降低植物中根結(jié)線蟲侵害的方法
【專利說明】
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2011年10月24日、申請(qǐng)?zhí)枮?01180051656. 0、發(fā)明名稱為"色 桿菌生物活性成份與代謝物"的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明公開了用于防治有害生物的源自色桿菌屬（Chromobacterium)的生物活 性成分和代謝物，特別是Chromobacteriumsubstugae培養(yǎng)物，以及它們用于防治有害生物 (pest)的方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 天然產(chǎn)物是由微生物、植物和其它生物產(chǎn)生的物質(zhì)。微生物天然產(chǎn)物提供了豐富 的化學(xué)多樣性來源，并且將天然產(chǎn)物用于醫(yī)藥目的已有悠久的歷史。雖然著重于用于人類 治療的天然產(chǎn)物（其中50%以上來自天然產(chǎn)物），但僅有11 %的農(nóng)藥來自天然來源。然 而，天然產(chǎn)物農(nóng)藥可能在傳統(tǒng)農(nóng)場(chǎng)和有機(jī)農(nóng)場(chǎng)中發(fā)揮防治有害生物的重要作用。微生物 (細(xì)菌、放線菌和真菌）產(chǎn)生的次生代謝物提供新化合物，其可單獨(dú)使用或與已知化合物聯(lián) 合使用，以有效防治昆蟲類有害生物并減少產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)。有許多公知的成功用作農(nóng) 業(yè)殺蟲劑的微生物天然產(chǎn)物的實(shí)例（Thompson等人，2000 ;Arena等人，1995 ;Krieg等人 1983)〇
[0004] 微生物農(nóng)藥的開發(fā)始于純培養(yǎng)物中微生物的分離。然后，使用體外試驗(yàn)、體內(nèi)試驗(yàn) 或在溫室或田野中的中試規(guī)模試驗(yàn)有效進(jìn)行波譜篩選。同時(shí)，對(duì)微生物產(chǎn)生的活性化合物 進(jìn)行分離和鑒定。對(duì)于微生物農(nóng)藥的商品化，需通過在工業(yè)規(guī)模下發(fā)酵以經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)微生 物，并與生物相容且批準(zhǔn)的添加劑配制以提高藥效并將在田野條件下的施用容易性和儲(chǔ)存 穩(wěn)定性增至最大。
[0005] 隨著農(nóng)民期待擴(kuò)大他們的殺蟲劑范圍并隨著在市場(chǎng)上出現(xiàn)新的微生物產(chǎn)品， 在新舊殺蟲劑間存在各種相互作用的可能性。目前經(jīng)常使用2種或更多種殺蟲劑的組 合，將其同時(shí)或按序施加到單一作物上。為解決這些問題，科學(xué)家已使用外用和飼喂 的方法來檢驗(yàn)油類農(nóng)藥、真菌農(nóng)藥和化學(xué)農(nóng)藥對(duì)有害生物和益蟲的相互作用（例如參見 Chalvet-Monfray，Sabatier等人；Meunier，Carubel等人 1999;Hummelbrunner和Isman 2001 ;Wirth，Jiannino等人 2004 ;Farenhorst，Knols等人 2010 ;Shapiro_Ilan，Cottrell 等人2011等）。但目前尚未對(duì)所有的相互作用進(jìn)行研究。
[0006] 色桿菌屬
