冷誘導(dǎo)甜味降低的馬鈴薯的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年12月12日提交的美國(guó)專(zhuān)利臨時(shí)申請(qǐng)61/745, 003號(hào)的優(yōu)先權(quán)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本文提供產(chǎn)生冷誘導(dǎo)甜味降低的土豆變種的材料和方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 土豆（馬鈴薯（Solanum tuberosum))是重要的食品作物，2011年全球產(chǎn)量預(yù)計(jì) 為324百萬(wàn)公噸（聯(lián)合國(guó)食品與農(nóng)業(yè)組織（FA0STAT))，2010作物生產(chǎn)數(shù)據(jù)，faostat. fao. org/site/567/DesktopDefault. aspx ? PagelD = 567#ancor)。總馬鈴薯作物中的大部分 (美國(guó)2010年作物的61% )加工生產(chǎn)為薯片、油炸薯?xiàng)l和其他加工產(chǎn)品。為了給加工產(chǎn)業(yè) 提供全年的高質(zhì)量未處理馬鈴薯，需要在使用前對(duì)馬鈴薯根莖進(jìn)行'冷儲(chǔ)存'。冷儲(chǔ)存具有 品種/處理器特異性，其溫度范圍從:TC _13°C不等，可以?xún)?chǔ)存多至12個(gè)月，能夠防止萌芽、 降低收縮/衰老造成的損失、并使疾病傳播最小化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本文提供產(chǎn)生冷誘導(dǎo)甜味（CIS)降低的土豆變種的材料和方法，冷誘導(dǎo)甜味是冷 儲(chǔ)存期間淀粉轉(zhuǎn)變?yōu)楹?jiǎn)單還原糖、葡萄糖和果糖的現(xiàn)象。高溫處理后，葡萄糖/果糖會(huì)在美 拉德反應(yīng)中與游離氨基酸接觸，產(chǎn)生苦味、深色素產(chǎn)品，其可能含有高水平的丙烯酰胺一疑 似細(xì)胞毒素/致癌物質(zhì)。提供CIS降低的馬鈴薯變種。
[0006] 本文至少部分基于下述發(fā)現(xiàn)：可通過(guò)使用序列特異的核酸酶在液泡轉(zhuǎn)化酶 (VInv)基因中產(chǎn)生靶向突變或敲除來(lái)獲得具有低CIS的馬鈴薯。相比冷儲(chǔ)存后油炸的非改 造馬鈴薯中丙烯酰胺的水平，改造的馬鈴薯在油炸后可具有改良的儲(chǔ)存特性和低水平的丙 烯酰胺。此外，該馬鈴薯不攜帶任何外源DNA，所以監(jiān)管機(jī)構(gòu)會(huì)將其認(rèn)定為非GM。本文還至 少部分基于由序列特異核酸酶產(chǎn)生的具有功能缺失型VInv突變的馬鈴薯品種的開(kāi)發(fā)。
[0007] 在一個(gè)方面，本發(fā)明包括一種茄屬（Solanum)植物、植物部分或植物細(xì)胞，其中所 述植物、植物部分或植物細(xì)胞的內(nèi)源的至少兩個(gè)VInv等位基因中包含突變，從而所述植 物、植物部分或植物細(xì)胞的液泡轉(zhuǎn)化酶的表達(dá)相對(duì)沒(méi)有所述突變的對(duì)照茄屬植物、植物部 分或植物細(xì)胞降低。各突變可以是多于一個(gè)核苷酸堿基對(duì)的缺失。各突變可位于SEQ ID NO:27所示的靶序列或位于與SEQ ID NO:27具有至少95%相同性的靶序列；或者位于SEQ ID NO: 1所示的靶序列或位于與SEQ ID NO: 1具有至少95%相同性的靶序列。所述植物、植 物部分或植物細(xì)胞可用稀有切割內(nèi)切核酸酶制備（例如轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子內(nèi)切核酸 酶（TALE-核酸酶））。TALE-核酸酶可結(jié)合至SEQ ID N0:18-23中任一項(xiàng)所列序列。所述 至少兩個(gè)VInv等位基因各表現(xiàn)為移除內(nèi)源核酸并且不包含任何外源核酸。