處理組的受精卵中加入細(xì)胞松弛素B；(7)去除受精卵溶液中的細(xì)胞松弛素B及孵化，獲得三倍體菲律賓蛤仔胚胎。本發(fā)明利用菲律賓蛤仔受精卵的結(jié)構(gòu)和發(fā)育特點(diǎn)，采用單一個(gè)體催產(chǎn)，優(yōu)選精卵進(jìn)行受精，有效的消除了以往雙殼類三倍體誘導(dǎo)過程中混合精卵發(fā)育同步性差的缺陷，有效提高了三倍體誘導(dǎo)率。本發(fā)明適用于高效誘導(dǎo)菲律賓蛤仔三倍體，具有誘導(dǎo)率高、穩(wěn)定性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，誘導(dǎo)率穩(wěn)定在85％以上。
【IPC分類】A01K61-00
【公開號(hào)】CN104855321
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510313227
【發(fā)明人】李永仁, 邢克智, 郭永軍
【申請(qǐng)人】天津農(nóng)學(xué)院
【公開日】2015年8月26日
【申請(qǐng)日】2015年6月10日