[0007] 0 -色桿菌菌株（即Chromobacteriumsubstugae)對(duì)許多昆蟲表現(xiàn)出殺蟲活 性（Martin，Blackburn等人 2004;Martin2004 ;Martin，Gundersen-Rindal等人 2007 ; Martin，Hirose等人2007 ;Martin，Shropshire等人2007)。作用模式表現(xiàn)為拒食素 和毒素活性的結(jié)合，在亞致死劑量下觀察到飼喂抑制（feedinginhibition) (Martin， Gundersen-Rindal等人 2007)。具體而言，已發(fā)現(xiàn)Chromobacteriumsubstugae有效防 治科羅拉多馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsedecemlineata)成蟲、西部玉米根蟲（Diabrotica virgifera)成蟲、南方玉米根蟲（Diabroticaundecimpunctata)成蟲和幼蟲、小蜂房甲 蟲（Aethinatumida)幼蟲、小菜蛾（Plutellaxyllostella)幼蟲、甘薯粉虱（Bernisia tabaci)成蟲和幼蟲以及南綠椿象（Nezaraviridula)成蟲。
[0008] 自Martin及其同事發(fā)現(xiàn)Chromobacteriumsubstugae以來，至少已分離和表征 出三個(gè)色桿菌的新物種；Young等人（2008)自臺(tái)灣泉水樣本中分離出一個(gè)新的色桿菌物種 (C.aquaticum)，而Kampfer等人（2009)也自馬來西亞收集的環(huán)境樣本中分離出二個(gè)物種 (C.piscinae和C.pseudoviolaceum)〇
[0009] 色桿菌屬的次生代謝物
[0010] 在所有已知的色桿菌物種中，對(duì)于紫色色桿菌（C.violaceum)有最多的研 究，關(guān)于色桿菌產(chǎn)生的次生代謝物的公布信息僅基于對(duì)紫色色桿菌的研究。Dimin和 Menck(2001)已就紫色色桿菌（來自土壤和水中的革蘭陰性腐生生物）的藥理和工業(yè)前 景發(fā)表了綜述。此物種通常被認(rèn)為對(duì)人類無致病性，但作為機(jī)會(huì)致病菌，其偶而在人類和 動(dòng)物中成為敗血癥和致命感染的病原體。已知紫色色桿菌產(chǎn)生一種紫色色素（紫色桿菌 素），其是通過在氧的存在下使2個(gè)L-色氨酸分子稠和而生成（Hoshino等人，1987;Ryan 和Drennan;2009)。紫色桿菌素的生物合成受到群體感應(yīng)（quorum-sensing)的調(diào)節(jié)，所 述群體感應(yīng)是一種在革蘭氏陰性菌中調(diào)節(jié)各種其它次級(jí)代謝途徑的常見機(jī)制（McClean等 人，1997)。
[0011] 由Durdn和Menck(2001)總結(jié)的紫色色桿菌的其它已知代謝物包括氫氰酸、 (高）鐵氧胺E(ferrioxamineB)、B_ 丙氨酸糖肽（B-lactamicglycopeptides)SQ28， 504 和SQ28, 546、抗生素（如aerocyanidin、aerocavin、3,6_ 二羥基 _1，2_ 苯異唑（3， 6-dihydroxy-l，2_indoxazene)和單酰胺菌素SB-26. 180)和抗腫瘤縮酸酸肽FR901228。依 據(jù)Durdn和Menck(2001)的綜述文章，紫色色桿菌也產(chǎn)生不尋常的糖化合物，如胞外多糖和 脂多糖。
[0012] 線蟲和殺線蟲劑
[0013] 線蟲是不分節(jié)兩側(cè)對(duì)稱的蠕蟲狀無脊椎動(dòng)物，其具有體腔和完整的消化系統(tǒng)，但 無呼吸和循環(huán)系統(tǒng)。其體壁由多層的角質(zhì)層、具有四條縱線的皮下組織和內(nèi)部肌肉組織組 成（Chitwood，2003)。其身體大部份為消化和生殖系統(tǒng)。大部分的線蟲可自由生活，但有少 數(shù)物種是動(dòng)物或植物的遍在寄生蟲。