每個(gè)內(nèi)源VInv 等位基因都可突變。各VInv等位基因表現(xiàn)為移除內(nèi)源核酸并且不包含任何外源核酸。所 述植物、植物部分或植物細(xì)胞中可檢測(cè)不到的液泡轉(zhuǎn)化酶的表達(dá)。所述茄屬植物、植物部分 或植物細(xì)胞，其中可為馬鈴薯植物、植物部分或植物細(xì)胞。所述植物、植物部分或植物細(xì)胞 可經(jīng)過(guò)冷儲(chǔ)存條件。所述植物、植物部分或植物細(xì)胞的丙烯酰胺水平相對(duì)沒(méi)有所述突變的 對(duì)照植物、植物部分或植物細(xì)胞降低。
[0008] 在另一方面，本發(fā)明包括制備冷誘導(dǎo)甜味降低的茄屬植物的方法。所述方法包括 (a)使含功能性VInv等位基因的茄屬植物細(xì)胞群接觸靶向內(nèi)源VInv序列的稀有切割內(nèi)切 核酸酶，（b)從所述群中選擇至少兩個(gè)VInv等位基因已失活的細(xì)胞，和（c)使所選植物細(xì) 胞生長(zhǎng)為茄屬植物，其中所述茄屬植物的冷誘導(dǎo)甜味相對(duì)所述VInv等位基因未失活的對(duì) 照茄屬植物降低。該茄屬植物細(xì)胞可以是原生質(zhì)體。該方法可包括用編碼所述稀有切割內(nèi) 切核酸酶的核酸轉(zhuǎn)化所述原生質(zhì)體。所述核酸可為mRNA。所述核酸可包含在載體內(nèi)。該 方法可包括向所述原生質(zhì)體內(nèi)導(dǎo)入稀有切割內(nèi)切核酸酶。所述稀有切割內(nèi)切核酸酶可為 TALE-核酸酶。所述TALE-核酸酶可靶向SEQ ID N0:27所示的序列或靶向與SEQ ID N0:27 具有至少95%相同性的序列，或者可靶向SEQ ID NO: 1所示的序列或靶向與SEQ ID NO: 1 具有至少95%相同性的序列。TALE-核酸酶可結(jié)合至SEQ ID NO: 18-23中任一項(xiàng)所列序列。 該方法還可包括培養(yǎng)所述原生質(zhì)體以生成植物株系。所述方法可包括從所述原生質(zhì)體分離 含至少部分VInv基因座的基因組DNA。該茄屬植物細(xì)胞可以是馬鈴薯植物細(xì)胞。
[0009] 在另一個(gè)方面，本文涉及一種生成食品產(chǎn)品的方法。所述方法可包括（a)提供茄 屬植物或植物部分，其（i)在所述植物或植物部分的內(nèi)源的至少兩個(gè)VInv等位基因中包含 突變，從而所述植物、植物部分或植物細(xì)胞的液泡轉(zhuǎn)化酶的表達(dá)相對(duì)沒(méi)有所述突變的對(duì)照 茄屬植物或植物部分降低，并且（ii)經(jīng)過(guò)低溫儲(chǔ)存；和（b)從所述植物或植物部分生成食 品產(chǎn)品。所述方法還可包括（c)烹飪所述植物或植物部分以獲得食品產(chǎn)品，該食品產(chǎn)品的 丙烯酰胺水平相對(duì)不含所述突變并且在烹飪前經(jīng)過(guò)冷誘導(dǎo)儲(chǔ)存的對(duì)照烹飪植物或植物部 分生成的食品產(chǎn)品降低。所述烹飪植物或植物部分與烹飪前未經(jīng)冷儲(chǔ)存的烹飪茄屬植物或 植物部分具有約相同的丙烯酰胺水平。各突變可位于SEQ ID N0:27所示的靶序列或位于 與SEQ ID N0:27具有至少95%相同性的靶序列；或者位于SEQ ID N0:1所示的靶序列或 位于與SEQ ID N0:1具有至少95%相同性的靶序列。各突變可用稀有切割內(nèi)切核酸酶制備 (例如TALE-核酸酶）。TALE-核酸酶可結(jié)合至SEQ ID N0:18-23中任一項(xiàng)所列序列。所述 茄屬植物或植物部分可為馬鈴薯植物或植物部分。所述茄植物或植物部分中可檢測(cè)不到的 液泡轉(zhuǎn)化酶的表達(dá)。