[0014] 根結(jié)線蟲（Meloidogynespp.)寄生于許多的一年生和多年生作物中，同時(shí)影響市 場(chǎng)收率的產(chǎn)量和品質(zhì)。該屬的線蟲被認(rèn)為是最具經(jīng)濟(jì)重要性的植物寄生線蟲（Whitehead， 1998)。植物寄生線蟲每年造成的作物損失估計(jì)超過1000億美元（Koenning等人1999)，超 過一半是根結(jié)線蟲屬造成的。該品系的接種物來自蟲卵，其在有利條件下孵化以釋出感染 性第二階段幼蟲（J2S)，所述幼蟲在土壤中迀移到宿主植物的根上。藉由根尖滲透而發(fā)生感 染，然后幼蟲移至維管組織（線蟲在該處常駐），直接自植物細(xì)胞中得到養(yǎng)分。植物因而產(chǎn) 生形成蟲癭（根節(jié)）的巨細(xì)胞。在整個(gè)生殖階段（reproductivelife)中，雌蟲保持埋入 植物組織中，只有蟲卵自根中伸出。
[0015] 防治根結(jié)線蟲最有效的方法是使用抑制蟲卵孵化、幼蟲活動(dòng)和/或植物感染性的 殺線蟲劑。因?yàn)橐韵颅h(huán)境和生理上的原因，開發(fā)化學(xué)防治植物寄生線蟲的農(nóng)藥是具有挑戰(zhàn) 性的工作：1.大部份植物寄生性線蟲生活在靠近根部的土壤的狹窄區(qū)域中，從而難以遞送 化學(xué)殺線蟲劑。2.線蟲的外表面是不良生化靶，無法滲透到許多有機(jī)分子中（Chitwood， 2003)。此外，口服遞送有毒化合物是幾乎不可能的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)植物寄生線蟲物種在其侵 入和感染植物根系后才攝取宿主養(yǎng)分。因此，殺線蟲劑往往是具有高揮發(fā)性或具有促進(jìn)它 們?cè)谕寥乐械牧鲃?dòng)性的其它化學(xué)和物理性質(zhì)的廣譜毒素。
[0016] 在過去十年中，鹵代烴（如二溴乙烯、溴甲烷）是世界各地使用最頻繁的殺線蟲 劑。因?yàn)樗鼈兙哂腥梭w高毒性且對(duì)平流臭氧層具有有害作用，因而在蒙特利爾公約中已禁 止使用這些化合物，但因?yàn)槿狈μ娲?，所以仍可使用溴甲烷用于防治線蟲和植物病原體。 隨著有機(jī)磷的使用，氨基甲酸酯是最有效的非熏蒸類殺線蟲劑。可惜的是，大部分氨基甲酸 酯如涕滅威和殺線威等也屬劇毒物。2010年8月，涕滅威的制造商拜耳公司已同意取消在 美國馬鈴薯和柑橘中的所有產(chǎn)品注冊(cè)，而在2018年8月底時(shí)，涕滅威將徹底淘汰。近日，阿 維菌素（由阿維鏈霉菌（Streptomycesavermitilis)產(chǎn)生的兩種除蟲菌素的混合物）已 注冊(cè)用于殺線蟲用途（Faske和Starr，2006)。Syngenta公司將該活性成分以Avictal:商標(biāo) 名投放到市場(chǎng)中，作為棉花和蔬菜的種子處理劑。
[0017] 據(jù)報(bào)導(dǎo)有些微生物植物/線蟲病原體對(duì)植物寄生線蟲具有活性（Guerena2006)。 這些生物防治劑包括以下細(xì)菌：蘇云金芽孢桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia)、穿刺巴氏菌（Pasteuriapenetrans)和P.usgae。PasteuriaBiosciences已 開始在美國南部使用P.usgae來防治草地線蟲（stingnematodes)。殺線蟲真菌包括木 霉菌(Trichodermaharzianum)、線蟲寄生菌(Hirsutellarhossiliensis)、食線蟲真 菌（H.minnesotensis)、厚垣輪枝抱菌（Verticilliumchlamydosporium)、線蟲捕捉菌 (Arthrobotrysdactyloides)和淡紫擬青霉（Paecilomyceslilanicus) (Prophyta公司的 產(chǎn)品名稱為BioAct?