[0010] 本發(fā)明另一方面包括一種從前屬植物或植物部分生成的食品產(chǎn)品，所述前屬植物 或植物部分（i)在所述植物或植物部分的內(nèi)源的各VInv等位基因中包含突變，從而所述植 物、植物部分或植物細(xì)胞沒(méi)有功能性VInv等位基因，并且（ii)經(jīng)過(guò)低溫儲(chǔ)存。各突變可位 于SEQ ID N0:27所示的靶序列或位于與SEQ ID N0:27具有至少95%相同性的靶序列；或 者位于SEQ ID NO: 1所示的靶序列或位于與SEQ ID NO: 1具有至少95%相同性的靶序列。 各突變可用稀有切割內(nèi)切核酸酶制備（例如TALE-核酸酶）。TALE-核酸酶可結(jié)合至SEQ ID N0:18-23中任一項(xiàng)所列序列。所述食品產(chǎn)品可已烹飪。所述食品產(chǎn)品的丙烯酰胺水平 可相對(duì)不含所述突變并且在烹飪前經(jīng)過(guò)冷儲(chǔ)存的對(duì)照植物或植物部分制備的烹飪食品產(chǎn) 品降低，所述對(duì)照植物或植物部分。所述烹飪食品產(chǎn)品可與未經(jīng)冷儲(chǔ)存的茄屬植物或植物 部分具有約相同的丙烯酰胺水平。所述茄屬植物或植物部分可為馬鈴薯植物或植物部分 (例如來(lái)自選自Ranger Russet、Atlantic和Burbank的品種）。所述食品產(chǎn)品可為薯片或 油炸薯?xiàng)l。
[0011] 除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的意義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技 術(shù)人員通常所理解的相同。雖然與本文所述類(lèi)似或等同的方法和材料可用來(lái)實(shí)施本發(fā)明， 但在下文描述合適的方法和材料。本文中述及的所有出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利和其他參考文 獻(xiàn)都通過(guò)引用全文納入本文。在抵觸的情況下，以本說(shuō)明書(shū)（包括定義在內(nèi)）為準(zhǔn)。此外， 材料、方法和實(shí)施例都僅是說(shuō)明性的，并不意在構(gòu)成限制。
[0012] 在附圖和以下描述中詳細(xì)說(shuō)明了本發(fā)明的一種或多種實(shí)施方式。本發(fā)明的其他特 征、目的和優(yōu)勢(shì)通過(guò)描述、附圖以及權(quán)利要求書(shū)將是顯而易見(jiàn)的。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1顯示VInv TALE內(nèi)切核酸酶的靶位點(diǎn)。顯示VInv基因的DNA序列（SEQ ID NO: 1)。下劃線序列代表TALE-核酸識(shí)別VInv基因的靶序列（SEQ ID NOS: 18-23)。
[0014] 圖2顯示VInv基因中TALE核酸酶誘導(dǎo)的突變的示例。各圖上部的線顯示VInv TALE-核酸酶的識(shí)別位置的DNA序列（下劃線）。其他序列顯示由不精確的非同源末端連 接（NHEJ)誘導(dǎo)的代表性突變。右側(cè)顯示缺失的大小。
[0015] 圖3顯示"Ranger Russet"品種的VInv 2基因座的示例性等位基因，其為開(kāi)發(fā)突 變植物的種質(zhì)。區(qū)分等位基因類(lèi)型的診斷性單核苷酸多態(tài)性（SNP)以下劃線和粗體顯示。
[0016] 圖4顯示再生突變"Ranger Russet"植物的示例性缺失概況。TALE核酸識(shí)別位點(diǎn) 以下劃線表示，SNP位點(diǎn)以陰影表示。
[0017] 發(fā)明詳述
[0018] 馬鈴薯基因組包含小的酶家族稱(chēng)為轉(zhuǎn)化酶，其在調(diào)節(jié)源組織（葉片）和庫(kù)組織 (塊莖、果實(shí)、種子）之間的碳分配中有重要作用。該酶不可逆地催化淀粉一蔗糖一葡萄糖 /果糖反應(yīng)。植物具有三類(lèi)轉(zhuǎn)化酶，但據(jù)信液泡轉(zhuǎn)化酶（VInv)在CIS中有重要作用。
[0019] 本文提供馬鈴薯植物品種，具體為VInv活性降低或喪失的馬鈴薯（S. tuberosum) 種。還提供產(chǎn)生此類(lèi)植物品種的方法、用此類(lèi)植物品種生產(chǎn)食品產(chǎn)品的方法、和從此類(lèi)植物