和.瓶e.lGOn?)。另一種真菌疏孢漆斑菌（Myrotheciumverrucaria) 可用于商業(yè)制劑（ValentBiosciences公司的DiTera"產(chǎn)品）。這是殺線蟲真菌，由于殺線 蟲化合物而具有活性。其它市售的生物殺線蟲劑包括;Deny?和；BiueGircW? (B. c^acia)、 Activate^1(Bacilluschitinosporus) (Quarles，2005)和以色列的產(chǎn)品BioNem? (Bacillusfirmus)(目前由拜耳公司以種子處理劑V〇tiv〇K銷售）（Terefe等人2009)。 據(jù)假定，微生物分離物對(duì)線蟲蟲卵孵化、幼蟲活動(dòng)和感染性的有害作用可歸因于這些生 物體產(chǎn)生的毒素（Hallman和Sikora，1996;Marrone等人，1998;Siddiqui和Mahmood， 1999;Saxena等人，2000;Meyer和Roberts，2002)寄生或甚至撲殺線蟲（Siddiqui和 Mahmood，1996 ;Kerry，2001 ;Jaffee和Muldoon，1995)、引發(fā)系統(tǒng)抵抗作用（Hasky-Gunther 等人1998)、改變線蟲行為（Sikora和HofTman-Hergarte;r，1993)或干擾植物識(shí)別功能 (Oostendorp和Sikora，1990)的能力。
[0018] 植物殺線蟲劑如植物提取物和精油可用于防治線蟲（Kokalis-Burre11e和 Rodriguez-Kabana，2006)。Chitwood在其最近的綜述文章中總結(jié)了利用源自植物的 化合物防治線蟲的選擇（Chitwood，2002)。Siddiqui和Alam(2001)證明，用印楝樹 (Azadirachtaindica)和苦楝樹（Meliaazadirah)的植物部分改造的盆栽土壤抑制番 茄的根結(jié)線蟲產(chǎn)生。但目前在美國沒有印楝產(chǎn)品注冊(cè)用于防治線蟲。基于含皂苷的皂樹 (Quillajasaponaria)提取物（在C-3處被三糖取代并在C-28處被寡糖取代的皂樹酸 的bidesmosidic衍生物）的來自智利的新植物產(chǎn)品(NEMA-QK)最近已經(jīng)美國環(huán)保署 注冊(cè)為有機(jī)殺線蟲劑，并由有機(jī)物質(zhì)檢查委員會(huì)（OMRI)登錄用于有機(jī)農(nóng)業(yè)。經(jīng)Monterey AgResources市售。
[0019] 通常對(duì)非宿主作物的輪作本身足以防止線蟲種群達(dá)到經(jīng)濟(jì)損害水平（Guerena 2006)。信息素（allelochemicals)是影響植物環(huán)境中的生物行為的由植物產(chǎn)生的化合物。 殺線蟲信息素包括polythienyls、硫配糖體（glucisonolates)、生物堿、脂質(zhì)、砲類、甾體、 三砲類和酸類化合物（5^〇1^118-13111^6116和1?〇(11'181162-1(&匕&仙，2006;〇1；^￥〇〇(1，2002)。當(dāng) 成長為覆蓋作物時(shí)，來自化感植物（allelopathicplant)的生物活性化合物在生長期中滲 出和/或在生物質(zhì)分解過程中釋出到土壤中。蕓苔屬作物可用于生物熏蒸，所述生物熏蒸 是基于在分解土壤摻入組織（soil-incorporatedtissue)過程中釋放殺生物揮發(fā)物的有 害生物防治策略（Kirkegaard和Sarwar，1998)。但Roubtsova等人（2007)在綠花椰菜腐 敗組織對(duì)南方根結(jié)線蟲數(shù)量的影響的研究中指出為了適當(dāng)防治，需徹底混合植物組織與完 全被線蟲感染的土壤體積。
[0020] 在農(nóng)業(yè)土壤中的線蟲防治的未來有賴于兩個(gè)因素：培育抗線蟲作物和發(fā)現(xiàn)并開發(fā) 新的廣譜低毒殺線蟲劑。研究、開發(fā)和注冊(cè)新的化學(xué)殺線蟲劑的成本非常高（超過2億美 元），從而限制了它們的開發(fā)。從1967-1997年中，在497種注冊(cè)用作農(nóng)藥的新活性成份 中，只有7個(gè)注冊(cè)為殺線蟲劑（Aspelin和Grube，1999)。除了傳統(tǒng)的化學(xué)方法外，也建議 使用RNA干擾（RNAi)作為防治線蟲的方法。藉由RNAi的基因沉默作用最初被證明用于 秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans)，而最近也被證明用于植物寄生線蟲如根結(jié)線蟲 (Bakhetia等人2005)。為了降低植物寄生線蟲造成的顯著經(jīng)濟(jì)損失以及降低目前注冊(cè) 用于線蟲防治的有毒化合物的使用，尋找用作生物殺線蟲劑的新的微生物株成為重要的目 標(biāo)。
[0021] 根據(jù)Sasser和Freckman(1987年）的研究，線蟲對(duì)世界各地的主要作物造成的作 物損失為8%至20%。植物寄生線蟲可導(dǎo)致相當(dāng)大的作物損失，估計(jì)全球每年損失約870 億美元（Dong和Zhang，2006)?？咕€蟲作物物種和化學(xué)殺線蟲劑是目前線蟲防治的主要 選擇。諸如溴甲烷的熏蒸劑對(duì)防治土壤傳播的植物病害和線蟲非常有效，但因?yàn)閷?duì)哺乳動(dòng) 物具有高毒性、臭氧耗減效應(yīng)和其它殘留效應(yīng)，許多國家已禁止使用溴甲烷，并經(jīng)國際協(xié)商 計(jì)劃將其完全撤出市場(chǎng)（Oka等人，2000)?；瘜W(xué)替代品如碘甲烷、1，3-二氯丙烯和氯化苦 (cholorpicrin)對(duì)哺乳動(dòng)物和環(huán)境也有安全上的問題。目前正逐漸淘汰和禁用化學(xué)非熏蒸 殺線蟲劑。最近，美國環(huán)保署宣布將淘汰涕滅威。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0022] 本文提供新用途和新組合，具體提供包含色桿菌屬物種的菌株，特別是 Chromobacteriumsubstugae的菌株，更特別是色桿菌新物種（Chromobacterium substugaesp.Nov.)的菌株，甚至更特別是與美國專利7, 244, 607中所述的NRRLB-30655 具有相同特征的色桿菌新物種的菌株的組合物。
[0023] 由此，本文提供調(diào)節(jié)植物中的線蟲侵害的方法，其包括向植物和/或其種子和/或 用于使所述植物生長的基質(zhì)施用有效調(diào)節(jié)所述線蟲侵害的量的以下物質(zhì)：色桿菌屬物種的 菌株（特別是Chromobacteriumsubstugae的菌株，更特別是色桿菌新物種的菌株，甚至更 特別是與美國專利7, 244, 607中所述的NRRLB-30655具有相同特征的色桿菌新物種的菌 株）的上清液、濾液和/或提取物，和/或所述上清液、濾液和/或提取物的一種或多種代 謝物，以及任選存在的另一種殺線蟲物質(zhì)。
[0024] 本發(fā)明也提供對(duì)至少一種有害生物具有協(xié)同作用的農(nóng)藥組合，其包含作為活性成 份的以下物質(zhì)：（a)色桿菌屬物種的菌株（特別是Chromobacteriumsubstugae的菌株，更 特別是色桿菌新物種的菌株，甚至